專利名稱：：一種減少八仙花組培苗氣生根的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種減少八仙花組培苗氣生根的方法，以解決八仙花組培苗生根過程中產(chǎn)生氣生根的問題，提高八仙花的再生植株的移栽成活率。
背景技術(shù)：
：八仙花(^Krfra/^ea/2acro/A^7a)繡球花科，八仙花屬，落葉灌木，高l-2m，花色艷麗，花朵碩大，花期長，觀賞價值高，是重要的園林和室內(nèi)盆花植物之一。近年來，隨著微型盆栽如'雪王后'(〃瓜'SnowQueen，)、'紅色新娘'瓜flushingBride，)等名優(yōu)新品種的培育成功，微型八仙花在國內(nèi)外市場越來越受到歡迎，其種苗供不應(yīng)求。組織培養(yǎng)技術(shù)在苗木快繁中顯得越來越重要。與很多其他花卉一樣，在八仙花組培快繁過程中，通過增加繼代次數(shù)、應(yīng)用細胞分裂素是提高繁殖系數(shù)常用的方法。但在提高增殖率的同時也很容易生成氣生根，即在培養(yǎng)基表面以上的莖的部位形成的根(如馬鈴薯)。氣生根的形成容易造成八仙花試管苗老化，主要表現(xiàn)為組培苗生長較弱，莖基根系少，生長差，試管苗的存活率低，導(dǎo)致移栽成活率不高，給生產(chǎn)推廣應(yīng)用上帶來很大影響。前人有關(guān)八仙花的組培的報道主要集中在中國栽培的普通八仙花原種(^^ra/^ea/z7acro/A^7a)上。江弈鳳(1996)、邱運亮(2005)、任叔輝(2006)、雷亞靈(2008)等主要從八仙花快繁培養(yǎng)基和激素種類和濃度方面做了研究，尚未涉及有關(guān)氣生根的問題。由于八仙花品種來源不同，基因型的差異表現(xiàn)在快繁、增殖、生根培養(yǎng)等過程中產(chǎn)生氣根的差異性也不同。一般八仙花組培苗用膠化劑瓊脂蔗糖作為支撐物質(zhì)，增殖后培養(yǎng)瓶內(nèi)生根至瓶外，嚴重影響八仙花再生植株的移栽成活率。該問題到目前為止是八仙花離體繁殖的難題尚未解決。申請人分析，造成八仙花組培苗氣生根問題主要有以下幾個原因(1)品種的特異性，矮花盆栽八仙花品種中均有一定得氣生根的現(xiàn)象形成，個別品種特別嚴重。(2)培養(yǎng)瓶內(nèi)透氣性差及其凝膠中水分較多，瓶內(nèi)濕度較大，容易誘導(dǎo)八仙花形成氣生根。(3)繼代次數(shù)對氣生根的形成也有一定得影響。組培苗經(jīng)過多次繼代，氣生根增加，生長較弱。(4)組培苗在高濃度的激素條件下，容易產(chǎn)生氣生根。在申請人所供試的10個八仙花微型品種中，隨著激素濃度和繼代次數(shù)的增加，繁殖系數(shù)增加，氣根數(shù)量相應(yīng)增加但程度不同。為了滿足八仙花增殖率的需要，八仙花莖段在B5基本培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(6-BA)1.Omg/L+B引哚丁酸(IBA)0.5mg/L+瓊脂7g/L的快繁增殖培養(yǎng)中，增殖率高，植株的生長速度較快，并生長健壯，但同時又導(dǎo)致氣生根的形成。現(xiàn)有文獻對八仙花離體生根的報道主要限于在生根培養(yǎng)基的篩選，但是有關(guān)植物組織培養(yǎng)特別是八仙花的快繁殖過程中外植體的生根是直接受到前處理(培養(yǎng)步驟和培養(yǎng)基)的影響，現(xiàn)有專利或非專利文獻都沒有涉及。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種減少八仙花組培苗氣生根的方法，以解決八仙花組培苗生根過程中產(chǎn)生氣生根的難題，提高八仙花的再生植株的移栽成活率。本發(fā)明對八仙花組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵步驟生根移栽做了試驗對比研究，利用珍珠巖作為支持體代替瓊脂，結(jié)合生根培養(yǎng)基的設(shè)計，解決了八仙花氣生根的問題，從而提高了莖基生根率和移栽成活效果。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案申請人發(fā)明了一種減少八仙花組培苗氣生根的方法，其步驟包括A:在培養(yǎng)瓶中加入40-60mL的珍珠巖，然后加入25-35mL液體生根培養(yǎng)基，所述的液體生根培養(yǎng)基成分及配比如下1/2B5基本培養(yǎng)基+萘乙酸或H引哚丁酸0.l-1.0mg/L+蔗糖10g/L，調(diào)pH至4-7，在12rC下高壓蒸汽滅菌20min，備用；B:在無菌環(huán)境下(例如在超凈工作臺中)，將苗高為l-2cm具有2片以上葉片的八仙花組培苗(組培苗獲得以前的培養(yǎng)步驟和培養(yǎng)基的設(shè)計參見實施例部分)的頂芽接種于A步驟制備的生根培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室內(nèi)養(yǎng)30-50天；C:從珍珠巖中取出八仙花組培苗，勿需清洗和煉苗，直接將八仙花組培苗移栽到體積比為1:1的泥炭土珍珠巖的基質(zhì)中；其中上述步驟A和B的培養(yǎng)條件是光照為1500-20001x，光照時間為16h.d—1，培養(yǎng)溫度為23_25°C:上述步驟C的移栽條件是遮蔭80%,保持相對濕度95%，栽培溫度為25'C;上述步驟A步驟的1/2B5基本培養(yǎng)基成分按mg/L計的成分及配比如下硝酸鉀1250.0;二水氯化鈣75,0;七水硫酸鎂125.0;硫酸氨67.0;磷酸二氫鈉75.0;碘化鉀0.375;硼酸1.5;四水硫酸錳5.0;七水硫酸鋅1.0;二水鉬酸鈉0.125;五水硫酸銅0.0125:六水氯化鈷0.0125;七水硫酸亞鐵13.9;乙二胺四乙酸二鈉18.7;肌醇50.0;煙酸0.5;鹽酸吡咳醇0.5;鹽酸硫胺素5.0。上述B5培養(yǎng)基參照報道的培養(yǎng)基配方制備(參見李明浚編譯，植物組織培養(yǎng)，中國農(nóng)業(yè)出版社，1992年版)。本發(fā)明有益的效果是1、由于利用珍珠巖作為基質(zhì)，加入一定比例的液體生根培養(yǎng)基，可有效調(diào)節(jié)培養(yǎng)瓶中的濕度，從而抑制了氣生根的形成，有利于在培養(yǎng)基里面形成正常根系。2、珍珠巖形成了疏松的、黑暗的環(huán)境，有利于誘導(dǎo)八仙花組培苗根的形成。明顯縮短了八仙花組培苗的生根時間，8天左右就能形成完整的根，本發(fā)明的生根率和移栽成活率均為100%。而且在該環(huán)境下，八仙花再生植株生長快速健壯。3、本發(fā)明利用珍珠巖作支持體，勿需瓶內(nèi)煉苗后和清洗根系直接移栽，減少對根系的損傷，簡化了移栽程序，提高了移栽成活率。而且珍珠巖價格便宜，可重復(fù)循環(huán)利用，節(jié)約組培成本。4、本發(fā)明的培養(yǎng)基中，申請人將蔗糖含量從30g/L降低至10g/L，從而節(jié)約組培成本。5、本發(fā)明方法簡便、易行，操作方便，可提高矮化八仙花品種生根及移栽的效果。圖1A:培養(yǎng)30天后八仙花組培苗在50mL珍珠巖+25mL液體生根培養(yǎng)基(1/2B5基本培養(yǎng)基+IBA0.5mg/L蔗糖10g/L,pH5.8)中的生長情況；圖1B:培養(yǎng)30天后八仙花組培苗在瓊脂7g/L+l/2B5基本培養(yǎng)基+IBA0.5mg/L+蔗糖10g/L,pH5.8的生根培養(yǎng)基中生長情況；圖2A:培養(yǎng)30天后八仙花組培苗在50mL珍珠巖+25mL液體生根培養(yǎng)基(1/2B5基本培養(yǎng)基+IBA0.5mg/L蔗糖10g/L，pH5.8)中的根系生長情況；圖2B:培養(yǎng)30天后八仙花組培苗在瓊脂7g/L+l/2B5基本培養(yǎng)基+IBAO.5mg/L+蔗糖10g/L，pH5.8的生根培養(yǎng)基中根系生長情況。圖3:八仙花組培苗在珍珠巖支持體上生根和移栽成活情況。圖4:珍珠巖基質(zhì)中不同液體生根培養(yǎng)基(1/2B5基本培養(yǎng)基+IBAO.5mg/L+蔗糖10g/，調(diào)pH至5.8)用量情況下八仙花組培苗的生根情況，在圖4中圖4A:珍珠巖50mL+液體培養(yǎng)基25mL的液體生根培養(yǎng)基中的八仙花組培苗的生根及防止氣生根的情況；圖4B:珍珠巖50raL+液體培養(yǎng)基35mL的培養(yǎng)基中八仙花組培苗的生根及防止氣生根的情況；圖4C:珍珠巖50mL-液體培養(yǎng)基15mL培養(yǎng)基中八仙花組培苗的生根及抑制氣生根的情況。具體實施方案實施例lA:在培養(yǎng)瓶中加入50mL的珍珠巖，然后加入25mL的液體生根培養(yǎng)基(1/2B5基本培養(yǎng)基+吲哚丁酸(IBA)0.2、0.5、1.Omg/L+蔗糖10g/Ll，調(diào)pH至5.8)，在121'C高壓蒸汽滅菌20min，備用B:在無菌條件下，將八仙花組培苗的頂芽(苗高l-2cm，具有2片以上葉片)，接入配好的生根培養(yǎng)基內(nèi)，在培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)30-50天(見圖1A,圖2)。C:從珍珠巖中取出八仙花組培苗，不需要清洗和煉苗，直接將組培苗移栽到為泥炭土珍珠巖體積比為l:l的基質(zhì)中；上述步驟A、B的培養(yǎng)條件分別是光照為1500-20001x,光照時間16h.cT,培養(yǎng)溫度為23-25°C:上述步驟C的移栽和栽培條件分別是盆栽場用遮陽網(wǎng)遮蔭80%，保持相對濕度95%，氣溫為10-25。C。在本實施例中，八仙花在B步驟的前處理(培養(yǎng))的基礎(chǔ)培養(yǎng)如下實驗材料購自武漢花卉開發(fā)中心的八仙花'雪球'品種(^Kc/ra/^ea歷acro/7AW7a'Kuhnert')，取其幼嫩莖段，先在化洗衣粉漂洗10min,再在自來水中沖洗30rain，然后在無菌超凈工作臺上用75%酒精消毒30s后，用0.1%的升汞消毒8min，最后用無菌水沖洗3-5次，將八仙花莖段切割成1-2cm的帶芽莖段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分及配比如下(1)B5基本培養(yǎng)基+6-BA0.5mg/L+NAAO.01mg/L+蔗糖3%,調(diào)pH至5.8,在121'C高壓蒸汽滅菌20min。培養(yǎng)條件是光照為1500-20001x，光照時間16lLd—、培養(yǎng)溫度為23-25'C，經(jīng)過30天的培養(yǎng)，腋芽誘導(dǎo)率達100%。以八仙花離體萌發(fā)的1.5cra腋芽莖段作為外植體接種于增殖培養(yǎng)基上，所述增殖培養(yǎng)基的成分及配比為B5基本培養(yǎng)基+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L，培養(yǎng)室光照為1500-20001x，光照時間為16h.d-'，培養(yǎng)溫度為23-25'C,培養(yǎng)30d,帶腋芽的八仙花離體莖段不經(jīng)愈傷過程直接形成不定芽，其增殖系數(shù)可達10.6。然后取1-2cm再生苗頂芽，在無菌條件下轉(zhuǎn)入本發(fā)明制備的生根培養(yǎng)基(參見本實施例的步驟B)上，繼續(xù)完成八仙花組培苗的生根和防止氣生根的形成。表1珍珠巖生根培養(yǎng)基中不同濃度IBA對八仙花再生苗氣生根形成的影響處理編號及IBA水平氣生根率％基部生根率(％)平均根數(shù)(個)平均根長(cnO平均苗高(era)移栽成活率(％)再生苗生長狀況l號(IBA0.2mg/L)0.00100.007.371.472.25100.00無氣生根形成，植株生長較快，基部根細長。2號(IBA0.5mg/L)0.00■005.881.062.13100.00無氣生根形成，植株生長健壯健壯，葉片綠色，且基部根細長。3號(IBA1.0mg/L)2.25100.004.130.851.73100.00少量氣生根形成，葉片小而呈黃，且基部根粗短。實施例2培養(yǎng)室內(nèi)盆栽場培養(yǎng)程序、培養(yǎng)條件和栽培管理同實施例1。具體步驟是A:在培養(yǎng)瓶中加入50mL生根培養(yǎng)基(1/2B5基本培養(yǎng)基+IBA分別設(shè)0.2、0.5、1.0mg/L三種配比+蔗糖10g/L+瓊脂7g/L，調(diào)pH至5.8)，在121'C高壓蒸汽滅菌20rain;B:將八仙花組培苗的頂芽(苗高l-2cra,帶2片以上葉片)，在超凈工作臺無菌條件下接入步驟A的生根培養(yǎng)基內(nèi)，在培養(yǎng)室培養(yǎng)30-50天；C:將八仙花組培苗從步驟B的加有瓊脂的生根培養(yǎng)基中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，直接將八仙花組培苗移栽到泥炭土珍珠巖體積比為hl的基質(zhì)中，移栽成活率可達50%左右。上述步驟A、B的培養(yǎng)條件分別是光照為1500-20001x,光照時間為16h.d—\培養(yǎng)溫度為23-25'C:上述步驟C的移栽和栽培條件分別是盆栽場用遮陽網(wǎng)遮蔭80%,保持相對濕度95%，氣溫為10-25。C。表2瓊脂生根培養(yǎng)基中不同濃度IBA對八仙花再生苗氣生根的影響處理編號及IBA水平氣生根率(％〕生根率(%)平均氣根數(shù)(個)平均氣根長(cm)平均苗高(cm)移栽成活率(％)再生苗生長狀況l號(IEAO.2mg/L)80.0012.506.310.891.8060.00氣生根細長，基部沒有根形成，葉片綠色。2號(IBAO.5rag/L)80.000.007.370.511.7230,25氣生根多且短，基部沒有根形成，葉片稍微發(fā)黃。3號(]BAl.0mg/L)100.000.005.870.411.5620.00形成A色毛狀氣生根短壯，基部不形成根，葉片黃，且植株生長緩慢。實施例3培養(yǎng)室內(nèi)和盆栽場培養(yǎng)程序、培養(yǎng)條件和栽培管理同實施例1。具體步驟是A:在培養(yǎng)瓶中加入50mL左右珍珠巖，然后分別加入0、15mL、25mL、35mL液體生根培養(yǎng)基(1/2B5基本培養(yǎng)基+IBA0.5mg/L+蔗糖10g/L，調(diào)pH至5.8)，在121'C高壓蒸汽滅菌20min;6B:在超凈工作臺的無菌環(huán)境中，將八仙花組培苗頂芽(苗高l-2cm,2片以上葉片)，接入A步驟配制的生根培養(yǎng)基內(nèi)，在培養(yǎng)室培養(yǎng)30-50天(見圖4A，B,C)。C:從珍珠巖中取出八仙花組培苗，勿需清洗和煉苗，直接將八仙花組培苗苗移栽到泥炭土珍珠巖體積比為l:l的基質(zhì)中，移栽成活率可達100%。上述步驟A、B的培養(yǎng)條件分別是光照為1500-20001x，光照時間16h.d—、培養(yǎng)溫度為23-25°C;上述步驟C的移栽和栽培條件分別是盆栽場用遮陽網(wǎng)遮蔭80%，保持相對濕度95%，氣溫為10-25。C。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例4培養(yǎng)室內(nèi)和盆栽場培養(yǎng)程序、培養(yǎng)條件和栽培管理同實施例1。具體步驟是A:在培養(yǎng)瓶中加入50mL珍珠巖，然后加入25mL液體生根培養(yǎng)基(1/2B5基本培養(yǎng)基+NM0.2，0.5，1.0mg/L+庶糖10g/L，調(diào)pH至5.8)，在121。C高壓蒸汽滅菌20min;B:在超凈工作臺的無菌環(huán)境中，將八仙花組培苗頂芽(苗高l-2cni，2片以上葉片)，接入A步驟配好的培養(yǎng)基內(nèi)，在培養(yǎng)室培養(yǎng)30-50天；C:從珍珠巖中取出八仙花組培苗，勿需清洗和煉苗，直接讓苗移栽到泥炭土珍珠巖(體積比為1:1)的基質(zhì)中，移栽成活率可達100%;上述步驟A、B的培養(yǎng)條件分別是光照為1500-20001x，光照時間16h.d—',培養(yǎng)溫度為23-25'C;上述步驟C的移栽和栽培條件分別是盆栽場用遮陽網(wǎng)遮蔭80%,保持相對濕度95%,栽培溫度為10-25。C。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例5A:在培養(yǎng)瓶中加入50mL左右珍珠巖，然后加入25mL左右的液體生根培養(yǎng)基(1/2B5基本培養(yǎng)基+IBA0.5mg/L+蔗糖10g/L，PH3、4、5、6、7、8),在121。C高壓蒸汽下滅菌20min。B:在無菌環(huán)境中，將八仙花組培苗頂芽(苗高l-2cm,2片以上葉片)，在無菌條件下接入配好的生根培養(yǎng)基內(nèi)，在培養(yǎng)室培養(yǎng)30-50天。C:然后從珍珠巖中取出八仙花苗，勿需清洗和煉苗，直接讓苗移栽到泥炭土珍珠巖(體積比1:1)的基質(zhì)中，移栽成活率可達100%。上述步驟A、B的培養(yǎng)條件分別是光照為1500-20001x,光照時間16h.d—'，培養(yǎng)溫度為23_25°C;上述步驟C的移栽和栽培條件分別是盆栽場用遮陽網(wǎng)遮蔭80%,保持相對濕度95%,栽培溫度為10-25°C。培養(yǎng)40天后結(jié)果如表5所示。表5珍珠巖基質(zhì)中不同液體生根培養(yǎng)基pH值對八仙花氣生根的影響處理編號及pH值氣生根率(%)基部生根率(％)平均根數(shù)(個)平均根長(cm)平均苗高(cm)移栽成活率(％)再生苗生長狀況l號(pH3)4.25100.004.000.801.75100.00偶有氣生根形成，植株葉片發(fā)黃。2號(pH4)0.00100.005.251.052.33100.00無氣生根生根，葉片黃綠色3號(pH5)0.00100.005,571.212.17100.00無氣生根形成，植株健壯，基部根發(fā)達4號(pH6)0.00100.006.331.592.51100.00無氣生根形成，葉片綠色，基部根發(fā)達5號(pH7)0.00100.006.171.241.38100.00無氣生根形成，且葉片綠色，基部根生長較慢6號(pH8)0.00100.005.170.911.56100.00無氣生根形成，但植株生長較慢，葉黃綠色除上述實施方案外，本發(fā)明還有其他實施方案，凡采用同等替換等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的要求保護范圍內(nèi)。參考文獻江奕鳳.繡球花的組織培養(yǎng).亞熱帶植物通訊[J].1998，27(1):53.任叔輝.八仙花的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù).防護林科技[J].2006，1(70):10-11.李際紅,等.繡球組織培養(yǎng)技術(shù)的研究.山東林業(yè)科技[J].2002,139(2):20-28.龔偉.八仙花離體培養(yǎng)和植株再生.植物生理學(xué)通訊[J].2003,39(6):624-625.段新玲，等.大花圓錐八仙花組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù).塔里木農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報[J].1999(3):14-16.雷亞靈,等.八仙花莖段組織培養(yǎng)技術(shù)研究.西北林學(xué)院學(xué)報[J].2008,23(4):101-103.黃萍，等.GA3、NM、BA對馬鈴薯試管苗氣生根形成的影響.種子[J].2003(5):105-107。權(quán)利要求1、一種減少八仙花組培苗氣生根的方法，其步驟包括A在培養(yǎng)瓶中加入40-60ml的珍珠巖，然后加入25-35ml液體生根培養(yǎng)基，所述的液體生根培養(yǎng)基成分及配比如下1/2B5基本培養(yǎng)基+萘乙酸或吲哚丁酸0.1-1.0mg/L+蔗糖10g/L，調(diào)pH至4-7，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min，備用；B在無菌環(huán)境下，將苗高為1-2cm具有2片以上葉片的八仙花組培苗的頂芽接種于A步驟制備的生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)室培養(yǎng)30-50天；C從珍珠巖中取出八仙花組培苗，勿需清洗和煉苗，直接將八仙花組培苗移栽到體積比為1∶1的泥炭土珍珠巖的基質(zhì)中；其中上述步驟A和B的培養(yǎng)條件是光照為1500-2000xl，光照時間16h.d-1，培養(yǎng)溫度為23-25℃；上述步驟C的移栽條件是遮蔭為80％，保持相對濕度為95％，栽培溫度為25℃；上述步驟A的1/2B5基本培養(yǎng)基成分按mg/L計的配比如下硝酸鉀1250.0；二水氯化鈣75.0；七水硫酸鎂125.0；硫酸氨67.0；磷酸二氫鈉75.0；碘化鉀0.375；硼酸1.5；四水硫酸錳5.0；七水硫酸鋅1.0；二水鉬酸鈉0.125；五水硫酸銅0.0125；六水氯化鈷0.0125；七水硫酸亞鐵13.9；乙二胺四乙酸二鈉18.7；肌醇50.0；煙酸0.5；鹽酸吡哆醇0.5；鹽酸硫胺素5.0。全文摘要本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)
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，具體公開了一種減少八仙花氣生根方法，解決了八仙花組培過程中氣生根的問題，可提高八仙花組培苗的移栽成活率。本發(fā)明通過以下步驟實現(xiàn)以八仙花組培苗為實驗材料，接種于珍珠巖(40-60ml)+25-35ml液體生根培養(yǎng)基(1/2B5+NAA或IBA0.1-1.0mg/L+糖10g/LpH4-7)，30天后組培苗無氣生根形成，培養(yǎng)瓶內(nèi)生根率達100％，移栽成活率可達100％。本發(fā)明不僅提高移栽成活率和簡化移栽操作程序，而且用珍珠巖代替瓊脂，可循環(huán)利用，節(jié)約了組培成本。文檔編號A01H4/00GK101578960SQ20091008760公開日2009年11月18日申請日期2009年6月24日優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日發(fā)明者峰劉,李揚麗,王彩云,黃麗莉申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)