專利名稱：一種竹子種胚培養(yǎng)的消毒方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，特別涉及種胚培養(yǎng)快速繁殖的方法，確 切地說(shuō)是一種竹子種胚培養(yǎng)的消毒方法。
二背景技術(shù)：
竹子是森林資源之一。全世界竹類植物約有70多屬1200多種，主要分布在熱帶及亞熱 帶地區(qū)，少數(shù)竹類分布在溫?zé)釒Ш秃畮?。竹子是常綠(少數(shù)竹種在旱季落葉)淺根性植物， 對(duì)水熱條件要求高，而且非常敏感，地球表面的水熱分布支配著竹子的地理分布。東南亞位 于熱帶和南亞熱帶，又受太平洋和印度洋季風(fēng)匯集的影響，雨量充沛，熱量穩(wěn)定，是竹子生 長(zhǎng)理想的生態(tài)環(huán)境，也是世界竹子分布的中心。中國(guó)竹類資源十分豐富，有適于熱帶生長(zhǎng)的 合軸型叢生竹種、亞熱帶生長(zhǎng)的單軸型散生竹種和高海拔高緯度地區(qū)生長(zhǎng)的耐寒性強(qiáng)的復(fù)軸 型混生竹種。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國(guó)竹類植物共有48個(gè)屬，500多種。這些竹種分布在北緯 40°以南的廣大國(guó)土上。由于各地氣候、土壤、地形的變化和竹種本身種屬特性的差異，中 國(guó)竹子分布具有明顯的地帶性和其區(qū)域性。竹子生長(zhǎng)快，適應(yīng)性強(qiáng)，同時(shí)又具有廣泛的用途。 竹子與人民生活息息相關(guān)，竹子的利用涉及衣、食、住、行用各方面，竹子用于建筑的歷史 久遠(yuǎn)，在遠(yuǎn)古時(shí)代，人類從巢居和穴居向地面房居演進(jìn)的過(guò)程，竹子就發(fā)揮了重要的作用。 竹材具有強(qiáng)度大、彈性大、耐磨損、耐腐蝕、抗彎曲等特性，與木材相比具有硬度強(qiáng)、穩(wěn)定 性高、膠合度好、外觀美麗等優(yōu)點(diǎn)。全世界年產(chǎn)竹材有1500多萬(wàn)噸，除傳統(tǒng)的用于建房、 制造家具和工藝品外，主要用于制造竹質(zhì)人造板和高級(jí)竹制紙，其需求與日俱增；竹筍是極 受人們喜愛(ài)的美味山珍，其富含多種氨基酸和人體必須的微量元素，是天然的保健品，也已 成為竹資源開發(fā)利用的一大支柱產(chǎn)品；竹子還是四季常青的長(zhǎng)綠物種，具有調(diào)節(jié)氣候、涵養(yǎng) 水源、保持水土、減弱噪音、凈化空氣、防止風(fēng)害的作用，備受人們的青睞，古今人們都不 得取之以保護(hù)和美化人類的生活環(huán)境。由上可見，竹在人們的日常生活領(lǐng)域中作出了極為重 要的貢獻(xiàn)，展示了竹文明的風(fēng)采。因此，竹與人類生活的關(guān)系，正如蘇東坡所述"食者竹 筍，居者竹瓦，載者竹筏，炊者竹薪，衣者竹皮，書者竹紙，履者竹鞋，真可謂不可一日無(wú) 此君也。"因此對(duì)優(yōu)良竹種進(jìn)行快速繁對(duì)開發(fā)和利用寶貴的竹資源具有重要的意義。
慈竹(^woca/zm^fl^m'sf^e^/^Mcc/we)又名義竹、慈孝竹、子母竹。屬于禾木科竹亞 科(Sflw6wflcfe"J慈竹屬，為地下蓮合軸叢生型，廣泛地分布于地球的北緯46°至南緯 47°之間的熱帶，亞熱帶和暖溫帶地區(qū)。它是我國(guó)西南地區(qū)栽培較廣、用途較大、經(jīng)濟(jì)價(jià)值 較高的材用竹種，稈高一般10-15m，最高20m，胸徑一般4-6cm，最粗llcm，節(jié)間長(zhǎng)一般5-50cm，最長(zhǎng)130cm。其纖維素含量多，達(dá)52%以上；纖維長(zhǎng)度大，纖維長(zhǎng)寬比較大，分子 聚合度相對(duì)較高，且其產(chǎn)量高，最高年產(chǎn)達(dá)45000kg. hnT2，是優(yōu)秀的制漿造紙、竹纖維和竹 編膠合板用竹。適應(yīng)性廣，能耐-6 -8'C的低溫。它是很有前途的竹種之一。鑒于傳統(tǒng)繁殖 主要是采用埋竹節(jié)或或枝條扦插等方法，但1條竹節(jié)或1粒種子只產(chǎn)生1株竹苗。另外許多 種的竹枝扦插生根困難，其繁殖速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)的需要，又需耗費(fèi)大量人力物力。利 用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行竹子的快速繁殖是解決這一問(wèn)題的最佳途徑。
關(guān)于組織培養(yǎng)，自1968年Alexander和Rao關(guān)于成熟種胚離體培養(yǎng)的報(bào)道。此后，對(duì)于 竹類植物的離體快繁研究?jī)?nèi)容層出不窮，對(duì)于竹類植物的快速繁殖技術(shù)逐漸受到重視。近年 來(lái)，就目前已有的報(bào)道來(lái)看，不少關(guān)于竹類組織培養(yǎng)的最新報(bào)道都將側(cè)重點(diǎn)放在了愈傷組織 誘導(dǎo)進(jìn)而得到植株再生方面，其中也不乏通過(guò)愈傷組織實(shí)現(xiàn)器官發(fā)生進(jìn)而實(shí)現(xiàn)植株再生的。 用種胚培養(yǎng)過(guò)程中，若種子消毒不徹底會(huì)引起細(xì)菌污染，在初代培養(yǎng)中，表面細(xì)菌引起的污 染通常在2 3d就能在外植體周圍或培養(yǎng)基表面形成明顯的如水污狀、油污狀、氣泡或干縮 的紅、黃、乳白等顏色的菌落。若在外植體培養(yǎng)后3 5d內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染，以后則不斷 出現(xiàn)明顯的或不明顯的細(xì)菌菌落，就可能是由內(nèi)生細(xì)菌引起的污染。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種通過(guò)種胚培養(yǎng)、快速繁殖優(yōu)良竹種的方法，所要解決的技術(shù)問(wèn)題是 外植體的消毒問(wèn)題以提高無(wú)菌苗的成活率。
本發(fā)明所稱的竹子種胚培養(yǎng)是以竹子當(dāng)年生健康種子為外植體，所謂健康種子是指籽粒 飽滿、色澤鮮亮，且無(wú)病蟲害的種子，其消毒方法就是對(duì)剝?nèi)シN殼后的籽粒在組織培養(yǎng)之前 所進(jìn)行的無(wú)菌化處理方法，包括剝殼、浸泡、分離和洗滌，所述的浸泡就是將剝?nèi)シN殼的籽 粒首先于醫(yī)用酒精中浸泡4 6min，分離，無(wú)菌水洗滌；然后再于0. lwt. %(重量百分濃度， 以wt. %表示)升汞溶液中攪拌25 35min或者于有效氯含量為0. 2 0. 3wt. %次氯酸鈉溶液中 攪拌10 20min，分離，無(wú)菌水洗滌；最后用醫(yī)用酒精浸泡4 6min，分離，無(wú)菌水洗滌， 用無(wú)菌紙吸干水分后接種于培養(yǎng)基上。醫(yī)用酒精就是濃度為70%的消毒酒精。
為提高無(wú)菌苗的成活率，也可以使用以下消毒方法，先用醫(yī)用酒精浸泡4 6min，分離， 無(wú)菌水洗滌；次用0.2 0.3wtJ次氯酸鈉溶液攪拌15 30min，分離，無(wú)菌水洗滌；最后用 0.1wtJ升汞溶液攪拌25 35min，分離，無(wú)菌水洗滌，用無(wú)菌紙吸干水分后接種與培養(yǎng)基 上。
這種方法可將無(wú)菌苗提高到80%以上。 優(yōu)選使用有效氯含量為0. 25wt. %次氯酸鈉溶液。無(wú)菌苗>90%以上的消毒方法是將剝?nèi)シN殼的籽粒首先用有效氯含量為0. 2 0. 3wt. %次 氯酸鈉溶液攪拌10 20min，分離，無(wú)菌水洗滌；次用0. 05 0. 15wt. %高錳酸鉀 溶液浸泡10 14小時(shí)，其間每隔兩小時(shí)更換一次新鮮的高錳酸鉀溶液，分離，無(wú)菌水洗滌； 再用醫(yī)用酒精攪拌3 8min,分離，無(wú)菌水洗滌；最后于0. lwt. %升汞溶液中攪拌25 35min, 分離，無(wú)菌水洗滌，用無(wú)菌紙吸干水分后接種于培養(yǎng)基上。
本消毒方法簡(jiǎn)單，可有效去除表面細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌。為建立無(wú)菌體系、促進(jìn)繼代培養(yǎng)和 生根奠定基礎(chǔ)，從而提高種胚培養(yǎng)的成活率，為開發(fā)利用優(yōu)良竹種提供技術(shù)保證。具體實(shí)施例方式
現(xiàn)以慈竹為例，非限定實(shí)施例敘述如下
1、 種子經(jīng)表面清潔后，挑選色澤鮮亮、顆粒飽滿、無(wú)病蟲害的種子，剝掉種殼，將籽
粒在超凈工作臺(tái)上用70%酒精浸泡5min (不斷攪拌)，無(wú)菌水沖洗5次，再用0. 1%的升汞溶 液浸泡30min (不斷攪拌)，無(wú)菌水沖洗5次。用無(wú)菌紙吸干水后接種于培養(yǎng)基上。
2、 種子經(jīng)表面清潔后，挑選色澤鮮亮、顆粒飽滿、無(wú)病蟲害的種子，剝掉種殼，將籽 粒在超凈工作臺(tái)上用70%酒精浸泡5min(不斷攪拌)無(wú)菌水沖洗5次，再用0.2%次氯酸鈉浸 泡15min (不斷攪拌)，無(wú)菌水沖洗5次，再用70%酒精浸泡5min (不斷攪拌)，無(wú)菌水沖 洗5次。用無(wú)菌紙吸干水后接種于培養(yǎng)基上。
3、 種子經(jīng)表面清潔后，挑選色澤鮮亮、顆粒飽滿、無(wú)病蟲害的種子，剝掉種殼，將籽 粒在超凈工作臺(tái)上用70Q/。酒精浸泡5min (不斷攪拌)，無(wú)菌水沖洗5~8次，再用有效氯含量 為2.5%的次氯酸鈉溶液浸洗15 30min，無(wú)菌水沖洗5~8次，再用0.1%的升汞溶液浸泡30min
(不斷攪拌)，無(wú)菌水沖洗5 8次，用無(wú)菌紙吸干水后接種于培養(yǎng)基上。
4、 種子經(jīng)表面清潔后，挑選色澤鮮亮、顆粒飽滿、無(wú)病蟲害的種子，剝掉種殼，將籽 粒用有效氯含量為2.5%的次氯酸鈉溶液浸洗15min，無(wú)菌水沖洗5~8次，再用0.1%高錳酸 鉀浸泡12小時(shí)，其間每隔2小時(shí)換高錳酸鉀溶液一次，然后在超凈工作臺(tái)上用70%酒精浸 泡5min (不斷攪拌)，無(wú)菌水沖洗5~8次，再用0.1%的升汞溶液浸泡30min (不斷攪拌)， 無(wú)菌水沖洗5 8次，用無(wú)菌紙吸干水后接種于培養(yǎng)基上。
權(quán)利要求
1、一種竹子種胚培養(yǎng)的消毒方法，以竹子當(dāng)年生健康種子為外植體，包括剝殼、浸泡、分離和洗滌，其特征在于將籽粒于醫(yī)用酒精中浸泡4～6min，然后再于0.1wt.％升汞溶液中攪拌25～35min或者0.2～0.3wt.％次氯酸鈉溶液中攪拌10～20min，最后用醫(yī)用酒精浸泡4～6min。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的消毒方法，其特征在于將籽粒于醫(yī)用酒精中浸泡4 6min 后依次用0. 2 0. 3wt. %次氯酸鈉溶液攪拌15 30min和0. lwt. %升汞溶液攪拌25 35min。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的消毒方法，其特征在于用0. 25wt. %次氯酸鈉溶液攪拌 20min。
4、 一種竹子種胚培養(yǎng)的消毒方法，以竹子當(dāng)年生健康種子為外植體，包括剝殼、浸泡、 分離和洗滌，其特征在于將籽粒首先用0.2 0.3wtJ次氯酸鈉溶液攪拌10 20min，次用 0.05 0. 15wtJ高錳酸鉀溶液浸泡10 14小時(shí)，其間每隔兩小時(shí)換一次新鮮的高錳酸鉀溶 液，再用醫(yī)用酒精攪拌3 8min，最后于0. lwt. %升汞溶液中攪拌25 35min。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的消毒方法，其特征在于用0.25wt.y。次氯酸鈉溶液攪拌10 20min。
6、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的消毒方法，其特征在于用0. lwt. %高錳酸鉀溶液浸泡12 小時(shí)，其間每隔兩小時(shí)換一次新鮮的高錳酸鉀溶液。
全文摘要
一種竹子種胚培養(yǎng)的消毒方法，以竹子當(dāng)年生健康種子為外植體，將剝殼后的籽粒于醫(yī)用酒精中浸泡4～6min，然后再于0.1wt.％升汞溶液中攪拌25～35min或者0.2～0.3wt.％次氯酸鈉溶液中攪拌10～20min，最后用醫(yī)用酒精浸泡4～6min。本消毒方法簡(jiǎn)單，可有效去除表面細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌，為建立無(wú)菌體系、促進(jìn)繼代培養(yǎng)和生根奠定基礎(chǔ)，為開發(fā)利用優(yōu)良竹種提供技術(shù)特征。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101444188SQ20091011605
公開日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2009年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日
發(fā)明者卞林玲, 夏登云, 沈周高, 艷 項(xiàng), 健 高 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);國(guó)際竹藤網(wǎng)絡(luò)中心