專利名稱：一種無核葡萄試管苗煉苗移栽技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控植物營(yíng)養(yǎng)
器官的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，涉及一種在幼胚出苗后，長(zhǎng)出4 5片葉后，即可進(jìn)行 煉苗和移栽的一種煉苗移栽技術(shù)，利用本發(fā)明的技術(shù)方法，成功地克服了無 核葡萄育種中試管苗向露地苗過渡時(shí)適應(yīng)性的困難，突破了無核葡萄新品種 培育的瓶頸，使珍貴難得的育種材料向大田定植的重要保證，是高效無核葡 萄育種技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
背景技術(shù)：
授權(quán)公告號(hào)CN100391333C、名稱"安祖花無菌苗組織培養(yǎng)和試管苗煉苗 移栽技術(shù)"，選用幼嫩組織誘導(dǎo)出來的少量無菌苗莖段作為外植體，接種在I、 II、 III號(hào)培養(yǎng)基上，同步誘導(dǎo)出愈傷組織、側(cè)芽、不定根；試管苗不必另 行壯苗生根，長(zhǎng)至2-3cm高時(shí)即可切取，然后用藥#」浸泡處理移栽，轉(zhuǎn)入煉 苗室，移栽成活率達(dá)95%以上。
曹孜義等(1992)曾報(bào)道了試管苗在移栽過程中氣孔開度的變化以及葡萄 試管苗在移栽過程中葉解剖結(jié)構(gòu)和根系活力的變化，柴慈江、張磊等(1998) 也報(bào)道過開瓶煉苗對(duì)葡萄試管苗氣孔開度及移栽的影響。

發(fā)明內(nèi)容
設(shè)計(jì)目的設(shè)計(jì)一種無核葡萄在幼胚出苗后且長(zhǎng)出4 5片葉后，即可進(jìn)
行煉苗和移栽的一種煉苗移栽技術(shù)。設(shè)計(jì)方案在利用胚挽救技術(shù)培育無核葡萄新品種的研究中，葡萄幼胚 試管苗移栽是非常重要的環(huán)節(jié)。為此，本申請(qǐng)?jiān)跓捗绾鸵圃苑矫娌捎孟铝屑?術(shù)方案
1、 移栽基質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)液的配制-
選用沙土做為移栽基質(zhì)，將沙和土按1 : 3比例混合裝勻，裝入耐高壓的
塑料袋中，置滅菌鍋中消毒，在l 1.2kg/cm2的壓力下濕熱滅菌20分鐘，取 出備用。營(yíng)養(yǎng)液按2倍濃度配制分別裝于500ml三角瓶中，按基質(zhì)滅菌方法 處理，備用。由于基質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)液都進(jìn)行了滅菌處理，因此，可以有效地防止 移栽苗的死亡，提高移栽成活率。
2、 培養(yǎng)壯苗，選擇適宜的移栽苗齡
以往的快繁育苗是在100-150ml三角瓶中接種3~5株苗，通過這種方法 處理的試管苗長(zhǎng)勢(shì)較弱，移栽成活率也低。為了培育幼胚試管壯苗，改多株 接種為單株接種，以擴(kuò)大試管苗的生長(zhǎng)空間，這樣試管苗的生長(zhǎng)既快又壯， 葉和根系也較發(fā)達(dá)，經(jīng)移栽驗(yàn)證，成活率明顯提高。對(duì)于苗齡的選擇，則從 試管苗木質(zhì)化程度，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)弱、縮短育種周期，提高經(jīng)濟(jì)效益四個(gè)方面綜 合分析，并加以比較，以選擇40~50d苗齡試管苗為宜。此時(shí)苗高5~8cm， 根5條以上，色潔白為佳。
3、 無菌條件下進(jìn)行移栽
將移栽試管苗、無菌基質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)液、和無菌水置于超凈工作臺(tái)上，先用 無菌水將試管苗根部洗干凈，移栽至盛有滅菌基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，用稀釋至標(biāo) 準(zhǔn)濃度的營(yíng)養(yǎng)液澆灌，加蓋1000ml的燒杯，以保持濕度，然后放入培養(yǎng)室 中培養(yǎng)，時(shí)間為15d。
4、 移栽試管苗生長(zhǎng)條件的控制
按照循序漸進(jìn)的原則，在試管苗移栽后的前半個(gè) 內(nèi)，培養(yǎng)室溫度控制在25士2'C;空氣濕度控制在85%以上，并在半個(gè)月內(nèi)逐步降低，濕度變化以 燒杯開口進(jìn)行調(diào)控，光照時(shí)間加長(zhǎng)，由原來的12小時(shí)/日增至16小時(shí)/日， 從而促進(jìn)幼苗的光合作用，完成由半異養(yǎng)型向自養(yǎng)型的過渡。移栽試管苗生 長(zhǎng)半個(gè)月后，其幼苗發(fā)育健壯，生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，適應(yīng)性強(qiáng)，此時(shí)再將其由培養(yǎng) 室條件轉(zhuǎn)移至自然條件下栽培，并按常規(guī)方法進(jìn)行管理，繼續(xù)培養(yǎng)1 2個(gè)月 后便可移入田間定植。 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)
無核葡萄是當(dāng)今世界葡萄消費(fèi)和育種的重要方向之一。無核葡萄胚培養(yǎng) 技術(shù)，無疑使無核葡萄有性雜交組合方式更為豐富，從而大大提高了無核葡 萄品種的選育效果。然而，胚培養(yǎng)無論在技術(shù)和費(fèi)用要求都很高，從胚挽救 到出苗，需時(shí)較長(zhǎng)，而且在此期間嚴(yán)格要求無菌操作及培養(yǎng)，需要很高的專 業(yè)技術(shù)水平的人進(jìn)行這項(xiàng)工作，因而在普及上受到一定的限制。所以試管苗 移栽是葡萄試管苗快速繁殖及離體培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，
試管苗移栽是葡萄試管苗快速繁殖及離體培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。處于弱 光和飽和濕度下生長(zhǎng)的葡萄試管苗，葉片薄，細(xì)胞排列稀疏，并呈單層的小 柵欄細(xì)胞，細(xì)胞間隙大，氣室大，氣孔開口也大，又無關(guān)閉功能，加上葉表 面角質(zhì)層不發(fā)達(dá)，無蠟質(zhì)，移出試管后在低濕下極易失水萎蔫。利用開瓶煉 苗的方式可以使土支撐培養(yǎng)的葡萄試管苗在移栽之前恢復(fù)氣孔的關(guān)閉功能， 這就增強(qiáng)了其地上部分對(duì)低濕環(huán)境的適應(yīng)能力，結(jié)合帶坨移栽即可明顯提高 試管苗的成活率并簡(jiǎn)化移栽程序。
在葡萄移栽過程中發(fā)現(xiàn)若條件合適葡萄試管苗不僅成活率高而且不停頓 的生長(zhǎng)。如果某一種條件不適宜，則成活率大幅度降低，而且緩苗時(shí)間拖長(zhǎng)， 嚴(yán)重影響試管苗生長(zhǎng)。在煉苗移栽過程中，開瓶煉苗結(jié)合光培煉苗，讓上部 葉片逐步由飽和濕度過渡到低濕環(huán)境中使氣孔開度由不能閉合到功能恢復(fù)，直到完全適應(yīng)溫室自然濕度和短時(shí)間的全光照。葡萄試管苗氣孔不能關(guān)閉是 試管苗移栽后易于失水死亡的主要原因之一。開瓶煉苗對(duì)葡萄試管苗氣孔關(guān) 閉功能的恢復(fù)具有明顯的促進(jìn)作用。葡萄試管苗經(jīng)光培煉苗后過渡到沙培煉 苗，這是一個(gè)大的變化。這一步是成活的關(guān)鍵。從試管苗到沙培苗，主要是 適宜性變化。由飽和濕度、異養(yǎng)、莖葉細(xì)嫩向適應(yīng)于自然環(huán)境下過渡。此時(shí) 沙培苗葉面有光澤，直立，莖葉含水量下降，新根大量長(zhǎng)出。
在沙培煉苗和溫室營(yíng)養(yǎng)袋煉苗中可觀察到原有的老葉不斷為新生葉片 代替，其代替進(jìn)程與移栽條件變化若相匹配，就能不停地生長(zhǎng)，若變化太強(qiáng) 太快，原有老葉過早死亡不能為新葉、新根的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，小苗則容易死 亡。若提供營(yíng)養(yǎng)太少，緩苗時(shí)間延長(zhǎng)，這都是沒有充分發(fā)揮原有葉片的作用。 葡萄試管苗直接從莖產(chǎn)生不定根，同田間扦插一樣，不存在維管束不相連的 問題。但試管內(nèi)長(zhǎng)出的根，吸收功能極低，只有在試管外透氣良好的條件下 長(zhǎng)出的根才能有效的吸收。因此在試管苗出瓶后， 一面保濕，恒溫，給予適 度光照，盡量保證原由葉片不萎蔫，同時(shí)盡快促進(jìn)新根生長(zhǎng)，恢復(fù)根的吸收 功能，才能有效的使上部小苗不斷生長(zhǎng)。分步煉苗中，試管苗到沙培苗和沙 培苗到溫室苗是兩個(gè)變化最大的轉(zhuǎn)折。開瓶煉苗結(jié)合帶坨移栽可極大的提高 移栽成活率，保障雜交苗的成活。成活率達(dá)到95%以上。


圖1是煉苗移栽技術(shù)的流程示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:參照附圖1。 一種煉苗移栽技術(shù)，(!)選用沙土做為移栽基質(zhì)，
將沙和土按1 : 3比例混合裝勻，裝入耐高壓的塑料袋中，置滅菌鍋中消毒， 在1 1.2kg/cm2的壓力下濕熱滅菌20分鐘，取出備用；(2)營(yíng)養(yǎng)液按1/4MS附加IBA0.1mg/L濃度配制分別裝于500ml三角瓶中，按基質(zhì)滅菌技術(shù)處理， 備用；(3)選擇30~40d苗齡試管苗、苗高3 5cm、根3~4條；(4)將移栽的 無核白葡萄試管苗、無菌基質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)液、和無菌水置于超凈工作臺(tái)上，先用 無菌水將試管苗根部洗干凈，移栽至盛有滅菌基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，用稀釋至標(biāo) 準(zhǔn)濃度(標(biāo)準(zhǔn)濃度是指1/8MS， IAA0.05mg/L)的營(yíng)養(yǎng)液澆灌，加蓋1000ml 的燒杯，以保持濕度，然后放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)，時(shí)間為半個(gè)月；(5)在試管苗 移栽后的前半個(gè)月內(nèi)，培養(yǎng)室溫度控制在25±2°C;空氣濕度控制在85%以上， 并在半個(gè)月內(nèi)逐步降低，濕度變化以燒杯開口進(jìn)行調(diào)控，光照時(shí)間加長(zhǎng)，由 原來的12小時(shí)/日增至16小時(shí)/日，移栽試管苗生長(zhǎng)半個(gè)月后，其幼苗發(fā)育 健壯，生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，適應(yīng)性強(qiáng)，此時(shí)再將其由培養(yǎng)室條件轉(zhuǎn)移至自然條件下 栽培，并按常規(guī)技術(shù)進(jìn)行管理，繼續(xù)培養(yǎng)1 2個(gè)月后便可移入田間定植。
所述標(biāo)準(zhǔn)濃度營(yíng)養(yǎng)液是指大量元素為KN03 238mg丄"，NH4N03 206 mg.L-1 ， KH2P04 21 mgL-1 ， MgS047H20 46 mgL-1 ， CaCl2.2H20 55 mg.L-1; 微量元素為KI 0.104 mg.L"， H3B03 0.775 mg'L", MnS04'4H20 2.788 mg-L國(guó)1， ZnS04.7 H20 1.075 mg.L-1， Na2Mo04.2 H20 0.0315 mgL-1， CuS04.5 H20 0.0032 mg.L國(guó)1， CoCl2'6 H20 0.0032 mg.L";鐵鹽為Na2-EDTA 4.66 mg.L國(guó)1 ， FeS04-7H20 3.475 mg丄—1。附加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑卩引哚丁酸(IBA) 0.01 mg'I/1。 其余為蒸餾水。
所述的IBA溶液時(shí)按照下列方法配制先配制0.2 mg'mr1 IBA母液。稱 取20mglBA，用2ml稀鹽酸或95。/。乙醇溶液溶解，緩緩加入蒸餾水，不斷 攪拌，以免產(chǎn)生沉淀，定容至100ml，即為0.2mg'ml"IBA母液，4tT冷藏保 存。
所述的營(yíng)養(yǎng)液溶液時(shí)按照下列方法配制
(1)分別按照權(quán)利2的160倍稱取硝酸鉀、硝酸銨、磷酸二氫鉀、7水合硫酸錳鎂.、2水合氯化鈣，分別用蒸餾水溶解，攪拌均勻，按照以上順序緩
緩加入，并用蒸餾水沖洗燒杯2 3遍，不斷攪拌，以免產(chǎn)生沉淀，定容至 1000ml，制成160倍的儲(chǔ)備液I。
(2) 分別按照權(quán)利2的1600倍稱取碘化鉀、硼酸、4水合硫酸錳、7水合 硫酸鋅、2水合鉬酸鈉、5水合硫酸銅、6水合氯化鈷，分別用蒸餾水溶解， 攪拌均勻，按順序緩緩加入，并用蒸餾水沖洗燒杯2 3遍，不斷攪拌，以免 產(chǎn)生沉淀，定容至1000ml，制成1600倍的儲(chǔ)備液I1。
(3) 分別按照權(quán)利2的1600倍稱取Na^EDTA、 7水硫酸亞鐵分別用蒸餾 水加熱溶解，攪拌均勻，將Na^EDTA溶液倒入FeSCV7H20中，并用蒸餾 水沖洗燒杯2 3遍，定容至1000ml，制成1600倍的儲(chǔ)備液III。
(4) 分別量取50ml儲(chǔ)備液I、 5ml儲(chǔ)備液n、 5ml儲(chǔ)備液III、 400pl IBA 母液，混合，加8L水，即配制成8L營(yíng)養(yǎng)液。備用。
需要理解到的是上述實(shí)施例雖然對(duì)本發(fā)明作了比較詳細(xì)的文字描述，但是 這些文字描述，只是對(duì)本發(fā)明設(shè)計(jì)思路的簡(jiǎn)單文字描述，而不是對(duì)本發(fā)明設(shè) 計(jì)思路的限制，任何不超出本發(fā)明設(shè)計(jì)思路的組合、增加或修改，均落入本 發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種無核葡萄試管苗煉苗移栽技術(shù)，其特征是(1)選用沙土做為移栽基質(zhì)，將沙和土按1∶3比例混合裝勻，裝入耐高壓的塑料袋中，置滅菌鍋中消毒，在1～1.2kg/cm2的壓力下濕熱滅菌20分鐘，取出備用；(2)營(yíng)養(yǎng)液按2倍濃度配制，分別裝于500ml三角瓶中，按基質(zhì)滅菌技術(shù)處理，備用；(3)選擇40～50d苗齡試管苗、苗高5～8cm、根5條以上；(4)將移栽試管苗、無菌基質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)液和無菌水置于超凈工作臺(tái)上，先用無菌水將試管苗根部洗干凈，移栽至盛有滅菌基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，用稀釋至標(biāo)準(zhǔn)濃度的營(yíng)養(yǎng)液澆灌，加蓋1000ml的燒杯，以保持濕度，然后放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)，時(shí)間為半個(gè)月；(5)在試管苗移栽后的前半個(gè)月內(nèi)，培養(yǎng)室溫度控制在25±2℃；空氣濕度控制在85％以上，并在半個(gè)月內(nèi)逐步降低，濕度變化以燒杯開口進(jìn)行調(diào)控，光照時(shí)間加長(zhǎng)，由原來的12小時(shí)/日增至16小時(shí)/日，移栽試管苗生長(zhǎng)半個(gè)月后，其幼苗發(fā)育健壯，生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，適應(yīng)性強(qiáng)，此時(shí)再將其由培養(yǎng)室條件轉(zhuǎn)移至自然條件下栽培，并按常規(guī)技術(shù)進(jìn)行管理，2w澆灌一次營(yíng)養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1～2個(gè)月后便可移入田間定植。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無核葡萄試管苗煉苗移栽技術(shù)，其特征是所 述營(yíng)養(yǎng)液標(biāo)準(zhǔn)濃度是指大量元素為KN03 238mg丄"，NH4N03 206 mg丄"，KH2P04 21 mg'L"， MgS04,7H20 46 mgL" ， CaCl22H20 55 mgL國(guó)1;微量元素為KI 0.104 mg.L"， H3B03 0.775 mg0/1， MnS04'4H20 2.788 mg.L"， ZnS04-7 H20 1.075 mgL-1， Na2Mo042 H20 0.0315 mgl/1， CuS04-5 H20 0.0032 mg.L;1， CoCl2.6 H20 0.0032 mg.L";鐵鹽為Na2.EDTA 4.66 mg.I/1 ， FeS04.7H20 3.475 mg.L國(guó)1;附加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑吲哚丁酸(IBA) 0.01 mg丄'1，其余為蒸餾水。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種無核葡萄試管苗煉苗移栽技術(shù)，其特 征是所述無核葡萄是通過胚挽救技術(shù)得到的無核白葡萄、優(yōu)無核葡萄(超 級(jí)無核、黃提)、奇妙無核葡萄(黑美人)、紅寶石無核(魯貝)葡萄、克瑞 森無核(緋紅無核、淑女紅)葡萄、皇家秋天(無核皇后)葡萄的試管苗。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無核葡萄試管苗煉苗移栽技術(shù)，其特征是: 所述IBA溶液時(shí)按照下列方法配制先配制0.2 mg'ml—1 IBA母液，稱取20mg IBA，用2ml稀鹽酸或95%乙醇溶液溶解，緩緩加入蒸餾水，不斷攪拌，以 免產(chǎn)生沉淀，定容至100ml，即為0.2mg，ml"IBA母液，4。C冷藏保存，配制 1L營(yíng)養(yǎng)液時(shí)，用移液槍量取50pl母液即可。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的一種無核葡萄試管苗煉苗移栽技術(shù)，其特 征是所述營(yíng)養(yǎng)液溶液時(shí)按照下列方法配制(1) 分別按照權(quán)利2的160倍稱取硝酸鉀、硝酸銨、磷酸二氫鉀、7水合 硫酸錳鎂、2水合氯化鈣，分別用蒸餾水溶解，攪拌均勻，按照以上順序緩 緩加入，并用蒸餾水沖洗燒杯2~3遍，不斷攪拌，以免產(chǎn)生沉淀，定容至 1000ml，制成160倍的儲(chǔ)備液I;(2) 分別按照權(quán)利2的1600倍稱取碘化鉀、硼酸、4水合硫酸錳、7水合 硫酸鋅、2水合鉬酸鈉、5水合硫酸銅、6水合氯化鈷，分別用蒸餾水溶解， 攪拌均勻，按順序緩緩加入，并用蒸餾水沖洗燒杯2 3遍，不斷攪拌，以免 產(chǎn)生沉淀，定容至1000ml，制成1600倍的儲(chǔ)備液II;(3) 分別按照權(quán)利2的1600倍稱取N化EDTA、 7水硫酸亞鐵分別用蒸餾 水加熱溶解，攪拌均勻，將Na2，EDTA溶液倒入FeS(V7H20中，并用蒸餾 水沖洗燒杯2 3遍，定容至1000ml，制成1600倍的儲(chǔ)備液III;(4) 分別量取50ml儲(chǔ)備液I、 5ml儲(chǔ)備液II、 5ml儲(chǔ)備液III、 400(il IBA母液，混合，加8L水，即配制成8L營(yíng)養(yǎng)液，備用。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無核葡萄試管苗煉苗移栽技術(shù)，其特征是: 所述煉苗條件為溫度25土rC，濕度60%，光強(qiáng)2000~3000Lx，光照/黑暗 為16h/8h。
全文摘要
本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)一種無核葡萄試管苗煉苗移栽技術(shù)，它是利用胚挽救技術(shù)培育無核葡萄新品種的研究中非常重要的環(huán)節(jié)。幼胚出苗后，通過為扦插技術(shù)擴(kuò)繁到一定數(shù)量試管苗，形成一個(gè)株系。待無核葡萄試管苗40～50d，長(zhǎng)出5條以上潔白粗壯的根，生出4～5片葉后，即可進(jìn)行煉苗和移栽。在無菌條件下從三角瓶中取出試管苗，轉(zhuǎn)移到在含有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑0.01mg·L^-1的吲哚丁酸(IBA)基質(zhì)中行煉苗。在試管苗移栽后的前半個(gè)月內(nèi)，將其由培養(yǎng)室條件轉(zhuǎn)移至自然條件下栽培，繼續(xù)培養(yǎng)1～2個(gè)月后便可移入田間定植。使用本發(fā)明的葡萄試管苗的成活率提高到95％以上，能夠較容易得到更多的雜交后代，增大無核葡萄雜交育種的應(yīng)用前景，加速無核葡萄新品種育種進(jìn)程，提高無核葡萄育種效率。
文檔編號(hào)A01G31/00GK101564012SQ200910136799
公開日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2009年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月18日
發(fā)明者劉海琳 申請(qǐng)人:杭州藍(lán)天園林建設(shè)集團(tuán)有限公司余杭分公司