專利名稱：孝順竹高效穩(wěn)定再生體系建立的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及林木生物技術(shù)和組織培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及到孝順竹(Bambusa multiplex)高效穩(wěn)定再生體系的建立。發(fā)明目的竹類植物生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、再生能力強(qiáng)、具有一次種植，可永續(xù)利用的特點(diǎn)，是我國(guó) 重要的森林資源。竹子自古以來(lái)就在我國(guó)人民生活中扮演著重要角色，而現(xiàn)今除了傳統(tǒng)的 竹筍食品、竹工藝品外，大量高品質(zhì)、高性能的新型竹子工業(yè)品已被研制和生產(chǎn)，如竹地 板、竹車廂板、竹制模板、竹纖維紙制品、竹纖維紡織品等，竹產(chǎn)業(yè)已成為我國(guó)南方山區(qū)發(fā)展 和致富的新興產(chǎn)業(yè)，據(jù)統(tǒng)計(jì)2005年我國(guó)竹產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值已達(dá)600多億元，在目前我國(guó)森林覆蓋 率低，木材嚴(yán)重缺乏的情況下，竹材以竹代木不僅具有重要的生態(tài)價(jià)值，而且具有重要的經(jīng) 濟(jì)價(jià)值。隨著目前竹材工業(yè)利用的不斷深入，農(nóng)民不僅需要產(chǎn)量更高的竹種，市場(chǎng)更需要 材性更好的竹種，以滿足不同產(chǎn)品的生產(chǎn)要求，因此竹子的遺傳改良日益受到重視。長(zhǎng)期以來(lái)由于竹類植物特殊的開(kāi)花生物學(xué)特性，導(dǎo)致竹子的常規(guī)育種，如雜交等 研究進(jìn)展相對(duì)于農(nóng)作物而言十分緩慢而且困難。相對(duì)傳統(tǒng)育種而言，目前現(xiàn)代生物技術(shù)育 種迅速發(fā)展，具有創(chuàng)造變異多、育種目的性強(qiáng)、時(shí)間短、后代選擇容易等優(yōu)點(diǎn)，已在農(nóng)作物育 種方面取得大量成功。因此，采用現(xiàn)代生物技術(shù)育種如基因?qū)肱c移植等應(yīng)該是實(shí)現(xiàn)竹類 植物遺傳改良育種的有效途徑。由于基因的導(dǎo)入與移植必須建立在愈傷組織培養(yǎng)和再生體 系構(gòu)建的基礎(chǔ)之上，而竹類植物是目前公認(rèn)的最難建立再生體系的植物，因此成熟的由竹 愈傷組織誘導(dǎo)的再生體系的構(gòu)建一直是制約竹類植物生物技術(shù)育種研究的瓶頸。本發(fā)明提供了孝順竹(Bambusa multiplex)高效穩(wěn)定再生體系建立的方法，將為 孝順竹乃至叢生竹生物技術(shù)育種，如基因?qū)肱c移植等提供技術(shù)平臺(tái)。
背景技術(shù)：
近幾十年來(lái)，隨著國(guó)際上植物生物技術(shù)的快速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外對(duì)竹子生物技術(shù)研究 也逐漸增加，目前國(guó)際上和本專利有關(guān)的由竹愈傷組織誘導(dǎo)的再生體系構(gòu)建方面的報(bào)道主 要有1982年Metha等報(bào)道了印度刺竹(Bambusa arundinacea)種子成熟胚誘導(dǎo)出愈傷 組織和再生植株(參考文獻(xiàn)1)。1983 年 Huang 和 Murashige 從剛竹屬(Phyllostachy)、箬竹屬(Sasa)、刺竹屬 (Bambusa)的葉片和嫩莖尖誘導(dǎo)出愈傷組織(參考文獻(xiàn)2)。1985年Rao等以牡竹(D. strictus)成熟種子誘導(dǎo)了愈傷組織，進(jìn)而再生植株(參 考文獻(xiàn)3)。1986 年 Yeh 和 Chang 用綠竹(B. οldhamii)、吊絲球竹(B. beecheyana)的花序以 體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式再生植株(參考文獻(xiàn)4、5)。1989年Huang等報(bào)道了用綠竹(B. ο ldhamii)、羅漢竹(Ph. aurea)和箬竹(S. pygmaea)的嫩莖尖進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，僅由BA和NAA誘導(dǎo)的愈傷組織可器官發(fā)生，形成再生植株(參考文獻(xiàn)6)。1990年Tsay報(bào)道了 Sinocalamus Iatiflora的花藥組織培養(yǎng)，形成了愈傷組織和 再生植株(參考文獻(xiàn)7)。2007年Gillis等利用巴苦竹(Bambusa balcooa)小穗誘導(dǎo)出愈傷組織并建立了 高效再生體系(參考文獻(xiàn)8)。我國(guó)大陸學(xué)者在竹子生物技術(shù)方面的研究起步較晚。90年代結(jié)合推廣優(yōu)良品種(雜種)，張光楚等報(bào)導(dǎo)了麻竹(S. Iatiflorus munro)、 M tt (B. oldhamii)> 雜禾中 g 7 號(hào)(Bambusapervariabi1i sMcClure X Dendrocalamu s IatiflorusMunroNo. 7)、花吊絲竹(Dendrocalamus minorvar. amoenus)、馬來(lái)舌甘龍竹 (Dendrocalamus asper)等竹種的組織培養(yǎng)快速竹苗繁殖技術(shù)，但是需要說(shuō)明的是張光楚 等報(bào)導(dǎo)的組培不是經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)而再生的竹株，而是未經(jīng)“脫分化”過(guò)程而直接產(chǎn)生叢生 芽，再由叢生芽形成植株，這種竹子擴(kuò)繁技術(shù)基本屬于促進(jìn)節(jié)芽萌生的微繁殖體系(參考 文獻(xiàn)9-11)。1991年闕國(guó)寧等報(bào)導(dǎo)了對(duì)黃竹(D. membranceus)禾Π印度刺竹(Bambusa arundinacea)的培養(yǎng)(參考文獻(xiàn)12-13)，2007年吳濤等報(bào)導(dǎo)了對(duì)金絲慈竹(Bambusa affinis ‘viridiflavus’)的培養(yǎng)(參考文獻(xiàn)14)，均屬經(jīng)愈傷組織再生竹株的研究，但其 外植體均為莖段，并且上述研究均未涉及孝順竹(Bambusa multiplex)。目前涉及孝順竹(Bambusa multiplex)組織培養(yǎng)研究的報(bào)導(dǎo)主要有顧小平等 (2006年)、吳益民等(2000年)、梁建群等(1996年)、Huang et al (1993年)，見(jiàn)參考文獻(xiàn) 15-18。這些文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了采用孝順竹竹筍或小穗等作為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織，但并未實(shí)現(xiàn) 植株再生。主要參考文獻(xiàn)1. Metha. U,IVR Rao and HY Mohan Ram. Somatic embryogensis in bamboo[C]. In Proceeding 5th Interenational Cogress of Plant tissue culture & cell Culture, 1982，109 1102. L. C. Huang, T. Murashige. Tissue culture investigations of bamboo I. Callus cultures of Bambusa,Phyllostachys and Sasa[J]. Bot Bull Acad Sin,1983, 24，31 523. Rao. IU,IVR Rao and V Narang. Somatic embryogenesis and regeneration of plants in the bamboo Dendrocalamus strictus[J]· Plant Cell Reports, 1985,4 :191 1944. Yeh, ML and WC Chang. Somatic embryogenesis and subsequent plant regeneration from inflorescence of Bambusa beecheyana Munro var.beecheyana[J]. Plant Cell Reports，1986，5 :409 4115. Yeh,ML and WC Chang. Plant regeneration through somatic embryogenesis in callus culture of green bamboo(Bambusa oldhamii Munro)[J]. Theoretical and Applied Genetics，1986，73 :161 1636. L. C. Huang, B. L. Huang and W. L. Chen. Tissue culture investigations ofbamboo IV.Organogenesis leading to adventitious shoots and plants in excised shoot apices[J]. Environ Exp Bot，1989，29，307 3157.Tsay. HS. cc Yeh and JY Hsu. Embryogenesis and plant regeneration from anther culure of bamboo[Sinocalamus latiflora(Munro)McClure] [J].Plant cell Reports,1990，9 349 3518.Koen Gillis，Johan Gielis，Hilde Peeters et al. Somatic embryogenesis from mature Bambusa balcooa Roxburgh as basis for mass production of elite forestry bamboos[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture,2007(91) 115 ~ 1239.張光楚，王裕霞.麻竹離體快速繁殖技術(shù)的研究[J].竹子研究匯刊，1993， 12(4) 7 1510.張光楚，王裕霞.雜種撐麻7號(hào)竹的組織培養(yǎng)研究[J].林業(yè)科學(xué)研究，2003， 16(3) 245 53111.張光楚，王裕霞，譚源杰等.叢生竹的組培快繁技術(shù)[J].竹子研究匯刊，2004， 23(1) 13 2012.闕國(guó)寧，諸葛強(qiáng).竹子愈傷組織培養(yǎng)與植株再生[J].竹子研究匯刊，1991， 10(4) 413.闕國(guó)寧，諸葛強(qiáng).黃竹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和原生質(zhì)體分離[J].林業(yè)科學(xué)研究， 1994，7(1) 44 4714.吳濤，盧娟娟，丁雨龍等.金絲慈竹愈傷組織培養(yǎng)及植株再生研究[J].林業(yè)科 技開(kāi)發(fā)，2008，22 (2) 19 2215.顧小平，蘇夢(mèng)云，岳晉軍等.幾種叢生竹愈傷組織誘導(dǎo)與防褐變技術(shù)研究.林 業(yè)科學(xué)研究，2006，19(1) 75-7816.吳益民，邊紅武，王君暉等.竹子懸浮細(xì)胞系的建立和組織培養(yǎng)試管苗移栽觀 察.竹子研究匯刊，2000，19(1) 52-5617.梁群健.綠竹、麻竹和蓬萊竹的組織培養(yǎng).國(guó)立臺(tái)灣大學(xué)碩士論文.199618. Huang L C,Huang B L. Bamboo tissue culture :Recent Advances in Botany. Institute of Botany, Academia Sinica Monograph Series,1993, (13) :203_212本發(fā)明的特點(diǎn)縱觀國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，雖然目前已在多種竹種上實(shí)現(xiàn)了以不同細(xì)胞誘導(dǎo)的愈傷組 織和再生植株，但對(duì)孝順竹的研究?jī)H報(bào)導(dǎo)了愈傷組織誘導(dǎo)，并未實(shí)現(xiàn)植株再生。而且上述研 究均存在褐變嚴(yán)重、再生頻率不高以及重復(fù)困難等問(wèn)題，當(dāng)我們將前人的研究方法直接用 于孝順竹愈傷組織培養(yǎng)和再生體系構(gòu)建時(shí)也未獲成功，說(shuō)明不同竹種之間愈傷組織培養(yǎng)和 再生體系構(gòu)建方法存在一些差異。經(jīng)過(guò)大量研究和試驗(yàn)，并對(duì)同類研究方法進(jìn)行了大量改 良和革新，發(fā)明人探索出一套孝順竹愈傷組織培養(yǎng)和再生體系構(gòu)建方法，成功的實(shí)現(xiàn)了孝 順竹種胚的愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生。

發(fā)明內(nèi)容
孝順竹(Bambusa multiplex)高效穩(wěn)定再生體系建立的方法，其特征包括外植體消毒、愈傷組織誘導(dǎo)與增殖、愈傷組織分化與生根、以及壯苗移栽過(guò)程，具體步驟如下
(1)外植體消毒選擇健康飽滿的種實(shí)先用75% (ν/ν)乙醇處理1分鐘；再用 0. 1% (w/v)升汞(每升加5-6滴吐溫-80)浸泡15分鐘；然后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次；最后用 無(wú)菌紙吸干種實(shí)表面水分后待接種。(2)愈傷組織誘導(dǎo)與增殖將消毒后的外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗 培養(yǎng)3-14天使愈傷組織形成；然后將色澤淡黃致密的愈傷組織分離出來(lái)接種到繼代增 殖培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)14-21天。所述誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基是以NB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加2， 4-D(2-10mg/L)、卡拉膠(8-lOg/L)、脯氨酸(400-600mg/L)、谷氨酰胺(400-600mg/L)、水解 酪蛋白(200-400mg/L)。(3)愈傷組織分化與生根將繼代增殖培養(yǎng)后的愈傷組織接種到預(yù)分化培養(yǎng)基上 培養(yǎng)3-7天；然后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-30天；待愈傷組織產(chǎn)生0. 1-1. 5cm叢芽后將 叢芽切割下來(lái)接種到生根培養(yǎng)基上，7-15天后叢芽生根。光照時(shí)間12小時(shí)/日，光照強(qiáng)度 800-20001UX。所述預(yù)分化培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加KT(2_5mg/L)、6-BA(2_5mg/ L)、卡拉膠(8-10g/L)。分化培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加卡拉膠(8-10g/L)。生根培 養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加NAA(l-5mg/L)、卡拉膠(8-10g/L)。(4)壯苗與移栽將生根的再生竹株移栽到壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-15天；開(kāi)瓶煉苗 2-3天；取出小苗清洗根部培養(yǎng)基；再用低濃度高錳酸鉀溶液清洗根部；然后將小苗栽植到 滅菌的介質(zhì)中，遮陰散射光培養(yǎng)一個(gè)月后多數(shù)幼苗成活。所述的壯苗培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基 為基礎(chǔ)，添加 NAA (2-5mg/L)、BA (2_5mg/L)、卡拉膠(8-lOg/L)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合孝順竹(Bambusa multiplex)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。(1)挑選飽滿健康種實(shí)，先用75% (ν/ν)乙醇處理1分鐘，再用0. 1% (w/v)升汞 (每升56滴吐溫-80)浸泡15分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗4次，再用無(wú)菌紙吸干種實(shí)表面水分 后待接種。(2)愈傷組織誘導(dǎo)與增殖將消毒后的外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培 養(yǎng)7天使愈傷組織形成；然后將色澤淡黃致密的愈傷組織分離出來(lái)，接種到繼代增殖培養(yǎng) 基上暗培養(yǎng)18天。所述誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基是以NB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加2，4-D(4mg/L)、卡 拉膠(8g/L)、脯氨酸(500mg/L)、谷氨酰胺(500mg/L)、水解酪蛋白(300mg/L)。(3)愈傷組織分化與生根將繼代增殖培養(yǎng)后的愈傷組織接種到預(yù)分化培養(yǎng)基 上培養(yǎng)7天；然后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天；待愈傷組織產(chǎn)生0. 1-1. 5cm叢芽后將叢 芽切割下來(lái)接種到生根培養(yǎng)基上，7-15天后叢芽生根。光照時(shí)間12小時(shí)/日，光照強(qiáng)度 800-20001UX。所述預(yù)分化培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加KT(3mg/L)、6_BA(3mg/L)、卡 拉膠(10g/L)。分化培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加卡拉膠(10g/L)。生根培養(yǎng)基以MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加NAA(2mg/L)、卡拉膠(10g/L)。(4)壯苗與移栽將生根的再生竹株移栽到壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-15天；開(kāi)瓶煉苗 2-3天；取出小苗清洗根部培養(yǎng)基；再用低濃度高錳酸鉀溶液清洗根部；然后將小苗栽植到 滅菌的介質(zhì)中(山地黃壤土 蛭石泥炭土 = 1:1: 1)，遮陰散射光培養(yǎng)一個(gè)月后多數(shù) 幼苗成活。所述的壯苗培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加NAA(3mg/L)、BA(3mg/L)、卡拉膠 (10g/L)。
權(quán)利要求
孝順竹(Bambusa multiplex)高效穩(wěn)定再生體系建立的方法，其特征包括外植體消毒、愈傷組織誘導(dǎo)與增殖、愈傷組織分化與生根、以及壯苗移栽過(guò)程，具體步驟如下(1)外植體消毒選擇健康飽滿的種實(shí)先用75％(v/v)乙醇處理1分鐘；再用0.1％(w/v)升汞(每升加5-6滴吐溫-80)浸泡15分鐘；然后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次；最后用無(wú)菌紙吸干種實(shí)表面水分后待接種。(2)愈傷組織誘導(dǎo)與增殖將消毒后的外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3-14天使愈傷組織形成；然后將色澤淡黃致密的愈傷組織分離出來(lái)接種到繼代增殖培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)14-21天。所述誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基是以NB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加2，4-D(2-10mg/L)、卡拉膠(8-10g/L)、脯氨酸(400-600mg/L)、谷氨酰胺(400-600mg/L)、水解酪蛋白(200-400mg/L)。(3)愈傷組織分化與生根將繼代增殖培養(yǎng)后的愈傷組織接種到預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-7天；然后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-30天；待愈傷組織產(chǎn)生0.1-1.5cm叢芽后將叢芽切割下來(lái)接種到生根培養(yǎng)基上，7-15天后叢芽生根。光照時(shí)間12小時(shí)/日，光照強(qiáng)度800-2000lux。所述預(yù)分化培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加KT(2-5mg/L)、6-BA(2-5mg/L)、卡拉膠(8-10g/L)。分化培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加卡拉膠(8-10g/L)。生根培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加NAA(1-5mg/L)、卡拉膠(8-10g/L)。(4)壯苗與移栽將生根的再生竹株移栽到壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-15天；開(kāi)瓶煉苗2-3天；取出小苗清洗根部培養(yǎng)基；再用低濃度高錳酸鉀溶液清洗根部；然后將小苗栽植到滅菌的介質(zhì)中，遮陰散射光培養(yǎng)一個(gè)月后多數(shù)幼苗成活。所述的壯苗培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加NAA(2-5mg/L)、BA(2-5mg/L)、卡拉膠(8-10g/L)。
全文摘要
孝順竹高效穩(wěn)定再生體系建立的方法，其特征包括外植體消毒、愈傷組織誘導(dǎo)與增殖、愈傷組織分化與生根、以及壯苗移栽過(guò)程。本發(fā)明解決了孝順竹(Bambusa multiplex)通過(guò)愈傷組織再生植株的困難問(wèn)題，將為叢生竹生物技術(shù)育種提供技術(shù)平臺(tái)。本發(fā)明涉及林木生物技術(shù)和組織培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及孝順竹高效穩(wěn)定再生體系的建立。
文檔編號(hào)A01G31/00GK101822212SQ20091009629
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者岳晉軍, 袁金玲, 顧小平 申請(qǐng)人:顧小平;袁金玲;岳晉軍