專(zhuān)利名稱：一種用于卵周隙內(nèi)注射慢病毒生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因羊的生產(chǎn)，尤其是在卵周隙內(nèi)注射慢病毒生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，采用該法可有效提高胚胎存活率和轉(zhuǎn)基因率。

背景技術(shù)：
通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法獲得的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。慢病毒(lentivirus，LV)是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的病毒成員。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因法有反轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細(xì)胞法、精子載體法、生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染法、細(xì)胞核移植法、原核顯微注射法，但這幾種方法都存在著轉(zhuǎn)基因率低、成本高的缺陷。因?yàn)榕c傳統(tǒng)的原核顯微注射技術(shù)相比，卵周隙注射不需要將注射針插入核內(nèi)，也不受不同種內(nèi)動(dòng)物原核的大小和核膜的清晰度差異的所限。文獻(xiàn)檢索披露1.TransgenicRes(2007)16661-664，作者William A.Ritchie等發(fā)表的《用低滴度慢病毒生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因鼠》的文章，揭示卵周隙內(nèi)反復(fù)注射低滴度病毒(107TU/ml)比單次注射病毒生產(chǎn)出的胚胎陽(yáng)性率為23％∶1％。2.FEBS 571(2004)233-236，作者C.Bruce A.Whitelaw等發(fā)表的《用EIAV病毒衍生的帶菌體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬》的文章，揭示在受精卵卵周隙內(nèi)注射EIAV病毒，將胚胎移植給受體，出生的小豬中92％為陽(yáng)性。3.Biology of reproduction 71，405-409(2004)，作者AndreasHofmann等發(fā)表的《通過(guò)注射慢病毒生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因?！返奈恼拢沂驹谑芫崖阎芟秲?nèi)注射病毒質(zhì)粒，出生的4只牛犢都不是轉(zhuǎn)基因；在卵周隙內(nèi)注射慢病毒，體外受精后囊胚中的83％為陽(yáng)性。4.2007年9月23卷5期《生物工程學(xué)報(bào)》上馬強(qiáng)等人發(fā)表的《一種新型慢病毒載體制備方法的建立》的文章，揭示將構(gòu)建好的主框架質(zhì)粒pVECRNA、pGAGPOL及包膜質(zhì)粒pVSVG通過(guò)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染至BHK21細(xì)胞，再用含有T7RNA聚合酶基因的重組痘苗病毒vTF-3感染細(xì)胞，培養(yǎng)4天后，提取培養(yǎng)上清的RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；通過(guò)熒光顯微鏡觀察到感染組293T細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、Vero細(xì)胞，說(shuō)明此系統(tǒng)制備出的慢病毒載體具有感染性等等。上述已有方法用于轉(zhuǎn)基因牛和豬的生產(chǎn)，但很少有用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的報(bào)道。本發(fā)明以此為切入點(diǎn)，展開(kāi)的研究方法具有科學(xué)性與實(shí)踐性。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于用于卵周隙內(nèi)注射慢病毒生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，提高羊的轉(zhuǎn)基因率，降低轉(zhuǎn)基因羊的生產(chǎn)成本。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種用于卵周隙內(nèi)注射慢病毒生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，將慢病毒載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染為293T細(xì)胞，至48小時(shí)后離心，得慢病毒的濃縮液，將其注射于成熟24-25小時(shí)的卵母細(xì)胞卵周隙內(nèi)，與精子結(jié)合實(shí)施體外受精，12小時(shí)后置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)，48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)卵裂率和轉(zhuǎn)基因率； 其一，取綿羊卵巢，用生理鹽水滅菌清洗3-4次，抽取卵母細(xì)胞，用體外成熟液洗滌3-4次，按25-30枚/滴入前2小時(shí)平衡好的體積為75-78μl/滴的體外成熟培養(yǎng)液滴，放入CO2箱，在5％CO2，95％空氣條件下培養(yǎng)； 其二，將體外成熟24-25小時(shí)的卵母細(xì)胞取出，用0.1％的透明質(zhì)酸酶處理30-60s，經(jīng)吹吸，脫去卵丘細(xì)胞；將慢病毒注射入卵母細(xì)胞卵周隙內(nèi)，用體外受精液洗滌2-4次，按25-30枚/滴的密度加入前2小時(shí)平衡好的50-70μl的受精液內(nèi)；用水浴解凍精液，移入2小時(shí)前平衡好的裝有受精液的試管內(nèi)，放入CO2箱，上游20-25分鐘，取上清，以1500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心4-5分鐘棄去上清液，用剩余的精子沉淀進(jìn)行密度計(jì)算，按2-4×106個(gè)/ml的密度加入受精液滴，與處理好的卵母細(xì)胞共同孵育； 其三，將受精12-18小時(shí)后的卵取出，移至平衡好的體外培養(yǎng)液內(nèi)，洗滌3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)。
所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，藥劑的配制 抽卵液TCM199-hepes+1mg/mlPVA+0.7mg/ml肝素鈉； 成熟液TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸鈉+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml雙抗； 顯微操作液PBS+10％FBS； SOF6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6ul/ml乳酸鈉+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸鈉+0.299mg/mlCaCL2·2H2O； 受精液SOF+20％發(fā)情羊血清(自制)+6IU/ml肝素鈉+100IU/ml慶大霉素； 培養(yǎng)液SOF+3mg/ml BSA。
所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，慢病毒在轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞時(shí)，采用細(xì)胞儀檢測(cè)，滴度達(dá)到1.5×109tu/ml。
所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，采羊的靜脈血，放置4℃冰箱內(nèi)冷凍24小時(shí)，將析出的血清放在56℃水浴鍋內(nèi)滅活30-33分鐘，即得發(fā)情羊血清。
所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，在抽取卵母細(xì)胞前，先吸入1毫升吸卵液備用。
所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，選用配制藥品的原料，除自制外，均為市售產(chǎn)品。
本發(fā)明采用的卵周隙注射不需要將注射針插入核內(nèi)，也不受不同種內(nèi)動(dòng)物原核的大小和核膜的清晰度差異的所限，而且操作簡(jiǎn)單，注射對(duì)核膜和胞膜均無(wú)損傷，胚胎存活率明顯升高。據(jù)報(bào)道，小鼠采用卵周隙內(nèi)注射慢病毒胚胎的轉(zhuǎn)基因率比原核顯微注射法轉(zhuǎn)基因率約高8倍，生仔鼠的轉(zhuǎn)基因率提高約4倍。
本發(fā)明方法以48小時(shí)后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，驗(yàn)證其技術(shù)效果 (1)卵母細(xì)胞受精前、后注射卵裂率、陽(yáng)性率的比較，見(jiàn)表1。
表1 上述結(jié)果說(shuō)明受精前后注射慢病毒濃縮液，不影響其后期發(fā)育和陽(yáng)性率。
(2)受精后胚胎不同發(fā)育階段注射陽(yáng)性率的比較，見(jiàn)表2。
表2 上述結(jié)果說(shuō)明受精后不同時(shí)期的胚胎注射慢病毒濃縮液，不影響其后期發(fā)育和基因的表達(dá)。
(3)不同發(fā)育時(shí)期注射陽(yáng)性率與強(qiáng)弱比的比較，見(jiàn)表3。
表3 上述結(jié)果說(shuō)明隨著胚胎的發(fā)育，注射慢病毒后，陽(yáng)性率、熒光強(qiáng)度有逐漸下降的趨勢(shì)，所以，在轉(zhuǎn)基因羊生產(chǎn)上，盡量選用4細(xì)胞期之前的胚胎。
(4)成熟24小時(shí)后的卵母細(xì)胞注射不同量的病毒的比較，見(jiàn)表4。
表4 上述結(jié)果說(shuō)明注射量在50-100pl之間，不影響囊胚率、陽(yáng)性率和基因表達(dá)的強(qiáng)度。
本發(fā)明采用此方法，將慢病毒濃縮液注射過(guò)的綿羊受精胚胎移植給受體，懷孕35天后，破腹產(chǎn)取出胎兒，用于檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)，在胎兒的頭、踢、內(nèi)臟等器官上都發(fā)現(xiàn)有綠色熒光蛋白，證明此胎兒為轉(zhuǎn)基因綿羊。
本方法慢病毒的制備，將慢病毒載體與病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，滴度達(dá)到1.5×109tu/ml，48小時(shí)后收集上清超速離心，進(jìn)行病毒濃縮。
本發(fā)明構(gòu)思與實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因綿羊生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)，將慢病毒濃縮液注射過(guò)的綿羊受精胚胎移植給受體，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有綠色熒光蛋白，表達(dá)了轉(zhuǎn)基因羊的生命體征，彰顯技術(shù)進(jìn)步。



圖1為綿羊卵母細(xì)胞卵周隙注射慢病毒后體外發(fā)育的囊胚放大200倍顯微鏡片。
圖2為圖1所對(duì)應(yīng)的囊胚經(jīng)過(guò)藍(lán)光照射后發(fā)出的綠色熒光放大200倍顯微鏡片。
圖3為經(jīng)過(guò)慢病毒注射后的胚胎移植給受體，懷孕35天后破腹產(chǎn)取出一只胎兒頭組織的切片。
圖4為經(jīng)過(guò)慢病毒注射后的胚胎移植給受體，懷孕35天后破腹產(chǎn)取出一只胎兒頭組織的切片，部分組織經(jīng)過(guò)藍(lán)光照射激發(fā)后發(fā)出的綠色熒光。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式。
實(shí)施例 實(shí)驗(yàn)藥劑的配制 抽卵液TCM199-hepes+1mg/mlPVA+0.7mg/ml肝素鈉； 成熟液TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸鈉+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml雙抗； 顯微操作液PBS+10％FBS； SOF6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml4KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6ul/ml乳酸鈉+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸鈉+0.299mg/mlCaCL2·2H2O； 受精液SOF+20％發(fā)情羊血清(自制)+6IU/ml肝素鈉+100IU/ml慶大霉素； 培養(yǎng)液SOF+3mg/mlBSA。
發(fā)情羊血清制備采羊的靜脈血，放置4℃冰箱內(nèi)冷凍24小時(shí)，將析出的血清放在56℃水浴鍋內(nèi)滅活30-33分鐘，即得。
技術(shù)操作 將慢病毒載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染為293T細(xì)胞，至48小時(shí)后離心，得慢病毒的濃縮液，將其注射于成熟25小時(shí)的卵母細(xì)胞卵周隙內(nèi)，與精子結(jié)合實(shí)施體外受精，12小時(shí)后置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)，48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)卵裂率和轉(zhuǎn)基因率； 取綿羊卵巢，用生理鹽水滅菌清洗3次，抽取卵母細(xì)胞(先吸入1毫升吸卵液)，用體外成熟液洗滌4次，按28枚/滴入前2小時(shí)平衡好的體積為75μl/滴的體外成熟培養(yǎng)液滴，放入CO2箱，在5％CO2，95％空氣條件下培養(yǎng)； 將體外成熟25小時(shí)的卵母細(xì)胞取出，用0.1％的透明質(zhì)酸酶處理50s，經(jīng)吹吸，脫去卵丘細(xì)胞；將慢病毒注射入卵母細(xì)胞卵周隙內(nèi)，用體外受精液洗滌2-4次，按28枚/滴的密度加入前2小時(shí)平衡好的70μl的受精液內(nèi)；用水浴解凍精液，移入2小時(shí)前平衡好的裝有受精液的試管內(nèi)，放入CO2箱，上游25分鐘，取上清，以1500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心4分鐘棄去上清液，用剩余的精子沉淀進(jìn)行密度計(jì)算，按3×106個(gè)/ml的密度加入受精液滴，與處理好的卵母細(xì)胞共同孵育； 將受精16小時(shí)后的卵取出，移至平衡好的體外培養(yǎng)液內(nèi)，洗滌3次，按70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種用于卵周隙內(nèi)注射慢病毒生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，其特征在于將慢病毒載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染為293T細(xì)胞，至48小時(shí)后離心，得慢病毒的濃縮液，將其注射于成熟24-25小時(shí)的卵母細(xì)胞卵周隙內(nèi)，與精子結(jié)合實(shí)施體外受精，12小時(shí)后置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)，48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)卵裂率和轉(zhuǎn)基因率；
其一，取綿羊卵巢，用生理鹽水滅菌清洗3-4次，抽取卵母細(xì)胞，用體外成熟液洗滌3-4次，按25-30枚/滴入前2小時(shí)平衡好的體積為75-78μl/滴的體外成熟培養(yǎng)液滴，放入CO2箱，在5％CO2，95％空氣條件下培養(yǎng)；
其二，將體外成熟24-25小時(shí)的卵母細(xì)胞取出，用0.1％的透明質(zhì)酸酶處理30-60s，經(jīng)吹吸，脫去卵丘細(xì)胞；將慢病毒注射入卵母細(xì)胞卵周隙內(nèi)，用體外受精液洗滌2-4次，按25-30枚/滴的密度加入前2小時(shí)平衡好的50-70μl的受精液內(nèi)；用水浴解凍精液，移入2小時(shí)前平衡好的裝有受精液的試管內(nèi)，放入CO2箱，上游20-25分鐘，取上清，以1500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心4-5分鐘棄去上清液，用剩余的精子沉淀進(jìn)行密度計(jì)算，按2-4×106個(gè)/ml的密度加入受精液滴，與處理好的卵母細(xì)胞共同孵育；
其三，將受精12-18小時(shí)后的卵取出，移至平衡好的體外培養(yǎng)液內(nèi)，洗滌3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)。
2.按照權(quán)利要求1所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，其特征在于藥劑的配制
抽卵液TCM199-hepes+1mg/mlPVA+0.7mg/ml肝素鈉；
成熟液TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸鈉+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml雙抗；
顯微操作液PBS+10％FBS；
SOF6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6ul/ml乳酸鈉+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸鈉+0.299mg/mlCaCL2·2H2O；
受精液SOF+20％發(fā)情羊血清(自制)+6IU/ml肝素鈉+100IU/ml慶大霉素；
培養(yǎng)液SOF+3mg/ml BSA。
3.按照權(quán)利要求1所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，其特征在于慢病毒在轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞時(shí)，采用細(xì)胞儀檢測(cè)，滴度達(dá)到1.5×109tu/ml。
4.按照權(quán)利要求1所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，其特征在于采羊的靜脈血，放置4℃冰箱內(nèi)冷凍24小時(shí)，將析出的血清放在56℃水浴鍋內(nèi)滅活30-33分鐘，即得發(fā)情羊血清。
5.按照權(quán)利要求1所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，其特征在于在抽取卵母細(xì)胞前，先吸入1毫升吸卵液備用。
6.按照權(quán)利要求1所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，其特征在于選用配制藥品的原料，除自制外，均為市售產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于卵周隙內(nèi)注射慢病毒生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的方法，將慢病毒載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染為293T細(xì)胞，至48小時(shí)后離心，得慢病毒的濃縮液，將其注射于成熟24-25小時(shí)的卵母細(xì)胞卵周隙內(nèi)，與精子結(jié)合實(shí)施體外受精，12小時(shí)后置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)，48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)卵裂率和轉(zhuǎn)基因率。其一取卵母細(xì)胞用體外成熟液洗滌3-4次，按25-30枚/滴入體積75-78μl/滴的體外成熟培養(yǎng)液，在5％CO2、95％下培養(yǎng)；其二體外成熟的卵母細(xì)胞脫去卵丘細(xì)胞，慢病毒注射入細(xì)胞卵周隙內(nèi)，用體外受精液洗滌2-4次，按25-30枚/滴入受精液內(nèi)；解凍精液，移入受精液，離心棄上清液，沉淀精子加受精液滴，孵育；取受精12-18小時(shí)的卵，按上步處理后入四孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)即可；其三為藥劑慢病毒液、抽卵液、成熟液、顯微操作液、SOF、受精液、培養(yǎng)液、養(yǎng)血清的必備。
文檔編號(hào)A01K67/027GK101760476SQ20091011356
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者黃俊成, 汪立芹, 劉明軍, 趙云程, 陳童, 林嘉鵬, 王靜 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院中國(guó)—澳大利亞綿羊育種研究中心