專利名稱：云南高原湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核酸序列及其制備方法和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及從云南高原淡水湖泊中得到的5條銅綠 微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核酸序列以及制備這些基因序列的方法和其在滇池 及云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體分子水平的檢測、發(fā)現(xiàn)新型高毒力噬藻體、高原 湖泊藍(lán)藻生物防治中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
云南九大高原湖泊流域面積近8000km2，分屬金沙江、瀾滄江 湄公河和珠江三大 水系，隨著湖區(qū)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人口的增長以及人為活動的加劇，面臨的環(huán)境問題尤其是水環(huán) 境污染問題愈顯突出，湖泊水環(huán)境污染狀況令人擔(dān)憂。滇池作為云南高原淡水湖泊之首，湖 面近300多平方公里，湖岸線長約150公里，北部的海提將湖分為外海和草海兩部分。盤 龍江等河流攜帶大量泥沙沉積淤淺和各類污水廢水流入滇池。滇池地區(qū)，夏季受西南季風(fēng) 控制，空氣濕度顯著增加，溫度日夜變幅小，沒有顯著的春夏秋冬之分，只有干季與濕季的 差別。年平均氣溫在14. 5 17. 8°C之間。水體富營養(yǎng)化的加速階段始自20世紀(jì)80年代 初，90年代迅速惡化，滇池水質(zhì)從III類下降到劣V類。入湖污染物不斷增加，富營養(yǎng)化日 趨嚴(yán)重，導(dǎo)致湖內(nèi)藍(lán)藻大量繁殖，1992年藍(lán)藻水華首次大面積暴發(fā)，從此，滇池藍(lán)藻水華問 題日益嚴(yán)重。近年來，滇池湖水水質(zhì)已降至劣五類，嚴(yán)重影響城市供水和湖泊生態(tài)環(huán)境。另 外，云南境內(nèi)的杞麓湖、異龍湖、星云湖等高原淡水自然湖泊也都面臨著與滇池類似的水體 富營養(yǎng)化問題。滇池外海水域每年爆發(fā)的“水華”現(xiàn)象，就是以微囊藻為優(yōu)勢種的藻類大量繁殖所 致，其中尤以銅綠微囊藻在數(shù)量和發(fā)生頻率上占絕對優(yōu)勢。微囊藻呈全球性分布。它們是 在富營養(yǎng)化湖泊中形成“水華”進(jìn)而對生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重影響的主要藻類。國內(nèi)外許多湖 泊均因該藻的大量繁殖形成水華而造成大面積的水體生態(tài)破壞。銅綠微囊藻適應(yīng)溫度范圍 寬，對高溫具有良好的適應(yīng)性，并且光合作用隨溫度的升高顯著提高；光飽和點(diǎn)低，光合作 用活性高，能在弱光環(huán)境中高效地進(jìn)行光合作用，并且抗強(qiáng)光傷害；對PH變化具有超強(qiáng)的 適應(yīng)能力，在中性和堿性環(huán)境中，都能進(jìn)行活躍的光合作用。銅綠微囊藻在光能利用、溫度 和PH適應(yīng)性方面的特點(diǎn)，可以使其快速生長繁殖，積累大量的生物量，在與其它藻類的競 爭中占據(jù)顯著的優(yōu)勢。有研究顯示，滇池中水華藍(lán)藻總數(shù)為3. 445 X IO6 1. 081 X 109廣， 微囊藻屬的數(shù)量為3. 445 X IO6 1. 031 X 109廣，是滇池浮游植物群落的單優(yōu)勢屬。水華藍(lán) 藻數(shù)量的時空分布與微囊藻屬一致，7月最高，1月最低；近岸帶高于湖心，湖北部高于湖中 部高于南部；束絲藻屬的數(shù)量3月最高，1月最低；湖北部高于南部高于中部。微囊藻水華 全年可見，束絲藻屬僅在3月形成零星的小面積水華。噬藻體既藍(lán)藻病毒在海洋與淡水中均廣泛存在，并且其含量在藍(lán)藻水華生消前后 變化明顯，具有重要生態(tài)作用。上世紀(jì)九十年代，噬藻體分子生物學(xué)的研究對象主要局限 于對海洋噬藻體的衣殼組裝蛋白基因進(jìn)行病毒檢測、生態(tài)分布和遺傳多樣性分析。進(jìn)入21世紀(jì)以來，淡水噬藻體研究也得到了相應(yīng)重視，Takashima等人根據(jù)感染有毒銅綠微囊藻 的Ma-LMMOl衣殼蛋白編碼基因g91設(shè)計的實(shí)時定量PCR引物，對銅綠微囊藻水華發(fā)生前 后水體中的Ma-LMMOl進(jìn)行定量分析，為噬藻體對銅綠微藻水華的生態(tài)影響提供了新方法。 Yoshida等人通過此方法還檢測到日本Mikata湖中銅綠微囊藻消退時噬藻體數(shù)量有明顯 增加，而且噬藻體對產(chǎn)毒銅綠微藻和非產(chǎn)銅綠微藻數(shù)量有調(diào)節(jié)作用。然而，迄今為止，還沒 有對水體污染嚴(yán)重的云南滇池以及周邊高原淡水湖泊水體中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白 編碼基因g91核酸序列的報道，也沒有其獲得方法和其應(yīng)用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用銅綠微囊藻噬藻體Ma-LMMOl的g91基因片段設(shè)計了兩對巢式PCR引 物。對云南滇池以及周邊高原淡水湖泊水樣利進(jìn)行巢式PCR特異性擴(kuò)增，膠回收和測序分 析得到如權(quán)利要求1中所述的5條DNA核苷酸序列。如權(quán)利要求1中所述的5條DNA核苷 酸序列之間僅存在個別核苷酸差異，保守性極高，可作為云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻 噬藻體分子水平的檢測標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)化樹分析表明其與已有報道的銅綠微囊藻噬藻體有極高同 源相關(guān)性。同時提供制備這些基因序列的方法和其在滇池及云南高原淡水湖泊中銅綠微囊 藻噬藻體分子水平的檢測標(biāo)準(zhǔn)、發(fā)現(xiàn)新型高毒力噬藻體、高原湖泊藍(lán)藻生物防治中的應(yīng)用。本發(fā)明用下面的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)上述的發(fā)明目的云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核酸序列，如序列 表所示的5條核苷酸序列。制備云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核酸序列的 方法，由表2所示的兩對自行設(shè)計的引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)(表3，表4)而得。制備云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核酸序列的 方法，包括基于銅綠微囊藻噬藻體Ma-LMMOl的g91基因片段，設(shè)計巢式PCR引物；高原淡水 湖泊水樣采集；水樣濃縮液中的噬藻體DNA ；巢式PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物的純化和測序；序列分 析步驟。云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核酸序列在滇池 及云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體分子水平的檢測中的應(yīng)用。云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核酸序列在發(fā)現(xiàn) 新型高毒力噬藻體中的應(yīng)用。云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核酸序列在高原 湖泊藍(lán)藻生物防治中的應(yīng)用。云南滇池及周邊高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核酸 序列可用下述的步驟得到1.基于銅綠微囊藻噬藻體Ma-LMMOl的g91基因片段，設(shè)計巢式PCR引物；2.水樣采集；3.水樣濃縮液中的噬藻體DNA提??；4.巢式PCR擴(kuò)增；5. PCR產(chǎn)物的純化和測序；6.序列分析。


圖1為水體采樣圖； 圖2為PCR擴(kuò)增凝膠電泳圖；圖3(a)、圖3(b)和圖3(c)為本發(fā)明基因序列部分測序峰值圖；圖4為本發(fā)明基因序列XY27，XY18，YL02, YLll和DC05在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn) 行BLAST基因序列同源相關(guān)性比較結(jié)果；圖5為本發(fā)明基因序列與NCBI基因庫中相關(guān)序列的同源關(guān)系進(jìn)化樹圖。本發(fā)明序列表是云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91 核酸序列，5條核苷酸序列為本發(fā)明的云南滇池及周邊高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體 尾鞘蛋白編碼基因g91核酸序列表，序列表中5個DNA序列分別來自星云湖的XY27號水 樣，星云湖的XY18號水樣，異龍湖的YL02號水樣，異龍湖的YLll號水樣和滇池的DC05號 水樣。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以 此來限制本發(fā)明。實(shí)施例1 l.PCR引物設(shè)計PCR引物是根據(jù)NCBI中下載的銅綠微囊藻噬藻體Ma-LMMOl的g91基因序列，通過 序列比對后得到保守序列后利用Primer Express2. 0軟件設(shè)計獲得兩對引物(表2)，之后 交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司利用美國PE公司391型DNA自動合成儀進(jìn)行合 成。2.水樣采取于2008年008年10-11月在滇池采取水們，完成成水樣采集(如圖 1所示)。3.噬藻體DNA的提取(1).采集自滇池的水樣依次經(jīng)紗布、0. 45um和0. 22um纖維濾膜過濾后置于4°C， 黑暗條件下保存；(2).水樣過濾液以1. 5ul每管分裝在1. 5ml的EP管(印pendorf tube)中，經(jīng) Heto-Drywinner (Dw-3)低溫真空凍干機(jī)冷凍干燥。收集EP管底部水樣過濾液的濃縮液至 一新的EP管中，每管為250ul，并計算濃縮倍數(shù)；(3).使用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的小量病毒RNA/DNA抽提試劑盒完成 水樣過濾濃縮液中核酸的提取。具體操作按試劑盒附帶說明書進(jìn)行；(4).核酸于-80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. PCR 擴(kuò)增(1).巢式PCR外圍引物反應(yīng)，25ul體系反應(yīng)體系(表3.)。按以下條件進(jìn)行PCR反 應(yīng)94°C 3min ；94°C 30sec、54°C 30sec 72°C 2min，40 個循環(huán)；72°C 5min、4°C~。_80°C 冰箱保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為648bp。(2).巢式PCR內(nèi)圍引物反應(yīng)，50ul體系反應(yīng)體系(表4.)。按以下條件進(jìn)行
5PCR 反應(yīng)94°C 3min ；94°C 30sec、57°C 30sec 72°C 1 30sec，40 個循環(huán)；72°C 5min、 4°C~。-80°C冰箱保存?zhèn)溆谩U(kuò)增產(chǎn)物大小為426bp。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)。5、PCR產(chǎn)物的純化和測序(1).使用 DNA Gel Extraction Kit (BBI, USA)完成 PCR 產(chǎn)物的純化。具體操作 步驟按試劑盒內(nèi)附帶說明書進(jìn)行；(2).純化的PCR產(chǎn)物儲存于_70°C冰箱內(nèi)待用。5.純化的PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測序工作，測出基 因序列(表1和序列表)，并附有部分測序峰值圖(圖3)。6.在NCBI中將所測得基因序列進(jìn)行列比對，結(jié)果顯示如權(quán)利要求1所述DNA核 苷酸序列在NCBI中分別進(jìn)行BLAST同源關(guān)系比較(表5和圖4)。并與銅綠微囊藻噬藻體 Ma-LMM03、Ma-LMM02和Ma-LMMOl (由Takashima等人自日本的Mikata湖分離而得)以及 同為肌病毒科的大腸桿菌T4的尾鞘蛋白編碼基因進(jìn)行同源進(jìn)化樹分析(圖5)。表 1
-ATAACACTCTCATATCCACACCAATTTCGTGGGAGAGGTTATTGCTCGCGA GGATGCACCTGCTGATATAGTGTGGCCTATGCTCACTAATACTGCCGTAGCG XY27 CCTGTAGTCAATAGTAAAGAGACAGTAGCCGCGACGGGCCCGTATACTGGTT 365bP CTACCAGTGGCCGATATTTCCTTCGCGTTGATGATGTCGCTGCTGGTGTAGC TACTATTAAATGGCAATTTGTACCACTGGGTCAGAATCCACTTAACTGGGCG GCTGTCACTACGGATATTGATGTTAATATTGCTGCTGGTGCAGGTAGTTCTA GTAACGTTCTCATCCCACTAACTAGTAATAACATCAGCGTTCGTTTCGGTAC TG-3'
-ACACTCTCATATCCACACCAATTTCGTGGGAGAGGTTATTGCTCGCGAGGA
TGCGGCTGCTGATATAGTGTGGCCTATGCTCACTAATACTGCCGTAGCGCCT
GTAGTCAATAGTAAAGAGACAGTAGCCGCGACGGGCCCGTATACTGGTTCTA 362bp
CCAGTGGCCGATATTTCCTTCGCGTTGATGATGTCGCTGCTGGTGTAGCTAC
TATTAAATGGCAATTTGTACCACTGGGTCAGAATCCACTTAACTGGGCGGCT
GTCACTACGGATATTGATGTTAATATTGCTGCTGGTGAAGGTAGTTCTAGTA
ACGTTCTCATCCCACTAACTAGTAATAACATCAGCGTTCGTTTCGGTACTG-
-ACACTCTCATATCACACCAATTTCGTGGGAGAGGTTATTGCTCGCGAGGAT
GCACCTGCTGATATAGTATGGCCTATGCTCACTAATACTGCCGTAGCGCCTG
TAGTCAATAGTAAAGAGACAGTAGCCGCGACGGGCCCGTATACTGGTTCTAC 36ibp
CAGTGGCCGATATTTCCTTCGCGTTGATGATGTCGCTGCTGGTGTAGCTACT
ATTAAATGGCAATTTGTACCACTGGGTCAGAATCCACTTAACTGGGCGGCTG
TCACTACGGATATTGATGTTAATATTGCTGCTGGTGCAGGTAGTTCTAGTAA
CGTTCTCATCCCACTAACTAGTAATAACATCAGCGTTCGTTTCGGTACTG-3
5‘
-ACACTCTCATATCCACACCAATTTCGTGGGAGAGGTTATTGCTCGCGAGGA
5
XY185.
YL02TGCACCTGCTGATATAGTGTGGCCrATGCTCACTAATACTGCCGTAGCGCCT YLii GTAGTCAATAGTAAAGAGACAGTAGCCGCGACGGGCCCGTATACTGGTTCTA 362bp CCAGTGGCCGATATTTCCTTCGCGTTGATGATGTCGCTGCTGGTGTAGCTAC TATTAAATGGCAATTTGTACCACTGGGTCAGAATCCACTTAACTGGGCGGCT GTCACTACGGATATTGATGTTAATATTGCTGCTGGTGCAGGTAGTTCTAGTA ACGTTCTCATCCCACTAACTAGTAATAACATCAGCGTTCGTTTCGGTACTG-
5‘
-GTAGCGGGAGTTAATAACACTCTCAATATCCACACCAATTTCGTGGGAGAG GTCATTGCTCGCGAGGATGCACCTGCTGATATAGTGTGGCCTATGCTCACTA 363bP DC05 ATACTGCCGTAGCGCCTGTAGTCAATAGTAAAGAGACAGTAGCCGCGGCGGG CCCGTATACTGGTTCTACCAGTGGCCGATATTTCCTTCGCGTTGATGATGTC GCTGCTGGTGTAGCTACTATTAAATGGCAATTTGTACCACTGGGTCAGAATC CACTTAACTGGGCGGCTGTCACTACGGATATTGATGTTAATATTGCTGCTGG TGCAGGTAGTTCTAGTAACGTTCTCACCCACTAACTAGTAATAACATCAGCG表2 表3巢式PCR第一步反應(yīng)反應(yīng)液
試劑名稱__ftlg_
PremixTaq酶(寶生物工程(大連)有限公司生12.5μ1
外圍上游上游特異性引物(20 μ Μ) 2. 0 μ 1 外圍下游上游特異性弓丨物(20 μ Μ) 2· 0 μ 1 DEPC處理水 5· 5 μ 1 噬藻體DNA 3.0μ1 總計_25·0μ1_
表4巢式PCR第二步反應(yīng)反應(yīng)液 序列表<110>昆明理工大學(xué)<120>云南高原湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核酸序列及其制備方法和其應(yīng)用<160>5<210>1<211>365<212>DNA<213> 肌尾噬菌體科(Myoviridae)<400>1ataacactct catatccaca ccaatttcgt gggagaggtt attgctcgcg aggatgcacc 60tgctgatata gtgtggccta tgctcactaa tactgccgta gcgcctgtag tcaatagtaa 120agagacagta gccgcgacgg gcccgtatac tggttctacc agtggccgat atttccttcg 180cgttgatgat gtcgctgctg gtgtagctac tattaaatgg caatttgtac cactgggtca 240gaatccactt aactgggcgg ctgtcactac ggatattgat gttaatattg ctgctggtgc 300aggtagttct agtaacgttc tcatcccact aactagtaat aacatcagcg ttcgtttcgg 360tactg
365<210>2<211>362<212>DNA<213> 肌尾噬菌體科(Myoviridae)<400>2acactctcat atccacacca atttcgtggg agaggttatt gctcgcgagg atgcggctgc 60tgatatagtg tggcctatgc tcactaatac tgccgtagcg cctgtagtca atagtaaaga 120gacagtagcc gcgacgggcc cgtatactgg ttctaccagt ggccgatatt tccttcgcgt 180tgatgatgtc gctgctggtg tagctactat taaatggcaa tttgtaccac tgggtcagaa 240tccacttaac tgggcggctg tcactacgga tattgatgtt aatattgctg ctggtgaagg 300tagttctagt aacgttctca tcccactaac tagtaataac atcagcgttc gtttcggtac 360t g
9362<210>3<211>361<212>DNA<213> 肌尾噬菌體科(Myoviridae)<400>3acactctcat atcacaccaa tttcgtggga gaggttattg ctcgcgagga tgcacctgct 60gatatagtat ggcctatgct cactaatact gccgtagcgc ctgtagtcaa tagtaaagag 120acagtagccg cgacgggccc gtatactggt tctaccagtg gccgatattt ccttcgcgtt 180gatgatgtcg ctgctggtgt agctactatt aaatggcaat ttgtaccact gggtcagaat 240ccacttaact gggcggctgt cactacggat attgatgtta atattgctgc tggtgcaggt 300agttctagta acgttctcat cccactaact agtaataaca tcagcgttcg tttcggtact
360g
361<210>4<211>362<212>DNA<213> 肌尾噬菌體科(Myoviridae)<400>4acactctcat atccacacca atttcgtggg agaggttatt gctcgcgagg atgcacctgc 60tgatatagtg tggcctatgc tcactaatac tgccgtagcg cctgtagtca atagtaaaga 120gacagtagcc gcgacgggcc cgtatactgg ttctaccagt ggccgatatt tccttcgcgt 180tgatgatgtc gctgctggtg tagctactat taaatggcaa tttgtaccac tgggtcagaa 240tccacttaac tgggcggctg tcactacgga tattgatgtt aatattgctg ctggtgcagg 300tagttctagt aacgttctca tcccactaac tagtaataac atcagcgttc gtttcggtac 360t g
362
<210>5<211>363<212>DNA<213> 肌尾噬菌體科(Myoviridae)<400>5gtagcgggag ttaataacac tctcaatatc cacaccaatt tcgtgggaga ggtcattgct 60cgcgaggatg cacctgctga tatagtgtgg cctatgctca ctaatactgc cgtagcgcct 120gtagtcaata gtaaagagac agtagccgcg gcgggcccgt atactggttc taccagtggc 180cgatatttcc ttcgcgttga tgatgtcgct gctggtgtag ctactattaa atggcaattt 240gtaccactgg gtcagaatcc acttaactgg gcggctgtca ctacggatat tgatgttaat 300attgctgctg gtgcaggtag ttctagtaac gttctcaccc actaactagt aataacatca 360gcg
363
1權(quán)利要求
云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核酸序列，見附圖1序列表的5條核苷酸序列。
2.制備權(quán)利要求1所述的云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因 g91核酸序列的方法，由表2所示的兩對自行設(shè)計的引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)而得。
3.制備權(quán)利要求1所述的云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因 g91核酸序列的方法，包括基于銅綠微囊藻噬藻體Ma-LMMOl的g91基因片段，設(shè)計巢式PCR 引物；高原淡水湖泊水樣采集；水樣濃縮液中的噬藻體DNA提?。怀彩絇CR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物的 純化和測序；序列分析步驟。
4.權(quán)利要求1所述的云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核 酸序列在滇池及云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體分子水平的檢測中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核 酸序列在發(fā)現(xiàn)新型高毒力噬藻體中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91核 酸序列在高原湖泊藍(lán)藻生物防治中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，它公開了云南滇池及周邊高原淡水湖泊中的5條銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因g91部分序列。采集云南高原淡水湖泊水樣，經(jīng)過濾濃縮處理后提取核酸，用自行設(shè)計的兩條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后進(jìn)行基因測序。5條來自不同湖泊水域中的g91基因部分序列僅存在個別核苷酸差異，保守性極高?？蓱?yīng)用在滇池及云南高原淡水湖泊中銅綠微囊藻噬藻體分子水平的檢測、發(fā)現(xiàn)新型高毒力噬藻體、高原湖泊藍(lán)藻生物防治中。
文檔編號A01P13/02GK101928713SQ20091009486
公開日2010年12月29日 申請日期2009年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日
發(fā)明者馮悅, 劉麗, 向安, 夏雪山, 薛梅, 魏大巧 申請人:昆明理工大學(xué)