專利名稱：一種利用基因的協(xié)同作用培育抗黃萎病棉花的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。主要涉及利用不同來(lái)源基因間的協(xié)同作用，培育
抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花的方法。
背景技術(shù)：
作物病害是作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙之一，常常引起作物產(chǎn)品品質(zhì)下降，甚至產(chǎn) 生一些對(duì)人類具有毒副作物的代謝物質(zhì)。全世界每年因病害造成的作物減產(chǎn)超過(guò)15%，直 接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)300 500億美元(李潤(rùn)植等，2001 ;0susky等，2000)。培育和推廣應(yīng)用抗病 品種是作物病害綜合防治最經(jīng)濟(jì)有效的措施。由于病原菌變異迅速，植物抗性資源有限以 及常規(guī)育種方法耗時(shí)費(fèi)力，培育的抗病品種遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)需要。利用現(xiàn)代生物技術(shù)分離、 克隆和轉(zhuǎn)化抗性基因，可有效克服常規(guī)育種的不足，且基因來(lái)源廣泛、不受抗源親緣關(guān)系限 制，一次克隆可用于多次轉(zhuǎn)化。此外，將某些抗病基因轉(zhuǎn)入植物中，還可以提高植物獲得性 系統(tǒng)抗病能力和對(duì)病原菌的免疫能力。通過(guò)這種方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物抗性不易喪失，抗 性基因容易轉(zhuǎn)育(Cornelissen等，1993)。因此，基因工程技術(shù)已成為植物抗病育種的重要 途徑。 幾丁質(zhì)酶是一種水解酶，廣泛存在于植物和微生物，具有降解幾丁質(zhì)的作用。幾丁 質(zhì)是植物病原真菌中絕大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分，而在植物中還未發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的底 物，因此，幾丁質(zhì)酶在防御植物病原真菌的侵害中具有重要作用。自1991年，Broglie等首 次報(bào)道轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因植物能提高對(duì)真菌病害的抗性以來(lái)，幾丁質(zhì)酶基因便倍受關(guān)注。但 是，至今還沒(méi)有利用幾丁酶基因獲得可利用的抗病轉(zhuǎn)基因材料的報(bào)道。
抗菌蛋白(AMP，antimicrobial protein)是一類由生物產(chǎn)生的具有抗菌活性的蛋 白或多肽，廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中，具有抗菌譜廣、抗菌活性高和抗性持久等特 點(diǎn)?？咕牡目咕鷻C(jī)制特別，多以在膜上形成孔道導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏的方式摧毀病原菌， 致使病原菌難以產(chǎn)生抗性。大量的研究表明，在植物中表達(dá)異源的抗菌蛋白基因能增強(qiáng)植 物的抗病性(AlanAR，2004 ;Cary JW， 2000 ;Maria Coca，2006)。在提高植物抗病性的策略 應(yīng)用上，運(yùn)用最廣泛的是利用來(lái)自植物的抗菌蛋白基因提高不同植物的抗性。目前，抗菌蛋 白基因在提高植物抗病性方面的研究已涉及煙草、水稻、小麥、棉花、油菜、大豆、葡萄、梨、 蘋(píng)果、玫瑰、楊樹(shù)、橄欖等多種植物。但是，在植物中組成型高量表達(dá)異源蛋白或多肽常常對(duì) 植株生長(zhǎng)不利，易引起植株生長(zhǎng)發(fā)育異?；虿挥?。表達(dá)偏低時(shí)，植株生長(zhǎng)發(fā)育正常但是抗性 提高不明顯。因此，單純組成型表達(dá)抗菌蛋白基因，也難以獲得可利用的轉(zhuǎn)基因抗病材料。
作為重要經(jīng)濟(jì)作物的棉花在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。但是棉花生產(chǎn)常年受 到多種病害的威脅，特別是棉花黃萎病仍是棉花生產(chǎn)中最具毀滅性的病害之一。因黃萎病 是土傳維管束病害，難以利用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治。目前我國(guó)棉花黃萎病的發(fā)病面積已占植 棉總面積的50%以上，每年損失皮棉7. 5-10萬(wàn)噸，直接經(jīng)濟(jì)損失16-20億元，已成為當(dāng)前實(shí) 現(xiàn)棉花高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙因素，但是至今生產(chǎn)上沒(méi)有找到有效的防治措施。生產(chǎn)實(shí)踐證明，種植抗病品種是唯一經(jīng)濟(jì)有效的防治手段。我國(guó)育種專家經(jīng)過(guò)幾十年的努力，利用常規(guī) 育種手段，獲得了一些對(duì)黃萎病具有一定抗病能力的地方品種，但是由于黃萎病菌變異快、 小種多，具有明顯的致病力分化，針對(duì)黃萎病菌這種特性的廣譜抗性品種基本沒(méi)有，因此就 存在著在一個(gè)地區(qū)表現(xiàn)為抗病的品種，到另一個(gè)不同生理和地理?xiàng)l件下，可能出現(xiàn)抗病性 喪失的問(wèn)題。另一方面，由于陸地棉栽培種內(nèi)缺乏高抗黃萎病的抗源，直接導(dǎo)致了我國(guó)棉花 抗黃萎病育種進(jìn)程緩慢，特別是抗落葉型黃萎病育種基本沒(méi)有進(jìn)展。此外，不同地域種子交 流導(dǎo)致病原菌在地方上的種類越來(lái)越多，形成了復(fù)合種群。不同地域黃萎病菌致病力的分 化和提高，強(qiáng)致病力菌系的出現(xiàn)是造成棉花黃萎病逐年加重的主要原因之一。為此，解決生 產(chǎn)中抗黃萎病資源缺乏的問(wèn)題和尋找新的抗病育種方法已迫在眉睫，急需獲得具有廣譜和 持久抗性的抗源以減輕棉花生產(chǎn)中黃萎病造成的巨大損失。 利用基因工程改良棉花的抗病性也已逐漸成為棉花病害防治的一條重要途徑。但 是將單個(gè)幾丁酶基因或抗菌蛋白基因轉(zhuǎn)入棉花還沒(méi)有獲得滿足棉花生產(chǎn)要求的抗病材料。 利用基因間的協(xié)同作用提高棉花對(duì)黃萎病的抗性已有報(bào)道。但是，這方面的研究主要集中 在幾丁質(zhì)酶基因和葡聚糖酶基因間的協(xié)同作用(吳家和和張獻(xiàn)龍等，2004)，而未見(jiàn)幾丁酶 基因和抗菌蛋白基因間協(xié)同作用提高轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)黃萎病抗性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種簡(jiǎn)便易行，效果顯著，能為棉花抗黃萎病育種，特別 是抗落葉型黃萎病育種提供新的抗源，利用基因的協(xié)同作用培育抗黃萎病棉花的方法及其 應(yīng)用。 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種利用基因的協(xié)同作用培育抗黃萎病棉花的方 法，其特征在于，包括如下步驟 (1)獲得球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchitl和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2，并分別 構(gòu)建Bbchitl和LjAMP2基因組成型表達(dá)的植物表達(dá)載體； (2)利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bbchitl和LjAMP2基因組成型表達(dá)的植物表達(dá)載體 分別轉(zhuǎn)入棉花，實(shí)現(xiàn)Bbchitl和LjAMP2基因在棉花內(nèi)的組成型表達(dá)； (3)將步驟(2)獲得的轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行抗病鑒定和選育，篩選黃萎病病情指數(shù) 60-80，植株生長(zhǎng)發(fā)育正常的純合株系； (4)分別以步驟(3)獲得的球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchitl和益母草抗菌蛋白基 因LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花純合株系為父本和母本進(jìn)行有性雜交，獲得雜交巳代，實(shí)現(xiàn)球孢白僵 菌幾丁酶基因Bbchitl和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2在同一植株內(nèi)同時(shí)進(jìn)行組成型表達(dá)， 利用二者的協(xié)同作用提高棉花對(duì)黃萎病的抗病能力。 進(jìn)一步，所述步驟(3)的純合株系為步驟(2)獲得的轉(zhuǎn)基因棉花經(jīng)過(guò)抗病鑒定和 選育，篩選生長(zhǎng)發(fā)育正常的純合株系，是指以轉(zhuǎn)基因棉花后代中不再出現(xiàn)GUS基因的分離 為標(biāo)準(zhǔn)確定純合株系，以病情指數(shù)為60-80為標(biāo)準(zhǔn)確定抗病性的提高程度進(jìn)行鑒定。
進(jìn)一步，所述的抗病鑒定是指于人工氣候室內(nèi)進(jìn)行的抗病鑒定，主要是對(duì)轉(zhuǎn)基因 棉花3-4片真葉幼苗進(jìn)行傷根后澆灌病原菌孢子液的方法。 更進(jìn)一步，所述利用基因的協(xié)同作用培育抗黃萎病棉花方法的應(yīng)用，適用于培育 不同抗真菌病害的植物。所述的植物是指通過(guò)有性生殖方式進(jìn)行繁殖的單子葉和雙子葉植物。 所述的幾丁酶基因Bbchitl和抗菌蛋白基因LjAMP2分別來(lái)自球孢白僵菌和益母 草，其植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法為基因工程領(lǐng)域的常規(guī)方法，使用的載體是植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng) 域所使用的常規(guī)載體； 所述將基因的植物表達(dá)載體整合入棉花基因組的方法為常用植物轉(zhuǎn)基因方法根 癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法； 本發(fā)明中所指的"對(duì)黃萎病的抗性"主要是指對(duì)落葉型黃萎病的抗性。
本發(fā)明中所指的"轉(zhuǎn)基因棉花"是指通過(guò)分子生物學(xué)、生物技術(shù)手段，將其他生物 的基因轉(zhuǎn)移到棉花中，進(jìn)而獲得對(duì)黃萎病抗性提高的棉花新材料。用于改造的基因分別來(lái) 自于殺蟲(chóng)真菌球孢白僵菌和中草藥益母草。 本發(fā)明在獲得球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchitl和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2組 成型表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bbchitl和LjAMP2基因組成型表達(dá)的 植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入棉花，實(shí)現(xiàn)Bbchitl和LjAMP2基因在棉花內(nèi)的組成型表達(dá)；分別獲 得超量表達(dá)Bbchitl和LjAMP2的轉(zhuǎn)基因棉花，并篩選獲得對(duì)黃萎病病情指數(shù)為60-80生 長(zhǎng)正常的純合轉(zhuǎn)基因棉花株系；然后利用有性雜交技術(shù)獲得同一植株內(nèi)同時(shí)組成型表達(dá) Bbchitl和LjAMP2的雜交巳代，并于人工氣候室內(nèi)對(duì)巳代及其親本接種落葉型黃萎病菌， 驗(yàn)證Bbchitl和LjAMP2協(xié)同抗黃萎病效果。 研究結(jié)果表明，雜交巳代的病情指數(shù)可較親本降低60 %以上，較野生型對(duì)照降低 75%以上。由此說(shuō)明，利用Bbchitl和LjAMP2基因間的協(xié)同作用可有效提高棉花對(duì)落葉型 黃萎病的抗病能力，可獲得落葉型黃萎病病情指數(shù)在10-25的抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花材料。
本發(fā)明通過(guò)有性雜交，實(shí)現(xiàn)了球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchitl和益母草抗菌蛋白 基因LjAMP2在同一植株內(nèi)同時(shí)組成型表達(dá)，利用兩個(gè)基因的協(xié)同作用有效提高了棉花對(duì) 落葉型黃萎病的抗性。本發(fā)明首次利用幾丁酶基因和抗菌蛋白基因間的協(xié)同作用提高棉花 對(duì)落葉型黃萎病的抗性。本發(fā)明利用幾丁酶基因和抗菌蛋白基因的協(xié)同作用，有效解決了 上述單純組成型表達(dá)幾丁酶基因和抗菌蛋白基因提高植物抗病性的不足?？色@得既能有效 提高抗病性，又不影響植株生長(zhǎng)發(fā)育的轉(zhuǎn)基因材料。 本發(fā)明提供的方法簡(jiǎn)便易行，效果顯著，能為棉花抗黃萎病育種，特別是抗落葉型 黃萎病育種提供新的抗源，為棉花生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益，具有很好的市場(chǎng)前景。
本發(fā)明提供的利用基因的協(xié)同作用培育抗黃萎病棉花的方法，還可用于其它以有 性生殖方式進(jìn)行繁殖的植物，培育對(duì)不同真菌病害具有抗性的抗病材料。因此，本發(fā)明具有 重要的利用價(jià)值。


圖1為35S-Bbchitl植物表達(dá)載體構(gòu)建流程圖 圖2為35S-LJAMP2植物表達(dá)載體構(gòu)建流程圖 圖3為pBI121植物表達(dá)載體改造為P5載體的流程圖 圖4為Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花中Bbchitl基因的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 1-13 :GUS陽(yáng)性Bbchitl轉(zhuǎn)基因植株;14 :野生型植株對(duì)照;Bbchitl :以Bbchitl
轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株cDNA為模板擴(kuò)增Bbchitl基因的結(jié)果；HIS3 :以Bbchitl轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株cDNA為模板擴(kuò)增HIS3基因的結(jié)果；RNA as template :以Bbchitl轉(zhuǎn)基 因植株和野生型植株RNA為模板擴(kuò)增HIS3基因的結(jié)果。Bbchitl基因擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，HIS3 基因擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)。 圖5為L(zhǎng)jAMP2轉(zhuǎn)基因棉花中LjAMP2基因的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
1-12 :GUS陽(yáng)性LjAMP2轉(zhuǎn)基因植株；13 :野生型植株對(duì)照；LjAMP2 :以LjAMP2轉(zhuǎn)基 因植株和野生型植株cDNA為模板擴(kuò)增LjAMP2基因的結(jié)果；HIS3 :以LjAMP2轉(zhuǎn)基因植株和 野生型植株cDNA為模板擴(kuò)增HIS3基因的結(jié)果；RNA as template :以LjAMP2轉(zhuǎn)基因植株和 野生型植株RNA為模板擴(kuò)增HIS3基因的結(jié)果。LjAMP2基因擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，HIS3基因擴(kuò)增 20個(gè)循環(huán)。 圖6為以Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花DNA為模板擴(kuò)增LjAMP2和Bbchitl基因的結(jié)果
1 :Bbchitl引物的水對(duì)照；2-6 :以Bbchitl 1轉(zhuǎn)基因棉花DNA為模板擴(kuò)增Bbchitl 基因的結(jié)果;7 :Bbchitl質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照;8 :LjAMP2質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；9_13 :以Bbchitl轉(zhuǎn)基因 棉花DNA為模板擴(kuò)增LjAMP2基因的結(jié)果；14 :LjAMP2引物的水對(duì)照；M :Marker 2000。
圖7為以LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花DNA為模板擴(kuò)增LjAMP2和Bbchitl基因的結(jié)果
1 :LjAMP2引物的水對(duì)照；2-6 :以LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花DNA為模板擴(kuò)增LjAMP2基因 的結(jié)果；7 :LjAMP2質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；8 :Bbchitl質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；9_13 :以LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花 DNA為模板擴(kuò)增Bbchitl基因的結(jié)果；14 :Bbchitl引物的水對(duì)照；M :Marker 2000。
圖8為以Bbchitl和LjAMP2雜交F工代植株DNA為模板擴(kuò)增LjAMP2和Bbchitl基 因的結(jié)果 1 :Bbchitl引物的水對(duì)照；2-6 :以F工植株DNA為模板擴(kuò)增Bbchitl基因的結(jié)果；7 : Bbchitl質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；8 :LjAMP2質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；9-13 :以植株DNA為模板擴(kuò)增LjAMP2 基因的結(jié)果;14 :LjAMP2引物的水對(duì)照;M -Marker 2000。 圖9為Bbchitl和LjAMP2基因在雜交F:代植株中的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
Bbchitl :以Fj直株cDNA為模板擴(kuò)增Bbchitl基因的結(jié)果；LjAMP2 :以F工植株cDNA 為模板擴(kuò)增LjAMP2基因的結(jié)果；HIS3 :以^植株cDNA為模板擴(kuò)增HIS3基因的結(jié)果；RNA as template :以F工植株的RNA為模板擴(kuò)增HIS3基因的結(jié)果。Bbchitl和LjAMP2基因分別 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，HIS3基因擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)。 圖10為接種落葉型黃萎病菌15d，轉(zhuǎn)基因棉花及其雜交后代植株的病情指數(shù)
WT :野生型棉花；Bbchitl :Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花；Bbchitl X LjAMP2和 LjAMP2XBbchitl :Bbchitl和LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花正反交雜交F工代；LjAMP2 :LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但以下說(shuō)明并不對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限 定，任何對(duì)本發(fā)明的變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求 所定義的范圍。 本發(fā)明實(shí)施實(shí)例中的藥品試劑未進(jìn)行具體說(shuō)明的均為國(guó)產(chǎn)常規(guī)化學(xué)試劑，材料方 法未進(jìn)行具體說(shuō)明的均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Sambrook和Russell， 2001)。
實(shí)施實(shí)例1DNA的提取
1、球孢白僵菌基因組DNA的提取方法 1. 5ml離心管收集菌液，lOOOOrpm離心5min，棄上清液，加入真菌DNA提取液(Tris-HCl(pH 7. 5) 0. 2mol/L， NaCl 0. 5mol/L， EDTA 0. 01mol/L， SDS 1% (w/v)) 500 ii 1 ，于渦旋器充分混勻，65t:水浴30min后加入等體積的酚(pH8. 0):氯仿，然后10000rpm離心10min，取上清液，加入等體積氯仿抽提1-2次，取上清液，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，_20°C沉淀30min。 10000rpm離心5min，棄上清液，75%乙醇洗滌沉淀2次，然后風(fēng)干。沉淀雙蒸水溶解后加入適量RNase A，37。C靜置3h， 10000rpm離心5min，取其上清液即為基因組DNA溶液。 2、質(zhì)粒DNA的提取 根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的提取按盧圣棟方法(1993)略作修改。
取根癌農(nóng)桿菌菌液lmL， 10000r/min離心lmin收集菌體；用200 ii L STE (0. lmo1/LNaCl， 10mmol/L Tris-HCl(pH 8. 0) ， lmmol/L EDTA(pH 8.0))重懸菌體后，離心(10000r/min， lmin)收集菌體；加入180 ii L溶液I (50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)，10mmol/L EDTA(pH8.0))和20 ii L溶菌酶重懸菌體，37 。C溫浴30min，加入400 ii L溶液II (0. 2mol/L NaOH， 1 % (w/v) SDS)，上下顛倒多次，冰浴不超過(guò)3min ;再加入300 y L冰預(yù)冷的溶液III (50mL 5mol/L乙酸鉀，11. 5mL冰醋酸，28. 5mL水)，上下顛倒多次，冰浴3min。12000r/min、4t:離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；等體積的酚氯仿異戊醇
(25 : 24 : i)和等體積的氯仿異戊醇(24 : i)先后各抽提一次；再將上清液轉(zhuǎn)入另一
離心管，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后室溫靜置2min ;12000r/min、4。C離心10min收集沉淀DNA，然后用75 %的乙醇洗滌沉淀一次；室溫干燥，50 ii L雙蒸水溶解沉淀即得到質(zhì)粒DNA。 3、棉花基因組DNA的提取方法 采用改良的CTAB法(Doyle， 1987 ;肖月華等，2002a)提取棉花組織DNA，方法為:
棉花植株幼嫩組織0. 5-lg，在液氮中迅速研成粉末，加入3mL 65。C預(yù)熱的CTAB提取液(100mmol/L Tris-HCl (pH8. 0) ， 20mmol/L EDTA(pH8. 0) ， 1. 5mol/L NaCl， 2% CTAB (w/v) ，4% PVP40(w/v)和2%巰基乙醇(v/v) ， PVP和巰基乙醇使用前加入)，快速振蕩混勻，65。C水浴30min，加入lmL 5mol/L KAc冰浴20min。用等體積的氯仿異戊醇(24 : 1)抽提1次，10， OOOrpm， 4。C離心5min，上清液加入2/3倍體積_20"預(yù)冷的異丙醇，混勻，_20°C靜置30min，用玻棒挑出絮狀沉淀，并用75%的乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次，再用無(wú)水乙醇漂洗一次，風(fēng)干后重懸于500iiL TE溶液。加入10mg/mL的RNaseA 2 y L， 37。C處理lh，然后用酚(pH8. 0):氯仿:異戊醇(25 : 24 : 1)和氯仿:異戊醇(24 : l)各抽提一次，10， OOOrpm，4t:離心5min，上清液加入2倍體積的乙醇進(jìn)行沉淀，離心棄上清液。沉淀用75%的乙醇漂
洗，風(fēng)干，溶于200 iU雙蒸水，-2(rc保存?zhèn)溆谩?實(shí)施實(shí)例2益母草種子和棉花RNA的提取 用CTAB法提取益母草種子和棉花組織的總RNA。取約3g新鮮材料(益母草種子或棉花葉片)，在液氮中迅速研成粉末，裝入DEPC水處理的50ml離心管，然后加入15ml 65。C預(yù)熱的RNA提取液(2% CTAB (w/v) ， 2 %聚乙烯妣咯烷酮PVP40 (w/v) ， 100翻1/LTris-HCl (pH8. 0) ， 25mmol/L EDTA， 0. 5g/L亞精胺Spermidine, 2. Omol/L NaCl， 2 %巰基乙醇)，顛倒混勻后65t:水浴3min，8， 000rpm、4t:離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入一新的DEPC水處理的50ml離心管，用等體積的氯仿異戊醇(24 : 1)抽提兩次。10， OOOrpmm，室溫離心5min后取上清液，加入1/4體積10mol/L LiCl溶液，4。C放置6h以上，10， 000rpm，4。C離心10min，棄上清液，沉淀用500 ii L SSTE(lmol/LNaCl，0. 5 % SDS(w/v) ， 10,1/LTris-HCl(pH8. 0)，1.0mmol/L EDTA)溶解。再用等體積的酚(pH4. 5):氯仿:異戊醇(25 : 24 : 1)和氯仿異戊醇(24 : l)各抽提一次，10， 000rpm，室溫離心5min，上清液加入2倍體積-7(TC預(yù)冷的無(wú)水乙醇，-70。C沉淀30min以上。12， 000rpm，4。C離心10min，棄上清液，沉淀用200 ii L的DEPC處理水溶解，非變性凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA質(zhì)量后，-8(TC保存?zhèn)溆谩?實(shí)施實(shí)例3 Bbchitl和LjAMP2基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建
1、Bbchitl基因的獲得及植物表達(dá)載體的構(gòu)建 以球孢白僵菌基因組總DNA為模板，以序列3和序列4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并與PUC-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆得到Bbchitl基因。Bbchitl基因全長(zhǎng)見(jiàn)序列1。 以含有NPTII篩選標(biāo)記基因和GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體p5為基本骨架，將Bbchitl基因連接入載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建組成型表達(dá)的植物表達(dá)載體，并命名為P5-35S-Bbchitl。 P5-35S-Bbchitl植物表達(dá)載體構(gòu)建流程圖見(jiàn)圖1。所有限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自Roche公司，按照使用說(shuō)明書(shū)操作完成。
2、 LjAMP2基因的獲得及植物表達(dá)載體的構(gòu)建 以益母草種子為材料，提取RNA，然后用cDNA —鏈合成試劑盒(MBI公司產(chǎn)品)合成RNA的一鏈cDNA，操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后以合成的cDNA為模板，以序列5和序列6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并與pUC-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆得到LjAMP2基因。LjAMP2基因全長(zhǎng)見(jiàn)序列2。 以含有NPTII篩選標(biāo)記基因和GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體p5為基本骨架，將LjAMP2基因分別連接入載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建組成型表達(dá)的植物表達(dá)載體，并命名為P5-LjAMP2。 P5-LjAMP2植物表達(dá)載體構(gòu)建流程圖見(jiàn)圖2。所有限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自Roche公司，按照使用說(shuō)明書(shū)操作完成。 P5植物表達(dá)載體為改造常用的pBI121載體而得，改選的流程圖見(jiàn)圖3。
3 、植物表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404 參考Bio-RAD MicroPulser用戶說(shuō)明書(shū)，將構(gòu)建的組成型表達(dá)幾丁酶Bbchitl和LjAMP2基因的植物表達(dá)載體P5-35S-Bbchitl和P5-LjAMP2分別通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。 實(shí)施實(shí)例4棉花遺傳轉(zhuǎn)化 以無(wú)菌下胚軸為受體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化，將P5-35S-Bbchitl和P5-LjAMP2植物表達(dá)載體分別整合入棉花基因組。
1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化常用培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基MSB (MS無(wú)機(jī)鹽+B5有機(jī))(T. Murashige， 1962 ;0. L. Gamborg， 1968);
種子萌發(fā)培養(yǎng)基l/2MSB+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂，自來(lái)水配制，自然pH ;
共培養(yǎng)培養(yǎng)基MSB+0. 5mg/L IAA(吲哚乙酸)+0. lmg/L KT(6-糠氨基嘌呤)+30g/L葡萄糖+100 ii mol/L乙酰丁香酮+2. Og/L Gelrite (Sigma) ， pH5. 4 ;
篩選脫菌培養(yǎng)基MSB+0. 5mg/L IAA+0. lmg/L KT+75mg/L Km(卡那霉素)+500mg/Lcef (頭孢霉素)+30g/L葡萄糖+2. 0g/L Gelrite， pH5. 8 ; 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB+0. 5mg/L IAA+O. lmg/L KT+30g/L葡萄糖+2. Og/L Gelrite，pH5. 8 ;胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB+0. lmg/L KT+30g/L葡萄糖+2. Og/L Gelrite, pH5. 8 ;
液體懸浮培養(yǎng)基MSB+1. 91g/L硝酸鉀+0. lmg/L KT+30g/L葡萄糖，pH5. 8 ;
體胚成熟培養(yǎng)基MSB+15g/L蔗糖+15g/L葡萄糖+0. lmg/L KT+2. 5g/L Gelrite，p朋.0 ;成苗培養(yǎng)基SH+0. 4g/L活性碳+20g/L蔗糖，pH6. 0。 (Schenk&Hildebrandt， 1972)
2、棉花遺傳轉(zhuǎn)化具體操作方法
(1)轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌的培養(yǎng) 分別挑取含P5-35S-Bbchitl和P5_LjAMP2植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種入5ml附加50mg/L卡那霉素(Km)和125mg/L鏈霉素(Sm)的YEB(蛋白胨5g/L，酵母膏l(xiāng)g/L，5g/L蔗糖)液體培養(yǎng)基，28t:，180rpm振蕩培養(yǎng)至0D6。。約為l.O，取lOOyL菌液接種入100mL不附加抗生素的YEB液體培養(yǎng)基，28t:、180rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，至培養(yǎng)液0D6。。約為1. 0，菌液室溫8000rpm離心5min，無(wú)菌條件下棄上清液，以原菌液體積并附加lOOymol/L乙酰丁香酮(AS)的無(wú)菌MSB液體培養(yǎng)基(共培養(yǎng)培養(yǎng)基不附加Gelrite固化劑)重懸菌體，備用。[OOSO] (2)轉(zhuǎn)化外植體的獲得 陸地棉栽培種冀棉14號(hào)種子去殼，籽仁0. 1 %升汞滅菌10min，無(wú)菌水漂洗5_6次后，接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基，28t:暗培養(yǎng)5-7d。無(wú)菌下胚軸切成3-5mm長(zhǎng)的切段，作為轉(zhuǎn)化外植體。
(3)下胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化和胚性愈傷的誘導(dǎo) 農(nóng)桿菌浸染液浸染3-5mm下胚軸切段20min，傾去菌液，再用無(wú)菌濾紙吸去外植體表面多余的菌液，浸染后的下胚軸切段接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，26t:暗培養(yǎng)2d，將下胚軸接種至篩選脫菌培養(yǎng)基，20d后繼代入附加卡那霉素(Km)和頭孢霉素(cef)的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷的誘導(dǎo)，間隔20d繼代一次，60d后繼代入胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，獲得胚性愈傷后進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)，以獲得大量生長(zhǎng)一致的胚性愈傷。
(4)體胚的誘導(dǎo)和成苗培養(yǎng) 液體懸浮培養(yǎng)的胚性愈傷，30目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，篩下的胚性愈傷均勻分散地接種入體胚成熟培養(yǎng)基，約15d大量的體胚產(chǎn)生后，將體胚繼代入SH培養(yǎng)基，促進(jìn)體胚成苗。3-4片真葉的再生體胚苗移栽入溫室，然后于溫室內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。
實(shí)施實(shí)例5轉(zhuǎn)基因棉花的分子生物學(xué)鑒定
1 、轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學(xué)檢測(cè) 參照J(rèn)efferson(1987)的方法，切取少許再生轉(zhuǎn)基因植株幼嫩的根和葉片組織放入擴(kuò)增管內(nèi)，加入少許GUS組織化學(xué)染色液(500mg/L X-Gluc，0. lmol/L K3Fe(CN)6，0. lmol/LK4Fe(CN)6， 1 % Triton X-100 (v/v) ， 0. Olmol/L Na2EDTA，0. lmol/L磷酸緩沖液(pH7. 0))，37t:暗處理lh，再用75%乙醇脫色，脫色后的根和葉片組織體視鏡下觀察組織著色情況。以野生型植株材料為對(duì)照。組織染成藍(lán)色為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，否則為陰性非轉(zhuǎn)基因植株。 2、 Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花植株內(nèi)Bbchitl基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)
以Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花幼嫩葉片為材料，提取植株RNA，然后用cDNA—鏈合成試劑盒(MBI公司產(chǎn)品)合成各樣品RNA的一鏈cDNA，操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用一鏈產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25ii L PCR擴(kuò)增體系包括cDNA—鏈產(chǎn)物1 y L， IOXPCR緩沖液(無(wú)Mg2+) 2. 5 ii L， 5. 0,1/LdNTP 1 ii L、序歹lJ 7和序歹lj 8引物(5. 0 ii mol/L)各1 ii L，Taq DNA聚合酶1. 0U，25mmol/L MgCl2 2 y L，加入ddH20 (雙蒸水)至25 y L。用棉花組蛋白HIS3基因作內(nèi)標(biāo)，以檢測(cè)RNA質(zhì)量的一致性。HIS3的引物為序列11和序列12(ZhuYQ等，2003)。線性擴(kuò)增程序94。C，5min ;94。C ， 30s， 55°C ， 30s， 72°C ， lmin， 30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。結(jié)果顯示，Bbchitl基因在GUS陽(yáng)性Bbchitl轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)都能有效轉(zhuǎn)錄表達(dá)，部分RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。 3、 LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花植株內(nèi)LjAMP2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)
以LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花幼嫩葉片為材料，提取植株RNA，然后用cDNA —鏈合成試劑盒(MBI公司產(chǎn)品)合成各樣品RNA的一鏈cDNA，操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以一鏈產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25ii L PCR擴(kuò)增體系包括cDNA—鏈產(chǎn)物1 y L， IOXPCR緩沖液(無(wú)]\%2+)2. 5ii L，5. Ommol/L dNTP 1 ii L、序歹lJ 9禾口序歹lj 10引物(5.0iimol/L)各1 ii L，Taq DNA聚合酶1. 0U，25mmol/L MgCl2 2 y L，加入ddH20 (雙蒸水)至25 y L。用棉花組蛋白HIS3基因作內(nèi)標(biāo)，以檢測(cè)RNA質(zhì)量的一致性。HIS3的引物為序列11和序列12 (ZhuYQ等，2003)。線性擴(kuò)增程序94。C，5min ;94。C ， 30s， 55°C ， 30s， 72°C ， lmin， 30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。結(jié)果顯示，LjAMP2基因在GUS陽(yáng)性LjAMP2轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)都能有效轉(zhuǎn)錄表達(dá)，部分RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。 實(shí)施實(shí)例6轉(zhuǎn)基因棉花純合株系的確定 以T2和T3代轉(zhuǎn)基因植株幼嫩葉片為材料，參照J(rèn)efferson(1987)的方法，切取少許轉(zhuǎn)基因植株幼嫩的葉片組織放入擴(kuò)增管內(nèi)，加入少許GUS組織化學(xué)染色液(500mg/LX-Gluc，O. lmol/L K3Fe (CN) 6， 0. lmol/L K4Fe(CN)6，l % Triton X-100 (v/v) ， 0. Olmol/LNa2EDTA， 0. lmol/L磷酸緩沖液(pH7. 0)) ， 37。C暗處理lh，再用75%乙醇脫色，脫色后的葉片組織體視鏡下觀察組織著色情況。T2和T3代植株葉片GUS染色均為陽(yáng)性的株系植株為純合株系。 實(shí)施實(shí)例7同時(shí)整合Bbchitl和LjAMP2基因轉(zhuǎn)基因棉花的獲得 分別選取病情指數(shù)為60-80的Bbchitl和LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花純合T3代植株為親
本，盛花期頭日下午人工去雄，Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花次日授LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花植株的花粉，
LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花次日授Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花植株的花粉。分別獲得Bbchitl和LjAMP2
轉(zhuǎn)基因棉花的正反交雜交后代，該雜交后代即為同時(shí)整合Bbchitl和LjAMP2基因的轉(zhuǎn)基因
棉花。雜交后代分別標(biāo)注為Bbchitl XLjAMP2和LjAMP2XBbchitl 。 實(shí)施實(shí)例8同時(shí)整合Bbchitl和LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花的分子驗(yàn)證 1、 Bbchitl和LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花雜交F工植株中外源基因的PCR檢測(cè) 為了檢測(cè)Bbchitl和LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花雜交Fi代植株中是否同時(shí)整合了 Bbchitl
和LjAMP2基因，以Bbchitl和LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花及其雜交F工代植株的總DNA為模板，以
序列9和序列10為引物擴(kuò)增LjAMP2片段，序列7和序列8為引物擴(kuò)增Bbchitl基因片段，以雙親親本材料的DNA為模板同時(shí)擴(kuò)增Bbchitl和LjAMP2基因片段為對(duì)照。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，以Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花DNA為模板只擴(kuò)增出了與Bbchitl質(zhì)粒相同的特異片段，沒(méi)有擴(kuò)增出LjAMP2質(zhì)粒相同的特異片段(圖6)。以LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花DNA為模板只擴(kuò)增出了與LjAMP2質(zhì)粒相同的特異片段，沒(méi)有擴(kuò)增出Bbchitl質(zhì)粒相同的特異片段(圖7)。而以Bbchitl和LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花雜交代植株DNA為模板同時(shí)擴(kuò)增出了與Bbchitl和LjAMP2質(zhì)粒相同的特異片段(圖8)。說(shuō)明，以Bbchitl和LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花為親本獲得的雜交&代植株中，同時(shí)整合了 Bbchitl和LjAMP2基因。
2、 Bbchitl和LjAMP2基因在雜交F工中的RT-PCR檢測(cè) 為了檢測(cè)Bbchitl和LjAMP2基因在其轉(zhuǎn)基因棉花雜交代植株中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，提取植株葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA —鏈，利用Bbchitl和LjAMP2的引物擴(kuò)增Bbchitl和LjAMP2基因，部分?jǐn)U增結(jié)果見(jiàn)圖9。以代植株的cDNA為模板擴(kuò)增Bbchitl和LjAMP2基因，都能獲得約為840bp和201bp的目標(biāo)特異片段。以RNA為模板擴(kuò)增棉花HIS3基因的對(duì)照中沒(méi)有擴(kuò)增出任何特異條帶，說(shuō)明RNA中沒(méi)有棉花基因組DNA的污染，以cDNA為模板擴(kuò)增獲得的目標(biāo)片段是目標(biāo)基因表達(dá)的結(jié)果。因此，Bbchitl和LjAMP2基因在其轉(zhuǎn)基因植株雜交^代中都能獨(dú)立地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
實(shí)施實(shí)例9轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)落葉型黃萎病的抗病鑒定方法
1、抗病鑒定接種用病原菌的制備 挑取少許固體PDA保存的落葉型黃萎病菌接種入液體PD培養(yǎng)基，180rpm， 25。C振蕩培養(yǎng)7d，再按10% (菌液/PD培養(yǎng)基)的比例接種入液體PD培養(yǎng)基，180rpm， 25。C振蕩培養(yǎng)lOd，用四層無(wú)菌紗布過(guò)濾去除菌液中的菌絲及雜質(zhì)，去離子水調(diào)整孢子濃度達(dá)到108個(gè)/ml的菌液作為接種菌液。 2、人工氣候室內(nèi)抗病鑒定致病菌接種方法 生長(zhǎng)相對(duì)一致3-4片真葉Bbchitl、 LjAMP2純合親本以及同時(shí)整合兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因棉花幼苗，采用傷根灌菌液法接種落葉型黃萎病致病菌。移栽入盆缽時(shí)每株慢慢澆灌落葉型黃萎病菌菌液lOOmL，盡量讓菌液濕潤(rùn)有棉花植株的土壤團(tuán)，接種兩天后澆透水，以保持盆缽內(nèi)土壤的濕度。接種后于2(TC (夜)-25t:(晝)，濕度80X以上，14h光照/10h
暗培養(yǎng)的光周期條件下生長(zhǎng)，接種15d按5級(jí)病級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(0級(jí)棉花植株外表無(wú)病癥；1級(jí)棉株葉片1/3以下顯病癥；2級(jí)棉株葉片1/3-2/3顯病癥；3級(jí)棉株葉片2/3以上顯病癥；4級(jí)棉株葉片全部出現(xiàn)病癥，葉片脫落嚴(yán)重或植株光桿甚至死亡)統(tǒng)計(jì)植株病級(jí)，并計(jì)算植株的病情指數(shù)。以相同生長(zhǎng)時(shí)期的野生型棉花幼苗為對(duì)照，落葉型黃萎病菌接種濃度為
108個(gè)孢子/ml。*100 實(shí)施實(shí)例10同時(shí)整合Bbchitl和LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)落葉型黃萎病的抗性
按實(shí)施實(shí)例9的接種方法，轉(zhuǎn)基因棉花材料于人工氣候室內(nèi)接種落葉型黃萎病致病菌，接種15d， Bbchitl、 LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花純合親本以及同時(shí)整合兩個(gè)基因轉(zhuǎn)基因棉花幼苗植株的病情指數(shù)見(jiàn)圖10。結(jié)果顯示，野生型植株(WT)的病情指數(shù)達(dá)到了 100， LjAMP2和Bbchitl轉(zhuǎn)基因棉花植株的病情指數(shù)分別為77. 26和61. 26，與野生型對(duì)照相比，差異不顯著(P > 0. 05)。相同條件下，Bbchitl和LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花正反交雜交F工代植株的病情指數(shù)分別為16. 61和23. 71，與野生型對(duì)照、Bbchitl和LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花親本相比，差異都極顯著(P<0.01)。接種病原菌后植株的病情指數(shù)表明，在轉(zhuǎn)基因棉花內(nèi)同時(shí)整合并有效表達(dá)Bbchitl和LjAMP2基因，利用二者的協(xié)同作用可有效提高棉花對(duì)落葉型黃萎病的抗性。抗病植株移栽入溫室盆缽，進(jìn)一步進(jìn)行繁殖，結(jié)果顯示，植株生長(zhǎng)發(fā)育正常，能正常開(kāi)花結(jié)實(shí)，對(duì)黃萎病的抗性穩(wěn)定。 上述實(shí)施實(shí)例表明，本發(fā)明通過(guò)有性雜交，實(shí)現(xiàn)了球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchitl和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2在同一植株內(nèi)同時(shí)組成型表達(dá)，利用兩個(gè)基因的協(xié)同作用能有效提高棉花對(duì)落葉型黃萎病的抗性。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便易行，效果顯著，獲得的抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花可為棉花抗黃萎病育種，特別抗落葉型黃萎病育種提供新資源，具有很好的市場(chǎng)前景。 以上實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明詳細(xì)描述但并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明做出各種變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明權(quán)利要求所定義
的范圍。序列表序列1 Bbchitl基因核苷酸序列，長(zhǎng)1047bp1ATGGCTCCTTTTCTTCMACCAGCCTCGCGCTCCTTCCATTGTTGGCTTCCACCATGGTC61AGCGCCTCGCCCTTGGCGCCGCGAGCCGGCACCTGCGCCACCAAAGGCCGGCCGGCCGGC121AMGTGCTCCAGGGCTACTGGGAGAACTGGGACGGTGCCAAGAACGGGGTGCACCCTCCG181TTTGGCTGGACGCCCATCCAMACCCCGACATTCGCAAGCACGGCTACAACGTCATCAAT241GCTGCCTTTCCCATCATCCAGCCTGACGGCACCGCGCTCTGGGAGGACGGCATGGACACG301GGCGTCMGGTGGCGAGCCCGGCCGACATGTGCGAGGCCAAGGCAGCAGGTGCCACCATC361TTGATGTCGATTGGCGGTGCTACTGCGGCCATTGACCTGAGCTCGTCGGCTGTGGCTGAC421AAGTTTGTCTCGACCATTGTGCCGATTCTGAAAAAGTACAACTTTGACGGCATTGATATC481GACATTGAATCCGGCCTCACAGGCAGCGGAAACATAAACACCCTGTCCACCTCGCAGACC541AACCTGATTAGMTCATTGACGGCGTTCTCGCGCAGATGCCCGCCAACTTTGGCTTGACC601ATGGCGCCAGAGACTGCCTACGTTACCGGTGGGACTATTACGTACGGATCAATCTGGGGC661TCTTACCTCCCCATTATCAAMAGTACCTGGACAATGGTCGTCTCTGGTGGCTCAACATG721CAGTACTACAATGGCGMATGTACGGCTGCTCCGGCGACTCGCACAAGGCCGGTACTGTC781GMGGATTCATTGCTCAGACCGACTGCCTGAACAAGGGACTTAGTATTCAGGGCGTGACA841ATCACGATTCCCTATGACAAGCAAGTGCCTGGCCTTCCTGCCCAGCCTGGGGCTGGCGGC901GGCCACATGTCCCCGTCCAACGTGGCGCAAGTTCTCTCCCACTACAAGGGCGCTTTGAAG961GGATTGATGACTTGGTCTCTGAACTGGGACGGCTCCAAGAATTGGACATTTGGCGACAAT1021GTCAAGGGGACTTTGGGGACTGCGTAA序列2 LjAMP2基因全長(zhǎng)序列(288bp)1ATGCTGCAGGGTCGCCAGTTCCGCTCCTGCCAAAGCTACCTTAGGCAGCGTGGGAATGTT61CTAGAAATGGCCACCGGAAACCCTCAGTCGCAGACGGTTGAAGAATGCTGCGAGAGTCTG121AAGGATATTGAGCGGAMCAGCAGCMTGCGGGTGTGAAGCCATCAAGCACGCGATGAGG181CAGATGCAGGGGGGGCAGAGCGAGGAGGTGTATCGAAAGGCTAGGATGCTGCCACGTACT241TGCGGATTAAGGTCACAGCAATGCCAGTTTAATGTTATCTTTGTGTAG序列3 :基因組內(nèi)Bbchitl基因擴(kuò)增引物1
5' -CGG GGT ACC ATG GCT CCT TTT CTT CAA ACC AG-3' 序列4 :基因組內(nèi)Bbchitl基因擴(kuò)增引物2 5' -CG GAA TTC TTA CGC AGT CCC CAA AGT CCC CT-3' 序列5 :LjAMP2基因擴(kuò)增引物1 5' -CG GGA TCC ATG CTG CAG GGT CGC CAG TTC-3' 序列6 :LjAMP2基因擴(kuò)增引物2 5' -CGA GCT CCT ACA CAA AGA TAA CAT TAA ACT GGC_3， 序列7 :轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)Bbchitl基因擴(kuò)增引物1 5' -TGC ACAATG CTGATC GCG-3' 序列8 :轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)Bbchitl基因擴(kuò)增引物2 5' -TGG CAA GCG TTT TCA GGC-3' 序列9 :轉(zhuǎn)基因棉花植株內(nèi)LjAMP2基因擴(kuò)增引物1 5' -CCA GTT CCG CTC CTG CCAAAG-3， 序列10 :轉(zhuǎn)基因棉花植株內(nèi)LjAMP2基因擴(kuò)增引物2 5' -CGA TAC ACC TCC TCG CTC T_3' 序列11 :轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)GhHIS3基因擴(kuò)增引物1 5' -GAA GCC TCA TCG ATA CCG TC—3' 序列12 :轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)GhHIS3基因擴(kuò)增引物2 5' -CTA CCA CTA CCA TCA TGG C_權(quán)利要求
一種利用基因的協(xié)同作用培育抗黃萎病棉花的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)獲得球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchit1和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2，并分別構(gòu)建Bbchit1和LjAMP2基因組成型表達(dá)的植物表達(dá)載體；(2)利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bbchit1和LjAMP2基因組成型表達(dá)的植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入棉花，實(shí)現(xiàn)Bbchit1和LjAMP2基因在棉花內(nèi)的組成型表達(dá)；(3)將步驟(2)獲得的轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行抗病鑒定和選育，篩選黃萎病病情指數(shù)60-80，植株生長(zhǎng)發(fā)育正常的純合株系；(4)分別以步驟(3)獲得的球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchit1和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2轉(zhuǎn)基因棉花純合株系為父本和母本進(jìn)行有性雜交，獲得雜交F1代，實(shí)現(xiàn)球孢白僵菌幾丁酶基因Bbchit1和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2在同一植株內(nèi)同時(shí)進(jìn)行組成型表達(dá)，利用二者的協(xié)同作用提高棉花對(duì)黃萎病的抗病能力。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用基因的協(xié)同作用培育抗黃萎病棉花的方法，其特征在于， 所述步驟(3)的純合株系為步驟(2)獲得的轉(zhuǎn)基因棉花經(jīng)過(guò)抗病鑒定和選育，篩選生長(zhǎng)發(fā) 育正常的純合株系，是指以轉(zhuǎn)基因棉花后代中不再出現(xiàn)GUS基因的分離為標(biāo)準(zhǔn)確定純合株 系，以病情指數(shù)為60-80為標(biāo)準(zhǔn)確定抗病性的提高程度進(jìn)行鑒定。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述利用基因的協(xié)同作用培育抗黃萎病棉花的方法，其特征在于， 所述的抗病鑒定是指于人工氣候室內(nèi)進(jìn)行的抗病鑒定，主要是對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花3-4片真葉幼 苗進(jìn)行傷根后澆灌病原菌孢子液的方法。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用基因的協(xié)同作用培育抗黃萎病棉花方法的應(yīng)用，其特征在 于，適用于培育不同抗真菌病害的植物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述利用基因的協(xié)同作用培育抗黃萎病棉花方法的應(yīng)用，其特征在 于，所述的植物是指通過(guò)有性生殖方式進(jìn)行繁殖的單子葉和雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用基因的協(xié)同作用培育抗黃萎病棉花的方法及其應(yīng)用。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，分別將抗黃萎病的幾丁酶基因Bbchit1和抗菌蛋白基因LjAMP2轉(zhuǎn)入棉花，然后通過(guò)有性雜交將兩個(gè)不同來(lái)源的抗病基因整合到同一植株，實(shí)現(xiàn)不同抗病基因在同一植株內(nèi)同時(shí)組成型表達(dá)，利用兩個(gè)基因的協(xié)同作用有效提高棉花對(duì)黃萎病的抗病能力。結(jié)果表明，利用該方法獲得的轉(zhuǎn)基因棉花人工氣候室接種落葉型黃萎病菌后，病情指數(shù)為10-25，可較野生型對(duì)照降低75％以上。該方法簡(jiǎn)便易行，效果顯著，能為棉花抗黃萎病育種，特別是抗落葉型黃萎病育種提供新的抗源，為棉花生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益，具有很好的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)A01H1/02GK101717784SQ20091019096
公開(kāi)日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日
發(fā)明者侯磊, 宋水清, 李先碧, 李德謀, 羅小英, 羅明, 肖月華, 范艷華, 裴炎 申請(qǐng)人:西南大學(xué)