專利名稱：離體培養(yǎng)除蟲菊再生植株的方法及專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種離體培養(yǎng)除蟲菊再生植株的方法及專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
除蟲菊為菊科多年生宿根草本植物。全株呈灰白淡綠色，葉羽狀全裂，花莖多數(shù)，頂生頭狀花序，夏 秋時節(jié)開花?；ò咨?，全花有特異芳香，可用于布置花壇、花境，也可作切花。除蟲菊還是一種古老的天 然殺蟲植物，由其花中分離萃取的具有殺蟲活性的六種化合物(BSI命名為除蟲菊酯i、除蟲菊酯n，
瓜菊酯i 、瓜菊酯n 、茉莉菊酯i、茉莉菊酯n)統(tǒng)稱為除蟲菊酯。天然除蟲菊酯見光慢慢分解成水和 co2，因此，用其配制的農(nóng)藥或衛(wèi)生殺蟲劑等使用后無殘留、對人畜無副作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的不污染環(huán)境、 對哺乳動物及植物無毒無害、對昆蟲和蚊蠅等迅速擊倒、不易產(chǎn)生抗藥性的國際公認(rèn)的最安全的無公害天 然殺蟲劑。
除蟲菊作為目前世界上唯一集約化栽培的殺蟲植物，己成為厄瓜多爾、肯尼亞等國的支柱產(chǎn)業(yè)；澳大 利亞也在大力發(fā)展除蟲菊產(chǎn)業(yè)。近年來，隨著人類對自身健康及生存環(huán)境的不斷關(guān)注，天然除蟲菊酯產(chǎn)品 雖然成本較高，但卻供不應(yīng)求。目前，天然除蟲菊酯主要從除蟲菊干花中提取，但其含量并不高，且由于 近幾年世界范圍內(nèi)除蟲菊花市場供應(yīng)短缺，造成其市場價格上揚(yáng)，難以滿足市場需求。因此，通過不同途
徑培育除蟲菊酯含量高的除蟲菊新品種， 一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
以提高除蟲菊酯含量為主要目標(biāo)的除蟲菊育種途徑主要有傳統(tǒng)育種方式和轉(zhuǎn)基因途徑。在過去的30 年間，利用常規(guī)育種方法，例如三倍體或多倍體的誘導(dǎo)、雜種優(yōu)勢、雜交和無性系選擇等，除蟲菊酯的干 重含量己有所提高，但含量仍然很低。傳統(tǒng)的育種方法雖然取得了不少的成果，但存在著很大的局限性。 而利用植物基因工程技術(shù)將目的基因定向?qū)胫参锛?xì)胞或組織中，培育成植株，則可獲得人們預(yù)期的新品 種，為花卉的定向育種提供技術(shù)支持。
在植物遺傳轉(zhuǎn)化中，高頻再生系統(tǒng)是必不可少的，它是決定遺傳轉(zhuǎn)化成敗的關(guān)鍵。所謂高頻再生系統(tǒng)
必須具有四個條件l)外植體的組織細(xì)胞具有再生愈傷組織和完整植株的能力，而且最好是外植體能夠直 接分化出芽；2)芽的分化率達(dá)90%以上；3)易于離體培養(yǎng)，具有高度可重復(fù)性；4)體細(xì)胞無性系變異小。 國內(nèi)對離體條件下除蟲菊的研究多集中在其快速繁殖上。曾有報道除蟲菊最適快繁培養(yǎng)基為MS基本 培養(yǎng)基+6_芐氨基嘌呤(或稱為6-芐基腺嘌呤，簡稱6-BA) 0.3 mg/ L +萘乙酸(NM) 0.2mg/ L ，其 生根培養(yǎng)基的成分為1/2 MS基本培養(yǎng)基+吲哚乙酸(簡稱IAA，下同)0.2 mg/ L + ABT生根粉(中國林 業(yè)科學(xué)院研制的植物生長調(diào)節(jié)劑，北京艾比蒂研發(fā)中心銷售，參見
http:〃麗.china-abt. cn/stencil/152/list一cn. asp Client—ID=720&Edition—ID=l&mid=4118) 0. 1 mg/ L;快繁培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+6-BA 2.0 mg/ L +萘乙酸0. 2-0. 3呢/ L '生根培養(yǎng)基為:MS基本培 養(yǎng)基+萘乙酸0.3 mg/ L 。也有一些研究了除蟲菊愈傷組織的誘導(dǎo)，如誘導(dǎo)愈傷組織最佳培養(yǎng)基是MS基 本培養(yǎng)基+激動素(6-糠氨基嘌呤，簡稱KT '下同)0.4 mg/ L +2,4-D 1.0 mg/ L;或是MS基本培養(yǎng) 基+KT 1. 6 rag/ L +2， 4—D 2. 0 mg/ L。
相比之下，國內(nèi)外在除蟲菊再生方面研究相對較少。國外有資料報道了幾個除蟲菊基因型誘導(dǎo)芽的培 養(yǎng)基，典型的如LS基本培養(yǎng)基+赤霉素(GA.O 3. 0呢/ L +6-BA 1. 0 mg/ L,或MS基本培養(yǎng)基+KT4. 0 mg/ L +6-BA0.3 mg/ L +IAA0.01 rag/ L，但其再生頻率較低,僅20-30%，且出芽時間長'需60-80d;或者有用花 頭、花瓣為外植體。但因材料有限、消毒復(fù)雜且取材時間受季節(jié)限制，不利于將該再生體系用于遺傳轉(zhuǎn)化的研究。因此建立適宜的除蟲菊高頻再生體系是其遺傳轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵步驟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種離體培養(yǎng)除蟲菊的植株再生方法及其專用培養(yǎng)基，本發(fā)明簡單易行，操作 方便，外植體取材方便，再生植株的再生速度較快，再生頻率高，可加快除蟲菊的分子育種研究和開發(fā)。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種離體培養(yǎng)除蟲菊再生植株的方法，其步驟包括
A、 以除蟲菊種子為離體培養(yǎng)的材料，先用70%酒精對除蟲菊種子進(jìn)行消毒，無菌水沖洗2-3遍，再用 0. 1%升汞繼續(xù)對除蟲菊種子進(jìn)行消毒，無菌水沖洗3-4遍后，將滅過菌的除蟲菊種子置于無菌濾紙上使之 萌發(fā)培育成無菌苗；選取4個來自不同種子培育的除蟲菊無菌苗接種于以MS基本培養(yǎng)基為成分的繼代培 養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)(每25-30天將培養(yǎng)無菌苗轉(zhuǎn)移到新鮮的MS基本培養(yǎng)基上)；
B、 在無菌條件下，以A步驟的4個單株的除蟲菊無菌苗為材料繼代培養(yǎng)30d后，切取頂端幼嫩的葉 片作為外植體，將其中脈用解剖刀劃兩刀后近軸面朝上接種于MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤2. 0 mg/L + 吲哚丁酸0. 2 mg/L+AgN032. Omg/L的專用培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)7天后再轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)15_30d，得到 除蟲菊再生芽；
C、 將步驟B獲得的除蟲菊再生芽切下接種于只添加MS基本培養(yǎng)基的繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，直 至得到完整的再生植株；
上述A、 B、 C各步驟所述的培養(yǎng)基均添加0. 7%瓊脂和3%蔗糖，補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的 pH至5. 8后于121'C高壓蒸汽滅菌20min，將所述的培養(yǎng)材料均置于24-26'C，光照時間為16h/d、光照強(qiáng) 度(簡稱光強(qiáng)，下同)為1200 lux的條件下培養(yǎng)。
其中步驟C所述的繼代培養(yǎng)基成分為MS基本培養(yǎng)基成分。
申請人發(fā)明了與上述培養(yǎng)方法配套的離體培養(yǎng)除蟲菊再生植株的專用培養(yǎng)基，按mg/L計的組分及配 比如下MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤2.0 mg/L +吲哚丁酸0. 2 mg/L +AgN03 2. 0 mg/L，附加瓊脂0. 7%， 蔗糖3%,補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5. 8。
與現(xiàn)有離體培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果
本發(fā)明誘導(dǎo)除蟲菊植株再生率30d分別達(dá)到92-96%。本發(fā)明的方法和培養(yǎng)基簡便易行，再生速度快， 再生周期短，再生率高，外植體取材不受季節(jié)限制， 一般約15-30d即可獲得再生芽。


圖l:除蟲菊在不同培養(yǎng)基上不同培養(yǎng)階段直接再生情況。圖中A-E:除蟲菊葉片、葉柄在添加不同 物質(zhì)培養(yǎng)基上直接誘導(dǎo)不定芽的情況；A: MS基本培養(yǎng)基+玉米素(簡稱ZT)) +<1-萘乙酸(簡稱NM); B:MS基本培養(yǎng)基+ZT+IBA; C: MS基本培養(yǎng)基+噻重氮苯基脲(簡稱TDZ) +IBA; D: MS基本培養(yǎng)基+6-BA 2. 0 mg/L +IBA 0.2 mg/L; E: MS基本培養(yǎng)基+6-BA 2.0 mg/L +IBA 0.2 mg/L+ AgN03 2. Omg/L;圖2:再生苗在 繼代培養(yǎng)基(即MS基本培養(yǎng)基)上的繼代生長情況。
具體實(shí)施方案
實(shí)施例1
A、以除蟲菊的種子(除蟲菊的種子云南省紅河森菊生物有限責(zé)任公司提供，下同)為材料'先用？0% 酒精對除蟲菊種子進(jìn)行消毒'無菌水沖洗2-3遍，再用0. 1%升汞繼續(xù)對除蟲菊種子進(jìn)行消毒'無菌水沖洗 3-4遍后，將滅過菌的除蟲菊的種子置于無菌濾紙上使之萌發(fā)培育成無菌苗；選取4個來自不同種子培育 的除蟲菊無菌苗接種于MS基本培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基，1962年配方'參見李明浚編譯'植物組織培養(yǎng)， 中國農(nóng)業(yè)出版社，1992年版，下同)為成分的繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)；B:在超凈工作臺上或無菌接種箱中，以A步驟的4個單株的除蟲菊無菌苗為材料繼代培養(yǎng)30d后， 切取頂端幼嫩的葉片作為外植體，將其中脈用解剖刀劃兩刀后近軸面朝上接種于MS基本培養(yǎng)基，附加ZT, (濃度分別設(shè)為O.O; 2.0; 4.0和8.0rag/L) +貼六(濃度分別設(shè)為0. 0; 0.2; 0. 4和0. 8mg/L); MS基本培 養(yǎng)基，附加ZT (濃度分別設(shè)為0.0; 2.0; 4.0; 8. 0 mg/L) +IBA (濃度分別設(shè)為0. 0; 0.2; 0.4; 0.8mg/L)， 完全隨機(jī)設(shè)計的專用培養(yǎng)基上，先在黑暗條件下培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)入光照下條件下培養(yǎng)。
C:培養(yǎng)約15d后，可見到外植體在32個設(shè)計的培養(yǎng)基上均開始褐化，到30d時所培養(yǎng)的外植體全部 褐化死亡，不能誘導(dǎo)除蟲菊形成不定芽(見圖1A,圖1B)。
在上述A、 B、 C各步驟中的所有培養(yǎng)基均添加0.7呢瓊脂和3呢蔗糖，補(bǔ)充蒸餾水至1L,滅菌前調(diào)培養(yǎng) 基的pH至5. 8后于121。C高壓蒸汽滅菌20min，將所述的培養(yǎng)材料均置于24-26°C,光照時間為16h/d、 光照強(qiáng)度(簡稱光強(qiáng)，下同)為1200 lmc的條件下培養(yǎng)。
實(shí)施例2:
按照實(shí)施例1步驟A的方法得到除蟲菊無菌苗，將該無菌苗每隔25-30天將其轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基中繼 代培養(yǎng)(即用新鮮的繼代培養(yǎng)基將所述的無菌苗定期轉(zhuǎn)移到盛有繼代培養(yǎng)基的試管或培養(yǎng)瓶。下同)。
B:在超凈工作臺上或無菌接種箱中，以A步驟的4個單株的除蟲菊無菌苗為材料繼代培養(yǎng)30d后， 切取頂端幼嫩的葉片作為外植體，將其中脈用解剖刀劃兩刀后近軸面朝上接種于MS基本培養(yǎng)基，附加噻 重氮苯基脲(簡稱TDZ,試驗(yàn)濃度分別設(shè)為0.0; 1.0; 2.0mg/L) +3_吲哚丁酸(18八)(濃度分別設(shè)為0.0; 0.1; 0.2 mg/L)完全隨機(jī)設(shè)計的專用培養(yǎng)基上，黑暗條件下培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)入光照下培養(yǎng)。
C:培養(yǎng)約15d后，外植體在各培養(yǎng)基上均開始褐化，30d后全部褐化死亡，無不定芽的誘導(dǎo)(見圖1C)。
上述A、 B、 C各步驟的所有培養(yǎng)基均添加0. 7%瓊脂和3%蔗糖，補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的 pH至5. 8后于121'C高壓蒸汽滅菌20min，將所述的培養(yǎng)材料均置于24_26°C,光照時間為16h/d、光照強(qiáng) 度(簡稱光強(qiáng)，下同)為1200 lux的條件下培養(yǎng)。
實(shí)施例3:
A、 按照實(shí)施例1步驟A的方法得到除蟲菊無菌苗，將該材料在MS基本培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。
B、 在超凈工作臺上或無菌接種箱中，以A步驟的4個單株的除蟲菊無菌苗為材料繼代培養(yǎng)30d后， 切取頂端幼嫩的葉片作為外植體，將其中脈用解剖刀劃兩刀后近軸面朝上接種于MS基本培養(yǎng)基+ 6-BA 2. 0 mg/L +IBA 0.2 mg/L+AgN03 (試驗(yàn)濃度分別設(shè)為0. 0; 1.0; 2.0; 4.0; 8.0 mg/L)的專用培養(yǎng)基上，黑暗 條件下培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)入光照下培養(yǎng)。
C:培養(yǎng)約15d后，在各培養(yǎng)基上開始有芽形成，當(dāng)AgN03為2.0mg/L時再生率顯著高丁-其它濃度，
其中葉片再生率達(dá)80%,葉柄為20%。
D:將再生芽切取下來置在MS基本培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，直到獲得完整的除蟲菊再生植株(見圖2)。 上述A、 B、 C、 D各步驟的所有培養(yǎng)基均添加O. 7%瓊脂和3%蔗糖，補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基
的pH至5. 8后于12rC高壓蒸汽滅菌20min，將所述的培養(yǎng)材料均置于24-26'C'光照時間為16h/d、光
照強(qiáng)度(簡稱光強(qiáng)，下同)為1200 lux的條件下培養(yǎng)。
實(shí)施例4:
A、按照實(shí)施例1步驟A的方法得到除蟲菊無菌苗，將無菌苗在繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)(繼代培養(yǎng)的 程序和培養(yǎng)基參照前面的實(shí)施例)。B、在超凈工作臺上或無菌接種箱中，以A步驟的4個單株的除蟲菊無菌苗為材料繼代培養(yǎng)30d后， 切取頂端幼嫩的葉片作為外植體，將其中脈用解剖刀劃兩刀后近軸面朝上接種于MS基本培養(yǎng)基+6-BA 2. 0 mg/L +IBA 0.2 mg/L+ AgN03 2. Omg/L的專用培養(yǎng)基上，先在黑暗條件下培養(yǎng)7d后再轉(zhuǎn)入光照下培養(yǎng)。
C:培養(yǎng)約15d后，在MS基本培養(yǎng)基+6-BA 2.0 mg/L +IBA 0.2 mg/L+ AgN03 2. Omg/L的再生培養(yǎng)基 上開始有再生芽的形成，30d后各單株的不定芽誘導(dǎo)率(或稱之為再生率)分別為91%、 30%、 0%、 12%。
D:將步驟C的再生芽切取下來，置于MS基本培養(yǎng)基(不添加激素)中繼代培養(yǎng)，直至獲得完整的除 蟲菊再生植株(見圖2)。
上述A、 B、 C、 0各步驟的所有培養(yǎng)基均添加0.7%瓊脂和3%廣糖，補(bǔ)充蒸餾水至1L,滅菌前調(diào)培養(yǎng)基 的pH至5. 8后于121。C高壓蒸汽滅菌20min,將所述的培養(yǎng)材料均置于24-26°C，光照時間為16h/d、光 照強(qiáng)度(簡稱光強(qiáng)，下同)為1200 lux的條件下培養(yǎng)。
實(shí)施例5:
A、 按照實(shí)施例1步驟A的方法得到除蟲菊無菌苗，將該無菌苗在繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)(培養(yǎng) 程序及繼代培養(yǎng)基參見前面的實(shí)施例)。
B、 在超凈工作臺上或無菌接種箱中，以A步驟的4個單株的除蟲菊無菌苗為材料繼代培養(yǎng)30d后， 切取頂端幼嫩的葉片作為外植體，將其中脈用解剖刀劃兩刀后近軸面朝上接種于MS基本培養(yǎng)基+6-BA 2. 0 mg/L + IBA 0.2 mg/L;或1^基本培養(yǎng)基+ 6-BA 1.5 mg/L +IBA 0, 15 mg/L +AgN03 2 . 0 mg/L; MS基本培 養(yǎng)基+6-BA 2. 0 mg/L +IBA 0. 2 rag/L十Ag亂2. 0 mg/L; MS基本培養(yǎng)基十6-BA 2. 5 mg/L + IBA 0. 25 mg/L +AgN03 2. 0 mg/L 4種專用培養(yǎng)基上，先在黑暗條件下培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)入光照下培養(yǎng)。
C、 培養(yǎng)約15d后，在上述4種培養(yǎng)基上均開始有不定芽形成，30d后不定芽的誘導(dǎo)率分別為18%、 92%、 96%、 94%(見圖1D,圖1E)。
D、 將步驟C的再生芽切取下來，在MS基本培養(yǎng)基(不添加激素)中繼代培養(yǎng)，直到獲得完整的除蟲 菊再生植株(見圖2)。
上述A、 B、 C、 0各步驟的所有培養(yǎng)基均添加0.7%瓊脂和3%蔗糖，補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基 的pH至5. 8后于121'C高壓蒸汽滅菌20min,將所述的培養(yǎng)材料均置于24-26'C，光照時間為16h/d、光 照強(qiáng)度(簡稱光強(qiáng)，下同)為1200 lux的條件下培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1、離體培養(yǎng)除蟲菊再生植株的方法，其步驟包括A、以除蟲菊種子為離體培養(yǎng)的材料，先用70％酒精對除蟲菊種子進(jìn)行消毒，無菌水沖洗2-3遍，再用0.1％升汞繼續(xù)對除蟲菊種子進(jìn)行消毒，無菌水沖洗3-4遍后，將滅過菌的除蟲菊的種子置于無菌濾紙上使之萌發(fā)培育成無菌苗；選取4個來自不同種子培育的除蟲菊無菌苗接種于MS基本培養(yǎng)基為成分的繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)；B、在無菌條件下，以A步驟的除蟲菊無菌苗為材料，繼代培養(yǎng)30d后，切取頂端幼嫩的葉片作為外植體，將其中脈劃兩刀后，近軸面朝上接種于MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤2.0mg/L+吲哚丁酸0.2mg/L+AgNO3 2.0mg/L的專用培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)7天后再轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)15-30d，得到再生芽；C、將步驟B的再生芽切下接種于MS基本培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，直至得到完整的再生植株；上述A、B、C各步驟所述的培養(yǎng)基均添加0.7％瓊脂和3％蔗糖，補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8后于121℃高壓蒸汽滅菌20min，所述的培養(yǎng)材料均置于24-26℃，光照時間為16h/d，光強(qiáng)為1200lux的條件下培養(yǎng)。
2、 一種離體培養(yǎng)除蟲菊再生植株的專用培養(yǎng)基，按mg/L計的組分及配比如下MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤2.0 mg/L +吲哚丁酸0. 2 mg/L +AgN03 2. 0 mg/L，附加瓊 脂0.7%，蔗糖3%，補(bǔ)充蒸餾水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8。
3、 權(quán)利要求2所述的專用培養(yǎng)基在離體培養(yǎng)除蟲菊再生植株上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種離體培養(yǎng)除蟲菊再生植株的方法及專用培養(yǎng)基。本發(fā)明的步驟如下A.取除蟲菊的種子，經(jīng)滅菌和無菌離體培養(yǎng)得到無菌苗，選4個不同單株的無菌苗在MS基本培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)；B.無菌苗繼代培養(yǎng)了30d后，切取頂端幼嫩的葉片作為外植體，將其中脈劃兩刀后近軸面朝上接種于MS基本培養(yǎng)基+2.0mg/L6-BA+0.2mg/L IBA和2.0mg/L AgNO₃的專用培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)再光照培養(yǎng)，大約30天左右獲得再生芽；C.將再生芽轉(zhuǎn)移至MS基本培養(yǎng)基中作繼代培養(yǎng)得到完整植株。本發(fā)明取材不受季節(jié)限制，方法簡便，再生周期短，除蟲菊的植株再生頻率為92％-96％。
文檔編號A01H4/00GK101578959SQ20091008760
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日
發(fā)明者孔令芳, 曹麗園, 杰 李, 李振芳, 李雅菲, 靜 毛, 王彩云, 梅 邢 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)