專利名稱：干細(xì)胞凍存液及干細(xì)胞的凍存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細(xì)胞凍存液以及干細(xì)胞的凍存方法。
背景技術(shù)：
凍存過程會(huì)顯著改變細(xì)胞的熱力學(xué)、化學(xué)和物理環(huán)境，有伴隨造成生物性損傷的 危險(xiǎn)。溫度的變化主要取決于降溫或升溫方法所引起的熱傳導(dǎo)的邊界條件，也受細(xì)胞復(fù)融 過程中潛熱效應(yīng)的影響。為了將凍融過程中細(xì)胞的損傷降至最低，必須進(jìn)一步優(yōu)化化學(xué)和 溫度操作過程。但需要在降溫前加入一種或兩種低溫保護(hù)劑，在溶解后又將其去除。為使細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)存活率最高，最佳的冷凍條件是盡可能地降低細(xì)胞內(nèi)的晶體形 成，減少細(xì)胞內(nèi)水凝固所形成的高濃度溶質(zhì)對(duì)細(xì)胞造成的低溫?fù)p傷。上述要求可通過下列 方法獲得(1)緩慢冷凍，使細(xì)胞內(nèi)水分離開細(xì)胞，但不可太慢，以避免冰晶形成；(2)用親 水的低溫保護(hù)劑排除水分；(3)在盡可能低的溫度下保護(hù)細(xì)胞，降低高濃度鹽對(duì)冰中蛋白 質(zhì)變性的影響；(4)快速復(fù)蘇，減少細(xì)胞內(nèi)晶體形成，以及細(xì)胞內(nèi)殘余的冰溶解時(shí)可溶性成 分的產(chǎn)生。凍存影響因素細(xì)胞濃度以較高濃度凍存細(xì)胞，細(xì)胞的復(fù)蘇活率更高。冷凍速 率大多數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞以l°c /min的速度冷凍存活率最高，這可能是快速冷凍減少冰晶形 成和慢速冷凍增加細(xì)胞外水分遷移之間的一個(gè)折中。凍存液細(xì)胞懸液通常在加入細(xì)胞保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜(DMSO)后進(jìn)行冷凍， 后者效果更好，原因可能與其穿透細(xì)胞的能力較甘油強(qiáng)有關(guān)。使用濃度為5%-15%。常用 到的細(xì)胞保護(hù)劑還有，羥乙基淀粉(HES)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)等。日本學(xué)者M(jìn)akino S等報(bào)道，采用6%羥乙基淀粉聯(lián)合5 % DMSO凍存自體外周血干 細(xì)胞(PBSCs)，比單純的10% DMSO凍存方法效果更好，該方法將細(xì)胞凍存于_80°C，可獲得 較高的復(fù)蘇活率(88. 4+/-3. 6% )，且復(fù)蘇后細(xì)胞保持造血活性；長達(dá)1-5年的凍存也可取 得較滿意的效果；10位血液腫瘤患者輸注復(fù)蘇的自體PBSCs后，均顯示細(xì)胞被成功植入，其 中7位患者獲得癥狀完全緩解的時(shí)間長達(dá)3. 5-15個(gè)月。該方法在日本被廣泛采用。西班牙學(xué)者Servei D' Hematologia等報(bào)道，采用10 % DMSO和自體血漿凍存自 體PBSCs和骨髓細(xì)胞，復(fù)蘇活率可達(dá)到90%，11位血液腫瘤患者輸注復(fù)蘇的自體PBSCs后， 均顯示細(xì)胞植入，其中10位患者獲得癥狀完全緩解的時(shí)間長達(dá)3-9個(gè)月。挪威學(xué)者研究則發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于10% DMS0,5% DMSO凍存的PBSCs凋亡和死亡率都 較低；103位血液腫瘤患者輸注10% DMSO和5% DMSO凍存的自體PBSCs，其臨床效果并無 明顯差別。該學(xué)者認(rèn)為，從安全性方面考慮，應(yīng)選擇5% DMS0。荷蘭學(xué)者的研究亦表明，5% DMSO凍存的復(fù)蘇活率高于10% DMS0。綜上所述，造血干細(xì)胞庫傾向于采用5% DMS0，若能配以自體血漿，則凍存效果更 佳。同時(shí)，我們應(yīng)該注意到，輸注DMSO凍存的PBSCs可能與一些毒性反應(yīng)有關(guān)，比如嘔吐、 心臟功能失調(diào)、過敏和急性腎衰，所以在保證凍存效果的前提下，應(yīng)盡量降低DMSO的濃度。

發(fā)明內(nèi)容
為有助理解本發(fā)明，下面定義了一些術(shù)語。本文定義的術(shù)語具有本發(fā)明領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員通常理解的含義。除非另外說明，本文中HES的百分含量表示重量百分含量，其他百分含量均表示 體積百分含量。除非另外說明，本文中的“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”指的是含有細(xì)胞生長繁殖所需的基本營養(yǎng) 物質(zhì)的培養(yǎng)基，可供大多數(shù)細(xì)胞生長。除非另外說明，本發(fā)明中的DMSO為二甲基亞砜的英文簡稱，HES為羥乙基淀粉的 英文簡稱，AB表示人AB血清，F(xiàn)BS為胎牛血清的英文簡稱，MM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的英文簡稱， HAS為人血清白蛋白的英文簡稱，MSC為臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的英文簡稱。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種干細(xì)胞凍存液，該凍存液可以使凍存的干細(xì)胞有很 好的凍存復(fù)活率，同時(shí)避免含有動(dòng)物血清和培養(yǎng)基，使該凍存液在臨床上更具有實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種干細(xì)胞凍存復(fù)蘇的方法，該方法采用本發(fā)明所 述的干細(xì)胞凍存液。本發(fā)明一方面提供了一種干細(xì)胞凍存液，其中所述的凍存液含有二甲基亞砜和羥 乙基淀粉。優(yōu)選地，所述的凍存液中含有5-10%體積的二甲基亞砜和3-6%重量的羥乙基淀 粉。更優(yōu)選地，所述的凍存液含有5%體積的二甲基亞砜和6%重量的羥乙基淀粉。優(yōu)選地，所述的凍存液還含有人AB血清。更優(yōu)選地，所述的人AB血清的含量為10-80%體積。再優(yōu)選地，所述的人AB血清的含量為10-50%體積。最優(yōu)選地，所述的凍存液含有5%體積的二甲基亞砜、5%重量的羥乙基淀粉和 10%體積的人AB血清。優(yōu)選地，所述的凍存液含有5%體積的二甲基亞砜、3%重量的羥乙基淀粉和45% 體積的人AB血清。優(yōu)選地，所述的凍存液不含有人AB血清。本發(fā)明再一方面還提供了一種干細(xì)胞凍存方法，該方法包括以下步驟a.將消化 后的干細(xì)胞加入本發(fā)明的凍存液，得到細(xì)胞懸浮液；b.將所述的細(xì)胞懸浮液冷凍，再將冷凍后的細(xì)胞懸浮液移入液氮中保存。優(yōu)選地，其中所述的細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞數(shù)目為1*106-4*107個(gè)/ ml ο本發(fā)明的有益效果在于采用本發(fā)明的凍存液含有5-10%體積的二甲基亞砜、 3-6%重量的羥乙基淀粉和10-80%體積的人AB血清的細(xì)胞傳代4代的細(xì)胞復(fù)蘇活率在 60 % -85 %范圍內(nèi)，優(yōu)選凍存液含有5 %體積的二甲基亞砜、3-5 %重量的羥乙基淀粉和 10-45%體積的人AB血清的細(xì)胞復(fù)蘇活率可以達(dá)到90%。復(fù)蘇后的細(xì)胞仍然高度表達(dá)臍 帶間質(zhì)干細(xì)胞表面抗原。誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)顯示，臍帶間質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后可誘導(dǎo)為成脂、成骨細(xì) 胞。


圖1顯示二甲基亞砜凍存液復(fù)蘇1天后的細(xì)胞形態(tài)圖，其中圖Ι-a表示濃度為5% 體積的二甲基亞砜凍存液復(fù)蘇1天后的細(xì)胞形態(tài)圖；圖l_b表示濃度為8%體積的二甲基 亞砜凍存液復(fù)蘇1天后的細(xì)胞形態(tài)圖；圖1-c表示濃度為10%體積的二甲基亞砜凍存液復(fù) 蘇1天后的細(xì)胞形態(tài)圖。圖2顯示不同凍存方案下的細(xì)胞復(fù)蘇后第1天的狀態(tài)相片。其中圖2-a表示5% 體積的DMS0+5%重量的HES+10%體積的AB凍存液復(fù)蘇1天后的細(xì)胞形態(tài)圖；圖2_b表示 5%體積的DMS0+3%重量的HES+45%體積的AB凍存液復(fù)蘇1天后的細(xì)胞形態(tài)圖；圖2_c表 示10%體積的DMS0+10%體積的FBS+80%體積的匪凍存液復(fù)蘇1天后的細(xì)胞形態(tài)圖。圖3顯示流式檢測5%體積的DMS0+5%重量的HES+10%體積的AB凍存液復(fù)蘇細(xì) 胞的表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。其中圖3-a表示用CD73檢測表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行 細(xì)胞計(jì)數(shù)；圖3-b表示用CD9tl檢測表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；圖3-c表示用CD34檢測 表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；圖3-d表示用CDltl5檢測表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)； 圖3-e表示用CD45檢測表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖4顯示流式檢測5%體積的DMS0+3%重量的HES+45%體積的AB凍存液復(fù)蘇細(xì) 胞的表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。其中圖4-a表示用CD73檢測表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行 細(xì)胞計(jì)數(shù)；圖4-b表示用CD9tl檢測表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；圖4-c表示用CD34檢測 表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；其中圖4-d表示用CDltl5檢測表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì) 數(shù)；圖4-e表示用CD45檢測表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖5顯示流式檢測10 %體積的DMS0+10 %體積的FBS+80 %體積的匪凍存液復(fù)蘇 細(xì)胞的表面抗原，其中圖5-a表示用CD73檢測表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；圖5-b表示 用CD9tl檢測表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；圖5-c表示用CDltl5檢測表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行 細(xì)胞計(jì)數(shù)；其中圖5-d表示用CD34檢測表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；圖5-e表示用CD45 檢測表面抗原的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖6顯示5%體積的DMS0+5%重量的HES+10%體積的AB凍存液復(fù)蘇細(xì)胞的誘導(dǎo) 分化實(shí)驗(yàn)。其中圖6-a表示用成脂誘導(dǎo)后油紅0染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴；圖6-b表示成骨誘 導(dǎo)后茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié)。圖7顯示5%體積的DMS0+3%重量的HES+45%體積的AB凍存液復(fù)蘇細(xì)胞的誘導(dǎo) 分化實(shí)驗(yàn)。其中圖7-a表示用成脂誘導(dǎo)后油紅0染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴；圖7-b表示成骨誘 導(dǎo)后茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié)。圖8顯示10%體積的DMS0+10%體積的FBS+80%體積的匪凍存液復(fù)蘇細(xì)胞的誘 導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。其中圖8-a表示用成脂誘導(dǎo)后油紅0染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴；圖8-b表示成骨 誘導(dǎo)后茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于解釋本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明。實(shí)施例1、研究凍存液中DMSO濃度對(duì)凍存效果的影響(一 )第一階段實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br> 研究凍存液中DMSO濃度對(duì)凍存效果的影響。實(shí)驗(yàn)方法設(shè)立5%、8%、10%三個(gè)DMSO濃度，結(jié)合完全培養(yǎng)基組成凍存液，按常規(guī)方法消化 細(xì)胞后，加入凍存液，置于凍存盒中，移入-80°C冰箱，次日移入液氮中。一個(gè)星期后復(fù)蘇，比 較細(xì)胞活力和細(xì)胞狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)各組細(xì)胞活力無明顯差別。(2)各組細(xì)胞狀態(tài)亦無明顯差別。細(xì)胞形態(tài)呈短梭形，分布均勻，狀態(tài)良好，見圖 Ι-a、圖Ι-b和圖1-c。3天之后細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)論5%、8%、10%三個(gè)DMSO濃度對(duì)臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(簡稱MSC)的凍存效果沒有明顯差異。_仿丨丨2、械HES終·，■艦冬·，#船寸機(jī)胃 行的凍存方法。實(shí)驗(yàn)?zāi)康母淖僅ES終濃度，由體積比終濃度演變?yōu)橘|(zhì)量比終濃度，并探討其他可 行的凍存方法。實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.探討如下方案的凍存效果ΑΒ為人AB血清；MM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；FBS為胎牛血清； HES為羥乙基淀粉，以下濃度HES為質(zhì)量終濃度，其余均為體積終濃度。表 權(quán)利要求
1.一種干細(xì)胞凍存液，所述的凍存液含有二甲基亞砜和羥乙基淀粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞凍存液，所述的凍存液中含有5-10%體積的二甲基亞 砜和3-6%重量的羥乙基淀粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的干細(xì)胞凍存液，所述的凍存液含有5%體積的二甲基亞 砜和6%重量的羥乙基淀粉。
4.根據(jù)權(quán)利1-3中任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞凍存液，其中所述的凍存液還含有人AB血清。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞凍存液，其中所述人AB血清的含量為 10-80%體積，優(yōu)選為10-50%體積。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或5所述的干細(xì)胞凍存液，其中所述的凍存液含有5%體積的 二甲基亞砜、5 %重量的羥乙基淀粉和10 %體積的人AB血清。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或5所述的干細(xì)胞凍存液，其中所述的凍存液含有5%體積的 二甲基亞砜、3%重量的羥乙基淀粉和45%體積的人AB血清。
8.根據(jù)權(quán)利1所述的干細(xì)胞凍存液，其中所述的凍存液不含有人AB血清。
9.一種干細(xì)胞凍存方法，該方法包括以下步驟a.將消化后的干細(xì)胞加入權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的凍存液，得到細(xì)胞懸浮液；b.將所述的細(xì)胞懸浮液冷凍，再將冷凍后的細(xì)胞懸浮液移入液氮中保存。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞數(shù)目為1*106-4*107 個(gè)/ml。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞凍存液以及干細(xì)胞凍存的方法，其中所述的凍存液含有二甲基亞砜和羥乙基淀粉，在臨床上極具應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明還提供了一種干細(xì)胞凍存方法，該方法采用本發(fā)明的干細(xì)胞凍存液。采用本發(fā)明的干細(xì)胞凍存液凍存的細(xì)胞具有復(fù)蘇活率高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01N1/02GK101990888SQ20091016717
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月31日
發(fā)明者張炳強(qiáng), 戴國勝, 李國喜, 胡祥, 鄭意端 申請(qǐng)人:深圳市北科生物科技有限公司