專利名稱：細(xì)胞-組織培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)膏桐植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物種苗的培養(yǎng)技術(shù)，具體涉及通過細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)大規(guī) 模生產(chǎn)膏桐植株的方法。
背景技術(shù)：
膏才同(Jatropha curcas L.)又名麻瘋初于、小才同子，分布于熱帶、亞熱帶 地區(qū)，我國有栽培或半野生。膏桐為灌木或小喬木，高2-5m，多分枝，速生， 喜沃土壤，酸性土或鉤質(zhì)土均宜生長，耐0。C左右的低溫及輕霜，抗風(fēng)力強。 以前膏桐多栽培作圍籬及供觀賞，種仁含油脂約50%，可作潤滑油、制皂等用， 并可催吐下瀉，但有毒，忌食。近年來，工業(yè)上用膏桐籽油或經(jīng)改性的膏桐籽 油作為生物柴油用于各種柴油發(fā)動機，因此大規(guī)模生產(chǎn)膏桐植抹對生物能源的 發(fā)展具有重要作用。
現(xiàn)在栽培或半野生的膏桐繁殖方法， 一般是通過種子繁殖或扦插繁殖，繁 殖周期長，成本高。植物組織培養(yǎng)，就是分離植物體的一部分組織，如根、莖 段、葉、花、幼胚等，在無菌試管中，配合一定的營養(yǎng)、激素、溫度、光照等 條件，使其產(chǎn)生完整植株。由于其條件可以嚴(yán)招，控制，生長迅速， 一個月左右 即為一個周期，因此在植物的生產(chǎn)上有重要應(yīng)用價值。專利號為 200510048718.9的中國發(fā)明專利提供了一種通過組織培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)膏 桐種苗的方法，可縮短周期降低成本，但其繁殖速度還有進一步提高的必要和 可能。植物細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)是在植物組織培養(yǎng)快速繁殖的基礎(chǔ)上發(fā)展起來 的。具體做法就是把植物細(xì)胞從試管通過三角瓶轉(zhuǎn)移到微生物發(fā)酵的大型發(fā)酵 罐里，給予適當(dāng)?shù)臈l件進行培養(yǎng)，使植物細(xì)胞像微生物一樣在發(fā)酵罐里大量繁 殖，但細(xì)胞培養(yǎng)方法成本高。雖然申請?zhí)枮?3135614.1的中國專利文件公 布了一種"細(xì)胞-組織的培養(yǎng)方法"，以求提高增殖率，降低培養(yǎng)成本，但其技 術(shù)方案只能用于鐵皮石斛。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞-組織培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)膏桐植林的方法， 既具有細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的優(yōu)點，又能克服細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)缺點，為膏 桐的人工繁殖、脫毒苗生產(chǎn)、培育優(yōu)良品種開辟高效的途徑。
本發(fā)明方法包括以下步驟-:
1、膏桐細(xì)胞懸浮培養(yǎng)將膏桐組織研磨后接種，加入l ~ 3倍重量的細(xì) 胞懸浮液體培養(yǎng)基，容器放入旋轉(zhuǎn)式搖床，于溫度25土2。C，黑暗條件下進行 膏桐細(xì)胞懸浮培養(yǎng)2 ~ 4天，搖床轉(zhuǎn)速為8 0 ~ 1 3 Or/min,細(xì)胞懸浮液體培養(yǎng)基是MS + BA 0. 2 ~ 0. 5 mg/L + NAA 1 ~ 6 mg/L + LH 0. 5 ~ 1. 5 mg/L +蔗 糖19~22g/L， PH值5.8-6。膏桐組織的研磨最好使用硯體。
2、 對培養(yǎng)的膏桐細(xì)胞進行細(xì)胞生長測定?？蓪⒃鲋车募?xì)胞懸浮液倒入有 濾紙的布式漏斗，抽去培液，再用蒸餾水洗滌，然后進行細(xì)胞生長測定。
3、 叢芽增殖培養(yǎng)選取生長進入靜止期的膏桐細(xì)胞，接入固體的叢芽增 殖培養(yǎng)基，光照強度1000-2000LX ，叢芽增殖培養(yǎng)基是MS + 6-BA 0.1-1 mg/L + NAA 0. 1 ~ 1. 5 mg/L +蔗糖20 ~ 30g/L,用質(zhì)量比為0. 5% ~ 0. 8%瓊脂 固化，PH值5. 8-6,培養(yǎng)時間為1 5 ~ 2 0天。最佳的叢芽增殖培養(yǎng)基是 MS + 6-BA 0.9-1 mg/L + NAA 0. 4 ~ 0. 6 mg/L +蔗糖20 ~ 30g/L。
4、 生根培養(yǎng)選擇生長良好的叢芽接入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，最后 生產(chǎn)出膏桐苗，生根培養(yǎng)基是MS+NAAO. l~lmg/L。最佳的生根培養(yǎng)基是 MS + NAA 0. 4 ~ 0. 6 mg/L。
5、 出瓶栽培出瓶栽培的苗先保濕l 5~2 0天，保持溫度不低于17。C。 本發(fā)明方法生成的膏桐組培苗可以直接移栽至苗圃地，不需要在苗床上進
行練苗。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明將膏桐細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)有機的結(jié)合起來， 充分發(fā)揮細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的優(yōu)點，周期短、成本低，完全能滿足膏桐大面 積栽培需要，為膏桐的人工繁殖、脫毒苗生產(chǎn)、培育優(yōu)良品種提供了一種高效
途徑，對膏桐的開發(fā)利用具有良好前景。
具體實施例方式
見如下實施例 實施例1:
1、 膏桐外植體的選取及培養(yǎng):選取膏桐莖段，用洗潔精洗干凈后，在流水 下沖洗10min,日后轉(zhuǎn)到潔凈工作臺上，吸干水分，先用70%(體積比)酒精 滅菌30秒，再轉(zhuǎn)入0.1% (體積比)的HgCl2溶液中滅菌5分鐘，無菌蒸餾水 沖洗5次，將莖段剪成1 cm長的小段，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA2 mg/L+NAAl mg/L+蔑糖30g/L，用0. 8% (質(zhì)量比)瓊脂固化，高溫滅菌前pH調(diào) 為5.8,培養(yǎng)溫度25。C。外植體接種20天后可見明顯芽。
2、 膏桐細(xì)胞懸浮培養(yǎng):取上述培養(yǎng)的芽，先在研體中加少許細(xì)胞懸液體培 養(yǎng)基研磨接種。用三角瓶內(nèi)盛研磨后的膏桐組織和2倍重量的細(xì)胞懸浮液體培 養(yǎng)基，放入旋轉(zhuǎn)式搖床，于溫度25°C,黑暗條件下進行膏桐細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 2天，搖床轉(zhuǎn)速為1 2 5r/min,細(xì)胞懸浮液體培養(yǎng)基是MS+BA 0. 2mg/L+NAA 2mg/L+LH 0. 5mg/L+蔗糖20g/L, PH值6。
3、 將培養(yǎng)后的細(xì)胞懸浮液倒入有濾紙的布式漏斗，抽去培養(yǎng)液，再用蒸餾水洗滌若干次，再抽干，進行細(xì)胞生長測定，備用。
4、 叢芽增殖培養(yǎng)選取生長進入靜止期的膏桐細(xì)胞，接入固體的叢芽增 殖培養(yǎng)基，光照強度1000LX ,叢芽增殖培養(yǎng)基是MS + 6-BA 1 mg/L + NAA 0. 5 mg/L +蔗糖2 5 g/L，用0. 8 %瓊脂固化，PH值5. 8。當(dāng)植才朱生長到2cm左右 將植抹移至生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基是MS + NAA 0. 5 mg/L。
5、 出瓶移栽當(dāng)根長O. 5cm左右，葉片長到3 5片時，將生根苗直接移 至苗圃地，先保濕保溫15天，保持溫度不低于17。C,隨后苗木生長良好。
實施例2 :
1、 膏桐外植體的選取及培養(yǎng)同實施例1 。
2、 膏桐細(xì)胞懸浮培養(yǎng)取上述培養(yǎng)的芽，先在研體中加少許細(xì)胞懸液體 培養(yǎng)基研磨接種。用三角瓶內(nèi)盛研磨后的膏桐組織和2倍重量的細(xì)胞懸浮液體 培養(yǎng)基，放入旋轉(zhuǎn)式搖床，于溫度25°C，黑暗條件下進行膏桐細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
2天，搖床轉(zhuǎn)速為1 0 0r/min,細(xì)胞懸浮液體培養(yǎng)基是MS+BA 0. 5 mg/L+NAA
6 mg/L+LH 1 . 5mg/L+蔗糖2 2 g/L, PH值5. 8。
3、 將培養(yǎng)后的細(xì)胞懸浮液倒入有濾紙的布式漏斗，抽去培養(yǎng)液，再用蒸 鎦水洗滌若干次，再抽干，進行細(xì)胞生長測定，備用。
4、 叢芽增殖培養(yǎng)選取生長進入靜止期的膏桐細(xì)胞，接入固體的叢芽增 殖培養(yǎng)基，光照強度1800LX ,叢芽增殖培養(yǎng)基是MS + 6-BA 0. 2 mg/L + NAA 1 . 5 mg/L +蔗糖3 Og/L，用0. 6 %瓊脂固化，PH值5. 8。當(dāng)植抹生長到2cm 左右將植株移至生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基是MS + NAA 0. 2 mg/L。
5、 出瓶移栽同實施例l。苗木生長良好。 實施例3 :
1、 膏桐外植體的選取及培養(yǎng)同實施例1。
2、 膏桐細(xì)胞懸浮培養(yǎng)取上述培養(yǎng)的芽，先在研體中加少許細(xì)胞懸液體 培養(yǎng)基研磨接種。用三角瓶內(nèi)盛研磨后的膏桐組織和 倍重量的細(xì)胞懸浮液 體培養(yǎng)基，放入旋轉(zhuǎn)式搖床，于溫度2 7。C，黑暗條件下進行膏.桐細(xì)胞懸浮培 養(yǎng)3天，搖床轉(zhuǎn)速為1 3 Or/min,細(xì)胞懸浮液體培養(yǎng)基是MS+BA 0. 2 mg/L+NAA 1 mg/L+LH 0 . 5mg/L+蔗糖1 9 g/L。
3、 將培養(yǎng)后的細(xì)胞懸浮液倒入有濾紙的布式漏斗，抽去培養(yǎng)液，再用蒸 餾水洗滌若干次，再抽干，進行細(xì)胞生長測定，備用。
4、 叢芽增殖培養(yǎng)選取生長進入靜止期的膏桐細(xì)胞，接入固體的叢芽增 殖培養(yǎng)基，光照強度1 2 OOLX ,叢芽增殖培養(yǎng)基是MS + 6-BA 1 mg/L + NAA 0. 2 mg/L +蔗糖2 Og/L，用0. 5 %瓊脂固化，PH值6 。當(dāng)植林生長到2cm左 右將植抹移至生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基是MS + NAA 0. 8 mg/L。5、出瓶移栽同實施例l。苗木生長良好。
實施例4 :
1、 膏桐外植體的選耳又及培養(yǎng)同實施例1 。
2、 膏桐細(xì)胞懸浮培養(yǎng)取上述培養(yǎng)的芽，先在研體中加少許細(xì)胞懸液體 培養(yǎng)基研磨接種。用三角瓶內(nèi)盛研磨后的膏桐組織和1倍重量的細(xì)胞懸浮液體 培養(yǎng)基，放入旋轉(zhuǎn)式搖床，于溫度2 3。C,黑暗條件下進行膏桐細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 3天，搖床轉(zhuǎn)速為8 0 r/min，細(xì)胞懸浮液體培養(yǎng)基是MS+BA 0. 5 mg/L+NAA 6 mg/L+LH 1 . 5mg/L+嚴(yán)糖2 2 g/L。
3、 將培養(yǎng)后的細(xì)胞懸浮液倒入有濾紙的布式漏斗，抽去培養(yǎng)液，再用蒸 餾水洗滌若干次，再抽干，進行細(xì)胞生長測定，備用。
4、 叢芽增殖培養(yǎng)選取生長進入靜止期的膏桐細(xì)胞，接入固體的叢芽增 殖培養(yǎng)基，光照強度1 9 00LX ,叢芽增殖培養(yǎng)基是MS + 6-BA0. 2 mg/L + NAA 1. 5mg/L +蔗糖3 0g/L，用0. 8%瓊脂固化，PH值6 。當(dāng)植才朱生長到2cm 左右將植林移至生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基是MS + NAA 0. 5 mg/L。
5、 出瓶移栽同實施例l。苗木生長良好。 以上實施例僅對發(fā)明做進一步的說明，而本發(fā)明的范圍不受所舉實施例的局限。
權(quán)利要求
1、一種細(xì)胞-組織培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)膏桐植株的方法，其特征是包括以下步驟(1)、膏桐細(xì)胞懸浮培養(yǎng)將膏桐組織研磨后接種，加入1～3倍重量的細(xì)胞懸浮液體培養(yǎng)基，容器放入旋轉(zhuǎn)式搖床，于溫度25±2℃，黑暗條件下進行膏桐細(xì)胞懸浮培養(yǎng)2～4天，搖床轉(zhuǎn)速為80～130r/min，細(xì)胞懸浮液體培養(yǎng)基是MS+BA 0.2～0.5mg/L+NAA 1～6mg/L+LH 0.5～1.5mg/L+蔗糖19～22g/L，PH值5.8～6；(2)、對培養(yǎng)的膏桐細(xì)胞進行細(xì)胞生長測定；(3)、叢芽增殖培養(yǎng)選取生長進入靜止期的膏桐細(xì)胞，接入固體的叢芽增殖培養(yǎng)基，光照強度1000～2000LX，叢芽增殖培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.1～1mg/L+NAA 0.1～1.5mg/L+蔗糖20～30g/L，用質(zhì)量比為0.5％～0.8％瓊脂固化，PH值5.8～6，培養(yǎng)時間為15～20天；(4)、生根培養(yǎng)選擇生長良好的叢芽接入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，最后生產(chǎn)出膏桐苗，生根培養(yǎng)基是MS+NAA 0.1～1mg/L；(5)、出瓶栽培出瓶栽培的苗先保濕15～20天，保持溫度不低于17℃。
2、如權(quán)利要求l所說的方法，其特征是膏桐組織的研磨使用硯體。
3 、如權(quán)利要求1所說的方法，其特征是將增殖的細(xì)胞懸浮液倒入有濾紙 的布式漏斗，抽去培液，再用蒸餾水洗滌，然后進行細(xì)胞生長測定。
4、如權(quán)利要求l所說的方法，其特征是叢芽增殖培養(yǎng)基為MS + 6-BA 0 . 9 ~ 1 mg/L + NAA 0. 4 ~ 0. 6 mg/L +蔗糖20 ~ 30g/L。
5 、如權(quán)利要求1所說的方法，其特征是生根培養(yǎng)基為MS + NAA 0. 4 ~ 0. 6 mg/L。
全文摘要
細(xì)胞-組織培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)膏桐植株的方法，屬植物種苗的培養(yǎng)技術(shù)。步驟1.細(xì)胞懸浮培養(yǎng)將膏桐組織研磨后接種，加入細(xì)胞懸浮液體培養(yǎng)基MS+BA 0.2～0.5mg/L+NAA 1～6mg/L+LH 0.5～1.5mg/L+蔗糖19～22g/L；2.細(xì)胞生長測定；3.叢芽增殖培養(yǎng)選生長進入靜止期的細(xì)胞，接入?yún)惭吭鲋撑囵B(yǎng)基MS+6-BA 0.1～1mg/L+NAA 0.1～1.5mg/L+蔗糖20～30g/L；4.生根培養(yǎng)選擇生長良好的叢芽接入生根培養(yǎng)MS+NAA 0.1～1mg/L；5.出瓶栽培。有益效果本發(fā)明將膏桐細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)有機的結(jié)合，周期短、成本低，為膏桐的人工繁殖、脫毒苗生產(chǎn)、培育優(yōu)良品種提供了一種高效途徑，對膏桐的開發(fā)利用具有良好前景。
文檔編號A01H4/00GK101622959SQ20091009482
公開日2010年1月13日 申請日期2009年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月10日
發(fā)明者許繼宏 申請人:許繼宏