專利名稱：虹鱒魚三倍體制種技術方法
技術領域：
本發(fā)明涉及虹鱒魚三倍體制種技術方法，屬于魚類染色體工程育種技術領域。
背景技術：
自德國生物學家發(fā)現(xiàn)了射線可以控制蛙類受精細胞染色體數量的現(xiàn)象以 來，歐美以及日本的魚類學家進一步開發(fā)了人為方法控制魚類受精細胞染色體 行為、數量、性質進而育成新品種的技術，即染色體工程育種技術。這是一項 不同于傳統(tǒng)的遺傳育種的高新技術。
本發(fā)明的關健是采用熱^f木克法即熱處理法阻止冷水性魚類虹鱒魚受精卵第 二極體排出誘導產生三倍體受精卵。目前國內尚無可與之相比較的技術實例。 在亞洲除本例外，僅日本實施過熱休克法誘導虹鱒魚三倍體的實驗。與二倍體 比較，三倍體虹鱒魚具有個體長的大的特點，但是日本民族沒有吃大魚的習慣，
食用虹鱒魚的規(guī)格都是100g左右的小魚，所以沒有生產三倍體的需要。因此日
本實施的誘導三倍體試驗基本是試驗室規(guī)模的小試驗，試驗規(guī)模多為數十粒至
數千粒受精卵，三倍體誘導率達80~95%。所用設備都是箱式熱水器等實驗室設 備，實驗目的主要是從魚類生物學角度探討染色體數量、行為變化規(guī)律。與曰 本比較，本技術在設備方面的特點是擁有生產規(guī)模的三倍體誘導設施，主要是 28~ 3(TC恒溫供水器，具有反沖、溢水、底排水功能的三倍體受精卵熱休克誘 導器(兼做孵化器)。在技術上的特點是對受精卵實施流水式吸水膨脹、流水式 熱休克處理與冷流水孵化連續(xù)作業(yè)。在規(guī)模上的特點是實施生產規(guī)模的三倍體 誘導。該技術目前正在實施成果轉化，初步實現(xiàn)了產業(yè)化制種生產，設備上還存在著熱供水器出水管路口徑偏小的問題。
近十數年來，國內曾有過關于溫水性魚類如鯉、鯽等的三倍體誘導試驗報 導，試驗方法是靜水壓力法或冷休克法誘導三倍體，但僅僅是試驗室規(guī)模的小 型試驗。迄今尚無生產性試驗及投入生產的報導。

發(fā)明內容
為了克^J見有技術結構的不足，本發(fā)明推出虹鱒魚三倍體制種技術方法。
本發(fā)明要解決的技術問題
1阻止受精卵第2極體排出，使之生成含有卵細胞卵核攜帶的1倍數染色 體、精細胞精核攜帶的1倍數染色體及卵細胞第2極體攜帶的1倍數染色體即 含有3倍數染色體的受精卵。
2阻止第2極體排出，采用適于大批量生產三倍體受精卯的熱休克法，研 發(fā)熱休克的方法與技術參數。
3提供熱-f水克批量生產三倍體發(fā)眼卵的設備裝置。
本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是 虹鱒魚三倍體制種技術方法，在卵、精結合后的適當時機，在一定的時間
區(qū)間內對處于低溫環(huán)境的受精卵進行熱(休克)處理，然后再回復到原來的低
溫環(huán)境進行冷水孵化；使本應育成二倍體的受精卵，經熱休克處理后80%以上生
成三倍體受精卵；再由三倍體受精卵育成三倍體苗種(稚魚)。
本發(fā)明的三個關鍵性技術參數
參數(l)、熱(休克)處理的開始時機l(TC水溫下，實施人工授精后第10 分鐘開始對受精卵進行熱(休克)處理。 參數(2)、熱休克溫度28~30°C。 參數(3)、熱休克時間域值10~12分鐘。虹鱒魚三倍體制種技術方法，含有以下步驟 步驟l，對虹鱒魚分別進行人工采卵、采精；
步驟2，單鹽等滲液洗滌卵；
用單鹽(NaCl)等滲液淋浴采出卵。每萬粒卵需淋浴400 士ml。 單鹽等滲液的配制
采用食用鹽，用常規(guī)溶液配制法制成濃度為0. 97 ~ 0. 98%的單鹽NaCl水溶 液。每次采卵前，根據當天計劃采卵數量，制成足量的等滲液供洗卵使用； 步驟3,實施人工授精，使卵、精結合生成受精卵； 步驟4，對受精卵實施冷流水(l(TC )吸水膨脹10分鐘； 步驟5,對受精卵實施熱流水(28 ~ 30°C )吸水膨脹同時實施熱休克10分 鐘，阻止第2極體排出，誘導發(fā)生三倍體受精卵。
步驟6，對受精卵實施冷流水(l(TC )吸水膨脹40分鐘。 步驟7,對受精卵實施冷流水(l(TC )發(fā)眼孵化至孵化積溫達220度曰； 步驟8，對發(fā)眼卵實施冷流水(1(TC)稚魚出膜孵化至300度日，稚魚孵化 出膜。
步驟9，孵化稚魚馴祠30天(l(TC ) 步驟IO,三倍體苗種培育。
虹鱒魚三倍體誘導裝置，含三倍體受精卵熱誘導設備、三倍體稚魚孵出設
備，
三倍體受精卵熱誘導設備含有熱恒溫供水器、熱誘導孵化器(反沖溢流式 底排水孵化器)；
熱恒溫供7jc器供水器容積400 kg，內設加熱、溫控裝置，和供水口。熱 水/人供水口注入熱誘導孵化器；熱誘導孵化器(反沖溢流式底排水孵化器)熱誘導孵化器由孵化桶、底排 水口注水漏斗、注水管及網盆等部件構成；網盆以上部分為盛卵區(qū)；
三倍體稚魚孵出設備有平列式反沖水稚魚出膜孵化器、平流式網籠出膜 孵化槽；
平列式稚魚出膜孵化器由平列槽和放入槽內的6個四方形浮化盤構成，每 個盤的底部是進水篩，后側壁是出水篩，后側壁的下部延伸成擋水板，水從進 水篩反沖入盤，流經盤底上的發(fā)眼卵后從后壁的出水篩流出，又向下流至盤底， 再經下一個盤的進水篩反沖進入下一盤；
平流式網籠出膜孵化槽該槽由孵化槽及平鋪槽底的長6 cm直徑3 cm的管 狀小網籠或直徑2 3厘米的河卵石構成，發(fā)眼卵放在網籠或卵石上，水流從入 水口流經網籠或卵石和發(fā)眼卵后，從出水口排出；
三倍體稚魚飼育設備
六邊形3倍體稚魚飼育槽槽材質為玻璃鋼，呈六邊形，槽上口沿圍繞一 圈厚1厘米、高5厘米的加固帶；
槽高80厘米，上口徑與底內徑分別為80厘米和60厘米，槽中央設有套管 式底排水上溢水的排水設施、注水管系一般水龍頭；注水龍頭偏向一方；注入 槽內的水呈環(huán)流式。
本發(fā)明采用的技術方案是實施批量生產的流水式熱休克誘導三倍體，現(xiàn) 有設備每批次可熱休克處理受精卯40萬粒以上。每個繁殖期(10月~ 2月)可 生產三倍體發(fā)眼卵200萬粒以上。
該方案的技術特征是流水式熱處理，解決了止水熱處理或壓力處理易導致 缺氧而不適于大批量處理受精卵的問題。本發(fā)明的創(chuàng)新(與目前二倍體制種技術的主要不同點)
三倍體制種二倍體制種1、單鹽等滲液洗卵(NaCl)1、3鹽等滲液洗卵(NaCl、 KC1、 CaClJ
2、將卵放入熱誘導將化器，實施冷(IO2、將卵放入膨脹盆實施冷(l(TC )止
°C )流水吸水膨脹10分鐘水吸水膨脹6Q分鐘
3、在原器內實施熱(28~30°C)流水3、將吸水膨脹后的受精卵轉入孵化桶
誘導三倍體受精卵生成，同時實施進行冷流水孵化。
吸水膨脹10分鐘，卵吸收的是熱水。4、吸水膨脹與孵化分別在膨脹盆和反
4、在原器內實施冷(l(TC)流水吸水沖式溢出水的孵化桶內進行，二個
膨脹40分鐘后，在原器內實施冷流工藝實施分段式作業(yè)。
水孵化。
5、吸水膨脹、熱休克誘導三倍體、孵
化3個工藝，在同一個容器一一反沖
式溢出水兼具底排水功能的孵化器
內進行，三個工藝實施連續(xù)作業(yè)。
本發(fā)明三倍體制種的工作原理:
如圖4所示，魚類的成熟卵細胞20內，含有一個攜帶1倍數染色體(n) 的卵核和1個攜帶1倍數染色體(n)的第二極體(第1極體此前已被排出)。 當精細胞進入卵細胞20時，在精細胞21的刺激下，第二極體連同他的1倍數 的染色體被排出卵外，攜帶l倍數染色體(n)的卵核與攜帶l倍數染色體(n) 的精核相互融合，生成具有二倍數染色體的二倍體受精卵，該卵將發(fā)育成二倍 體魚。
精細胞21進入卵細胞2G后，在適當時機，采取適當的人工措施(本發(fā)明 采取的是熱休克處理法22 ),阻止第二極體的排出，就會生成由卵核、精核、第二極體三方融合成的含有三倍數染色體(n、 n、 n)的受精卵即三倍體受精卵23， 該卵將發(fā)育成三倍體魚。
本發(fā)明的有益效果，本技術方案的實施，阻止了受精卵第二極體的排出， 誘導受精卵發(fā)生成由卵、精核及第二極體各自攜帶1倍數染色體融合成的含有 三倍數染色體的受精卵即三倍體受精卵，實現(xiàn)了三倍體制種的產業(yè)化。
每只熱誘導孵化器每次可生產三倍體受精卵4萬粒以上，每個繁殖期(10月~ 2月)可生產200萬粒以上。三倍體誘導率達80%以上。


圖1為本發(fā)明熱恒溫供水器和反沖溢流式底排水孵化器裝置示意圖。 圖2為本發(fā)明平列式稚魚出膜孵化器裝置示意圖。 圖3為本發(fā)明六邊形3倍體稚魚祠育槽裝置示意圖。 圖4為本發(fā)明三倍體制種示意圖。 圖5為本發(fā)明反沖波式流動示意圖。 圖6為本發(fā)明直流式網籠出膜孵化槽裝置示意圖。 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。
具體實施例方式
實施例l:如圖1所示，本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是 在卵、精結合后的適當時機，在一定的時間區(qū)間內對處于低溫環(huán)境的受精
卵進行熱(休克)處理，然后再回復到原來的低溫環(huán)境進行冷水孵化。本應育 成二倍體的受精卵，經熱休克處理后80%以上會生成三倍體受精卵。再由三倍體 受精卵育成三倍體苗種(稚魚)。
△技術手段的三個關鍵性技術參數
參數(l)、熱(休克)處理的開始時機l(TC水溫下，實施人工4受精后第10分鐘開始對受精卵進行熱(休克)處理。
參數(2)、熱休克溫度28~30°C。 參數(3)、熱休克時間域值10~12分鐘。
△沖支術手4殳的關4建^殳備
熱恒溫供水器見圖1所示。 熱恒溫供水器2，為扁方形箱體容器，水容量400 kg,箱體連接熱處理供水 管3;內設電熱裝置及自動溫度控制儀，箱體外有注水管l。 電熱裝置的散熱板、電熱元件固定在箱體的底部。
溫度控制儀為市售產品。電熱裝置的電熱元件與溫度控制儀連接。其功能是 向熱〗木克處理器供應熱(28~30°C )水。熱恒溫供水器2內水量保持400kg,水 溫恒定在28~ 30。C之間。
注水管1不斷地注入l(TC的冷水，供水管不斷地排出28 ~ 30。C的熱水，該 熱水直^l妾注入熱"^秀導粹化器。供水器內水量保持400 kg，水溫保持28 30。C恒 溫，可同時供應IO個熱誘導孵化器，同時對40萬粒受精卵進行熱休克處理。
熱誘導孵化器(反沖溢流式底排水孵化器)見圖1所示。其主要結構是塑 料桶8、盛卵網盆7、底注水管6、底排水管9。結構特征是所用盛卵網盆7系 市售塑料網盆，通透性能好，可以避免因過水不暢導致受精卵窒息死亡的問題。
底注水管6，可以使水從器底注入，向上反沖入盛卵網盆7。底排水管9的 功能是熱休克處理結束后，將器內的熱水在1分鐘之內排出，
盛卵網盆7可盛受精卵4 ~ 5萬粒。該孵化器兼具對受精卵實施吸水膨脹、 熱休克處理及冷流水孵化的功能。
平列式稚魚出膜賻化器見圖2:
由平列槽50和放入平列槽內的6個四方形孵化盤10構成，槽后端設有底排水管51和溢水排水管52構成的可以實施底排水的套管式排水系統(tǒng)。
每個孵化盤的底部是進水篩，后側壁是出水篩，后側壁的下部延伸成擋水
板60,水從進水篩反沖入孵化盤10,流經盤內的發(fā)眼卵后從后側壁的出水篩流 出，又向下流至盤底，再反沖入下一個孵化盤的進水篩。如圖5所示，水流反沖 波式流動。每個孵化盤容納發(fā)眼卵1. 5萬粒，每槽6個孵化盤，可容卵9萬粒 進行出膜孵化。該設施具備使發(fā)眼卯內的稚魚孵化出膜的功能，稚魚出膜后， 可利用平列槽進行開口飼育。
直流式網籠出膜孵化槽見圖6
該槽由長方形孵化槽101及平鋪槽底的網籠81或卵石(直徑2 ~ 3厘米) 構成，發(fā)眼卵散放在網籠8或卵石的間隙處，水流從入水口 31流經網籠或卵石 和發(fā)眼卵后，從出水口91排出。網籠或卵石的作用是分離發(fā)眼卵，避免卵集堆 缺氧，還可避免卵被沖向排水口處。每平米可容納發(fā)眼卵3 ~ 4萬粒。稚魚賻出 后，撤除網籠或卵石，孵化槽可用于稚魚開口飼育。
六邊形3倍體稚魚飼育槽13,如圖3所示，
六邊形3倍體稚魚祠育槽13材質為玻璃鋼，呈六邊形，槽上口沿圍繞一圈 厚1厘米、高5厘米的加固帶，可以保證槽體不變形，又減少了一般園形槽近 IO厘米寬的口沿多占用的空間。兩個六邊形3倍體稚魚飼育槽之間各以一邊相 接，也起到了減少占用空間的作用。省略了10厘米寬的口沿，降低了材質的成 本。
槽高80厘米，上口徑與底內徑分別為80厘米和60厘米，槽內中央設有套 管14,套管14套在排水管15外，套管14的底部有排水篩孔，槽底部的水通過 篩孔向上流動，再從排水管15的上口溢出槽外。注水管系一般水龍頭。注水龍頭偏向一方，使注入水在槽內呈環(huán)形流動。
水槽溶水量o.25m3，注水的同時也要排水，槽內水隨時都在流動交換，交換速 度可以通過控制注水量進行調節(jié)，最大交換速度為每小時10次。每小時交換6 次，每槽可》文養(yǎng)尾重1克的稚魚1萬尾，比占有同樣空間面積的園形槽和箱式 槽分別提高放養(yǎng)量0. 3倍和1倍。
本發(fā)明采用的技術方案是可以實施批量生產的流水式熱休克誘導三倍體， 每批次可熱休克處理受精卵40萬粒。該方案的主要技術特征之一是流水式熱處 理，解決了止水熱處理或壓力處理易導致因缺氧卵死亡而不適于大批量處理受 精卵的問題。第2個主要特征是實施冷流水吸水膨脹、流水式熱休克誘導三倍 體及冷流水孵化三項工藝集成式連續(xù)作業(yè)。解決了間段式作業(yè)導致的因震動引 起卵死亡的問題。 實施例2:
虹鱒魚三倍體制種工藝
步驟l，人工采卵、采精，單鹽等滲液洗卵、人工授精。
步驟2,將授精后的卵放入熱誘導孵化器，實施冷流水(l(TC )吸水膨 脹，同時多余精液隨水流溢出。
步驟3， 10分^l中后，停注冷水，改注28 3(TC的熱水，誘導生成三倍體
受精卵。
步驟4, 1G分鐘后，停注熱水，打開底排水口，再改注1(TC水，實施冷 流水吸水膨脹及孵化作業(yè)。
步驟孵化積溫達22(TC d前后，將發(fā)眼卵移入稚魚出膜將化槽，至 評,魚將出。
權利要求
1.虹鱒魚三倍體制種技術方法，其技術特征是在10℃水溫下，實施人工授精后第10分鐘開始對受精卵進行熱休克處理；熱休克時間域值10～12分鐘，熱休克溫度28～30℃；然后再回復到原來的低溫環(huán)境進行冷水孵化；本應育成二倍體的受精卵，經熱休克處理后80％以上生成三倍體受精卵；再由三倍體受精卵育成三倍體苗種稚魚。
2. 根據權利要求1所述的虹鱒魚三倍體制種技術方法，其特征是含有以下 步驟步驟l，對雌、雄虹鱒魚分別進行人工采卵、采精；步驟2,單鹽等滲液洗滌卵；步驟3,人工授精獲取受精卵；步驟4，對受精卵實施冷流水l(TC吸水膨脹10分鐘；步驟5,實施熱流水28 3(TC吸水膨脹、熱休克10分鐘，阻止第2極體排 出，誘導發(fā)生三倍體受精卵；步驟6，實施冷流水l(TC吸水膨脹40分鐘后實施發(fā)眼孵化至孵化積溫達220 度曰；步驟7，實施冷流水l(TC稚魚出膜孵化，至孵化積溫達300度日稚魚孵化 出膜；步驟8,在流水環(huán)境下將贈化稚魚育成上浮稚魚后，實施開食馴飼30天， 育成三倍體稚魚。
3. 虹鱒魚三倍體制種裝置，其特征是含有受精卵熱誘導設備、三倍體稚魚 贈出設備，受精卵熱誘導設備含有熱恒溫供水器、熱誘導孵化器； 熱恒溫供水器供水器容積400 kg，內設加熱、溫控裝置和水口 (器外另 設注水管)；熱誘導孵化器熱誘導孵化器由孵化桶注水漏斗、注水管、網盆及底排水 口構成；網盆以上部分為盛卵區(qū)；三倍體稚魚孵出設備含有平列式稚魚出膜孵化槽、平流式網籠出膜孵化槽、 六邊形3倍體一t魚飼育槽；平列式稚魚出膜孵化器由平列槽和放入槽內的6個四方形孵化盤構成， 每個盤的底部是進水篩，后側壁是出水篩，后側壁的下部延伸成擋水板，水從 進水篩反沖入盤，流經盤內的發(fā)眼卵后從后壁的出水篩流出，又向下流至盤底， 再經下一個盤的進水篩反沖進入下一盤；平流式網籠出膜孵化槽該槽由孵化槽及平鋪槽底的管狀小網籠(長6 cm 直徑3cm)或直徑2 3厘米的河卵石構成，發(fā)眼卵散放在網籠或卵石的間隙， 水流從入水口流經網籠或卵石和發(fā)眼卵后，從出水口排出；六邊形3倍體稚魚飼育槽槽材質為玻璃鋼，呈六邊形，槽上口沿圍繞一 圈厚1厘米、高5厘米的加固帶；槽高80厘米，上口內徑與底內徑分別為80厘米和60厘米，槽中央設有套 管式底排水設施、注水管系一般水龍頭；注水龍頭偏向一方。
4. 根據權利要求3所述的虹鱒魚三倍體制種裝置，其特征是 熱恒溫供水器設電熱裝置及溫度控制儀和供水管；熱-漆導孵化器由帶有底排水口的塑料桶、盛卵網盆、底注水管部件構成，底注水管使水從器底注入，向上反沖入盛卵網盆；底排水口的功能是快速排出 器內冷或熱水，保證熱休克誘導和冷流水孵化的連續(xù)作業(yè)；六邊形3倍體稚魚飼育槽中央設有套管，套管套在排水管外，套管的底部 有篩孔通向槽中，槽底部的水通過篩孔上溢，從排水管的上口溢出槽外；平流式網籠出膜孵化槽，由孵化槽及平鋪槽底的長6 cm、徑3 cm管狀塑料 網籠及套管式排水設備構成；平列式出膜孵化槽由平列槽和放入槽內的6個四方形孵化盤及套管式排 水設備構成；孵化盤的底部是進水篩、后側壁是出水篩；后側壁的下部延伸成 擋水板。
全文摘要
虹鱒魚三倍體制種技術方法，在卵、精結合后的適當時機，在一定的時間區(qū)間內對處于低溫環(huán)境的受精卵進行熱(休克)處理，然后再回復到原來的低溫環(huán)境進行冷水孵化；使本應育成二倍體的受精卵，經熱休克處理后80％以上生成三倍體受精卵；再由三倍體受精卵育成三倍體苗種(稚魚)。本技術方案的實施，阻止了受精卵第二極體的排出，誘導受精卵發(fā)生成由卵、精核及第二極體各自攜帶1倍數染色體融合成的含有三倍數染色體的受精卵即三倍體受精卵，實現(xiàn)了三倍體制種的產業(yè)化。每只熱誘導孵化器每次可生產三倍體受精卵4萬粒以上，每個繁殖期(10月～2月)可生產200萬粒以上。三倍體誘導率達80％以上。
文檔編號A01K61/00GK101606501SQ20091008954
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月22日 優(yōu)先權日2009年7月22日
發(fā)明者楊瑪麗, 沈希順, 王昭明 申請人:北京順通虹鱒魚養(yǎng)殖中心