專利名稱：：一種快速篩選鑒定番茄耐寒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種果蔬作物耐寒性品種的鑒別方法，確切地說是一個快速篩選鑒定番茄耐寒性的方法。二
背景技術(shù)：
：低溫凍害是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中一種嚴(yán)重的自然災(zāi)害，據(jù)統(tǒng)計，世界每年因此造成的損失高達(dá)2000億美元。因此，耐寒作物品種的選育已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一個亟待解決的關(guān)鍵問題。番茄是一種經(jīng)濟(jì)效益比較高的蔬菜作物。其果實營養(yǎng)豐富，含多種維生素，是現(xiàn)代人最佳營養(yǎng)食品之一，同時番茄也是保健食品、功能性食品和愛美女士們青睞的美容化妝品。番茄原產(chǎn)自南美洲，我國普遍栽培，一般冬春于保護(hù)地育苗，春季栽培為主，冬季溫室栽培。雖然我國番茄已獲得很多具有優(yōu)良品質(zhì)的品種，但耐受寒冷和凍害的品種卻很少，加之我國番茄為常年栽培作蔬菜，近年來國內(nèi)外專家都試圖通過基因工程技術(shù)和細(xì)胞技術(shù)工程技術(shù)來培育番茄耐寒新品種。因此，尋找一種快速篩選鑒定耐寒番茄品種的方法顯得尤為必要。傳統(tǒng)依靠天然寒冷氣候途徑篩選鑒定優(yōu)良耐寒性狀的番茄種質(zhì)資源的方法存在量大，周期長，性狀不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。因此，本發(fā)明提供一種快速篩選鑒定耐寒番茄品種(系)的方法，可大大縮短耐寒番茄品種的選育周期。三
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對現(xiàn)有番茄耐寒品種篩選鑒定方法的缺陷，旨在提供一種快速簡單有效的篩選鑒定方法以加快番茄耐寒育種的過程，所要解決的技術(shù)問題是篩選鑒定方法的可靠性，同時避免優(yōu)良種質(zhì)資源的丟失。本發(fā)明的思路是在特定條件下確立番茄耐寒植株中的組織器官與某種物理量之間的相關(guān)性，從而將番茄品種耐寒性的篩選鑒定工作轉(zhuǎn)化為該物理量的檢測。通過實驗研究，本發(fā)明利用在一定的冷脅迫條件下的冷處理，根據(jù)番茄離體葉片相對電導(dǎo)率的數(shù)值來反映植株耐寒程度，對植株的耐寒能力的強(qiáng)弱能作出快速有效的評價，加快番茄耐寒育種的進(jìn)程。為確立番茄的品種耐寒性與相對電導(dǎo)率大小之間的相關(guān)性，首先在現(xiàn)有番茄品種中分別對耐寒的、中等耐寒的和不耐寒的三種品種離體葉片進(jìn)行相對電導(dǎo)率分析測定，配合葉片的恢復(fù)性試驗，觀察其外觀形態(tài)變化特征，對本方法進(jìn)行優(yōu)化，通過優(yōu)化確定葉片的冷處理條件、相對電導(dǎo)率檢測條件，同時獲得番茄品種耐寒性與相對電導(dǎo)率數(shù)值之間的對應(yīng)關(guān)系，然后據(jù)此對耐寒性未知的番茄品種進(jìn)行實驗鑒別驗證，最后確立本發(fā)明的技術(shù)方案?，F(xiàn)有番茄品種中耐寒的、中等耐寒的和不耐寒的是指通過傳統(tǒng)自然寒冷氣候途徑，根據(jù)其存活率以及產(chǎn)量大小的不同篩選出不同耐寒性狀的番茄種質(zhì)。本發(fā)明的技術(shù)方案包括番茄幼苗的培養(yǎng)、離體葉片的冷處理和恢復(fù)、電導(dǎo)率的測定和相對電導(dǎo)率的計算，所述的冷處理和恢復(fù)就是取生長35周番茄幼苗莖端葉片于35t:條件下處理13小時，再于-3-5"條件下處理79小時，然后于35"條件下恢復(fù)1014h，最后在2022t:下光照1418小時；所述的電導(dǎo)率的測定就是將冷處理后恢復(fù)的葉片在蒸餾水中抽真空1525分鐘，然后用蒸餾水定容、封口，于2123°C下、振蕩13小時，測電導(dǎo)率&，再封口、沸騰1020min，冷卻至室溫測電導(dǎo)率C2;相對電導(dǎo)率。=(CrC。)/(C廠C。)X100^，式中C。為蒸餾水電導(dǎo)率。當(dāng)相對電導(dǎo)率C的值域《42X時則為耐寒品種番茄。與傳統(tǒng)篩選技術(shù)相比，本發(fā)明方法簡便，易于掌握，大大縮短了育種周期。整個系統(tǒng)的耐寒性篩選鑒定都在可控條件下進(jìn)行，使得篩選結(jié)果更加可靠，利用離體葉片的相對電導(dǎo)率可反映低溫對細(xì)胞膜的破壞程度，同時結(jié)合冷害后的恢復(fù)生長實驗，既鑒定了細(xì)胞對低溫傷害的直接耐受能力，又鑒定了材料在解除低溫后的生長恢復(fù)能力。此外，本發(fā)明也可用于引種耐寒性鑒定，可加快新品種鑒定速度，盡早投入生產(chǎn)，可提高番茄耐寒突變體篩選的有效性，避免在生產(chǎn)過程中可能發(fā)生的優(yōu)良品種資源的丟失。四圖1是A、B、C三種發(fā)育生長四周后的幼苗表型。圖2是A、B、C三種離體葉片冷處理恢復(fù)后的葉片表型變化。A品種葉片巻縮程度最小，呈綠色，C品種葉片巻縮程度最大，呈深黑色，B品種介于兩者之間。圖3是A、B、C三種相對電導(dǎo)率數(shù)據(jù)圖解。圖4是驗證試驗中1#、2#、3#三種幼苗冷處理后恢復(fù)生長狀況圖。五具體實施例方式實驗用番茄品種由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供。其中(1)耐寒番茄品種(系)，命名A"4，A3;(2)中等耐寒番茄品種，命名BpB2，Bs;(3)不耐寒番茄品種，命名CpC^Cp每組三個平行試驗。1、番茄幼苗的培養(yǎng)將A、A2、A3、B工、B2、B3和Q、C2、C3番茄種子，播種到土培花盆中，土壤配置為蛭石黑土珍珠巖=9:3:O.5，使用前黑土需滅菌20min。首次播種澆足植物土壤培養(yǎng)基營養(yǎng)液，以后每周澆水一次。在2rC，16h光照條件下培養(yǎng)4周后，其生長狀況見圖1。2、番茄離體葉片的冷處理將培養(yǎng)生長四周的番茄幼苗取出，剪取其莖端葉片，盡量保持所剪取的葉片大小相一致，以A"B"Q為一組，放入平皿中，計三組，每組三個平行。將平皿放入4t:冰箱中2h，再放入-4t:冷凍室處理8h，取出后放入4t:冰箱中恢復(fù)12h，最后將平皿放置在16h光照培養(yǎng)室(室溫2rC左右)中，24h后其葉片的形態(tài)變化見圖2。3、番茄冷處理后離體葉片電導(dǎo)率的測定電導(dǎo)率測定方法將冷處理恢復(fù)后的材料從平皿中取出，每種材料3個平行。①用50ml注射器加蒸餾水10ml抽真空20min;②再轉(zhuǎn)入50ml三角瓶中，加蒸餾水40ml(定容50ml)，鋁膜封口，放入恒溫氣/水浴搖床22°C，180r.min—1旋轉(zhuǎn)，定時2h;③取出，測電導(dǎo)率4Q;④將所測溶液鋁膜封口，煮沸15min，冷卻至室溫(定容50ml)，測C2;⑤計算相對電導(dǎo)率C=(CrC。)/(C廠C。)X100^，其中C。為蒸餾水電導(dǎo)率。三組相對電導(dǎo)率大小范圍見表l，數(shù)據(jù)分析見圖3。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由此可知，耐寒品種的離體葉片的相對電導(dǎo)率要小于不耐寒品種，中等品種的相對電導(dǎo)率介于耐寒與不耐寒之間。因此，將番茄整株耐寒程度與離體葉片冷處理過后的相對電導(dǎo)率大小建立相關(guān)性關(guān)系為相對電導(dǎo)率在42.62%以下的為耐寒品種，42.62%-62.67%之間的為中等耐寒品種，大于62.67%得為不耐寒品種。統(tǒng)計分析得到-4t:冷處理生長四周的番茄離體葉片后，耐寒品種90%以上的相對電導(dǎo)率在42.62%以下，不耐寒品種90%以上的電導(dǎo)率在62.67%以上中等耐寒品種90%以上的電導(dǎo)率在52.05%附近，為47.62%-62.67%之間(表1、圖3)。4、驗證試驗取耐寒性狀未知的3個番茄品種，(由安徽省農(nóng)科院園藝所提供，耐寒性狀對申請人來說是未知的)命名為1#，2#，3#;剪取大小相同的莖尖葉片(三個平行)放入平皿中，4t:冰箱中冷處理2h，再放入-41:冷凍室處理8h，取出后放入4t:冰箱中恢復(fù)12h，最后將平皿放置在16h光照培養(yǎng)室(室溫2rC左右)中，24h后測其電導(dǎo)率值(表2)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>將驗證所得的1#耐寒、2#中等耐寒、3#不耐寒三個品種培養(yǎng)四周的幼苗植株_6°C冷處理8h，4t:恢復(fù)12h后，16h光照培養(yǎng)室(室溫2rC左右)恢復(fù)培養(yǎng)一周，恢復(fù)生長狀況見圖4。圖中可見，1#耐寒程度最好，2#次之，3#最差。權(quán)利要求一種快速篩選鑒定番茄耐寒性的方法，包括番茄幼苗的培養(yǎng)、離體葉片的冷處理和恢復(fù)、電導(dǎo)率的測定和相對電導(dǎo)率的計算，其特征在于所述的冷處理和恢復(fù)是取生長3～5周番茄幼苗莖端葉片于3～5℃條件下處理1～3小時，再于-3～-5℃條件下處理7～9小時，然后于3～5℃條件下恢復(fù)10～14小時，再于20～22℃條件下光照14～18小時；所述的電導(dǎo)率的測定就是將冷處理后恢復(fù)的葉片在蒸餾水中抽真空15～25分鐘，然后用蒸餾水定容、封口，于21～23℃振蕩1～3小時，測電導(dǎo)率C1，再密封、沸騰10～20分鐘，冷卻至室溫測電導(dǎo)率C2；相對電導(dǎo)率C＝(C1-C0)/(C2-C0)×100％，式中C0為蒸餾水電導(dǎo)率；當(dāng)相對電導(dǎo)率C的值域≤42％時為耐寒番茄品種。全文摘要一種快速篩選鑒定番茄耐寒性的方法，首先培養(yǎng)生長3～5周的番茄幼苗，取莖端葉片于3～5℃下處理1～3小時，再于-3～-5℃下處理7～9小時，然后于3～5℃下恢復(fù)10～14小時，再于20～22℃下光照14～18小時，最后測定冷處理恢復(fù)后的葉片電導(dǎo)率，將葉片投入蒸餾水中抽真空處理后定容、密封條件下于21～23℃下振蕩1～3小時，測電導(dǎo)率C1，再密封、沸騰10～20分鐘，冷卻至室溫測電導(dǎo)率C2，計算相對電導(dǎo)率C＝(C1-C0)/(C2-C0)×100％，當(dāng)相對電導(dǎo)率C的值域≤42％時即為耐寒的番茄品種。本發(fā)明整個系統(tǒng)的耐寒性篩選都在可控條件，結(jié)果可靠，方法簡便，易于掌握，大大縮短了育種周期，同時可用于引種耐寒性的鑒定。文檔編號A01H1/04GK101695278SQ20091018496公開日2010年4月21日申請日期2009年10月23日優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日發(fā)明者任永兵,呂申超,孫佳佳,曹樹青,江力,汪洋,袁懷波申請人:合肥工業(yè)大學(xué);