專利名稱：：一種快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法，屬于農(nóng)業(yè)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：節(jié)瓜枯萎病是節(jié)瓜的主要病害之一，給節(jié)瓜生產(chǎn)造成嚴重損失。目前節(jié)瓜種質(zhì)資源中抗枯萎病材料較為缺乏，是節(jié)瓜抗病育種的瓶頸。目前通用的篩選枯萎病突變體的方法是通過自然發(fā)病篩選或苗期人工接種篩選，前者須在發(fā)病年份、發(fā)病嚴重的田塊進行，受自然條件和季節(jié)的限制；后者雖然可以在人工控制條件下進行，但必須有嚴格的隔離條件，以防病菌擴散到田間。研究者曾建立利用離體篩選技術(shù)篩選節(jié)瓜抗枯萎病無性系的方法，與常規(guī)利用枯萎病菌接種篩選的方法相比，可以提高篩選效率，節(jié)省土地，并且可以避免病菌污染環(huán)境。但離體篩選技術(shù)的不足是必須依賴于成熟的離體培養(yǎng)和植株再生體系，而目前節(jié)瓜離體再生體系受品種類型的制約，有些品種至今無法建立成熟穩(wěn)定的離體再生體系，因而難以進行抗枯萎病材料的離體篩選。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法，該方法具有適應(yīng)性廣，選擇效率高，實用性強，對環(huán)境影響小的特點。本發(fā)明在幼苗水平上利用鐮刀菌酸篩選抗枯萎病變異材料，兼有苗期人工接種篩選不依賴于成熟穩(wěn)定離體培養(yǎng)體系，適應(yīng)性廣的特點，以及抗性離體篩選不受季節(jié)自然條件限制，可以避免病菌污染環(huán)境的特點，一旦篩選出抗性材料，即可立即種植到田間。為達到上述目的，本發(fā)明提供的快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法，將切除部分須根的節(jié)瓜幼苗莖基部浸于濃度為150~250mg/L的鐮刀菌酸溶液中，在2027"條件下浸泡6~9h后，將尚存活無萎蔫或極少萎蔫的幼苗在常規(guī)育苗條件下進行恢復(fù)培養(yǎng)，待幼苗恢復(fù)生長后移栽到田間即可。其中，所述節(jié)瓜幼苗的培育過程為取節(jié)瓜種子用水浸泡35h，在30'C恒溫箱中催芽，待種子萌發(fā)后播種于育苗盤中，按正常育苗程序育苗。進一步的，在按正常育苗程序育苗后，待節(jié)瓜幼苗達到1片真葉展開至2葉1心時移出3植株，用水洗凈根部育苗基質(zhì)，切除部分須根即可。優(yōu)選的，將所述切除部分須根的節(jié)瓜幼苗莖基部浸于鐮刀菌酸溶液中在2327'C浸泡8h。所述鐮刀菌酸的濃度為195~205mg/L。所述鐮刀菌酸溶液的配制過程為取商品鐮刀菌酸，先用少量乙醇溶解后，再用純凈水配制成溶液。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)田間自然篩選方法應(yīng)用的前提是田間必須有節(jié)瓜枯萎病發(fā)生，同時發(fā)病群體的大小、病害發(fā)生的嚴重程度均會影響選擇效果；利用本發(fā)明鐮刀菌酸進行苗期抗枯萎病變異體快速篩選在人工脅迫的條件下進行篩選，脅迫壓力可以人工控制，不受自然氣候條件及病害是否發(fā)生的限制，可以更快地篩選出具有強抗性的材料；(2)與苗期人工接種篩選方法相比，利用鐮刀菌酸進行苗期抗枯萎病變異體快速篩選不用活菌進行接種，且工作可以在實驗室條件下進行，不僅可以節(jié)省土地，還可以避免因人工接種不慎而導(dǎo)致病菌污染環(huán)境；(3)與抗枯萎病變異體離體篩選方法相比，利用鐮刀菌酸進行苗期抗枯萎病變異體快速篩選不依賴于成熟的組織培養(yǎng)技術(shù)，應(yīng)用的范圍較廣，可廣泛應(yīng)用于各種節(jié)瓜育種材料。圖1是切除幼苗全部根系對鐮刀菌酸FA脅迫下幼苗萎蔫指數(shù)的影響；圖2是切除部分須根對鐮刀菌酸FA脅迫下幼苗萎蔫指數(shù)的影響；圖3是感病材料A06在不同濃度鐮刀菌酸和不同浸泡時間條件下對節(jié)瓜幼苗萎蔫指數(shù)的影響；圖4是抗病材料A02在不同濃度鐮刀菌酸和不同浸泡時間條件下對節(jié)瓜幼苗萎蔫指數(shù)的影響。具體實施例方式以下實施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護范圍并非僅僅局限于以下實施例。所述
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容和各參數(shù)所取范圍，均可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。第一部分快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法實施例1本實施例提供的快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法如下將切除部分須根的節(jié)瓜幼苗莖基部浸于濃度為150250mg/L的鐮刀菌酸溶液中，在2025'C條件下浸泡69h后，將尚存活無萎蔫或極少萎蔫的幼苗在常規(guī)育苗條件下進行恢復(fù)培養(yǎng)，待幼苗恢復(fù)生長后移栽到田間即可。實施例2本實施例提供的快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法如下將切除部分須根的節(jié)瓜幼苗莖基部浸于濃度為150250mg/L的鐮刀菌酸溶液中，在2527'C條件下浸泡69h后，將尚存活無萎蔫或極少萎蔫的幼苗在常規(guī)育苗條件下進行恢復(fù)培養(yǎng)，待幼苗恢復(fù)生長后移栽到田間即可。其中，節(jié)瓜幼苗的培育過程為取節(jié)瓜種子用水浸泡35h，在3(TC恒溫箱中催芽，待種子萌發(fā)后播種于育苗盤中，按正常育苗程序育苗，待節(jié)瓜幼苗達到1片真葉展開至2葉1心時，移出植株，用水洗凈根部育苗基質(zhì)，切除部分須根即可。鐮刀菌酸溶液的配制過程為取商品鐮刀菌酸，先用少量乙醇溶解后，再用純凈水配制成溶液。實施例3本實施例提供的快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法如下(1)將節(jié)瓜種子用清水浸種4h，在30'C恒溫箱中催芽，待種子萌發(fā)后播種于育苗盤中，按正常育苗程序育苗；(2)待節(jié)瓜幼苗1片真葉展開到2葉1心時，小心移出植株，用水輕輕洗凈根部育苗基質(zhì)，采用切除部分須根；(3)將商品鐮刀菌酸用少量無水乙醇溶解后，用純凈水配成200mg/L溶液；(4)將切除部分須根的幼苗置于10ml試管中，加入濃度為200mg/L的鐮刀菌酸溶液，是幼苗莖基部浸于溶液中，在25。C土2t:條件下浸泡8h后，將尚存活無萎蔫或極少萎蔫的幼苗重新轉(zhuǎn)到育苗盤中在常規(guī)育苗條件下進行恢復(fù)培養(yǎng)，待幼苗恢復(fù)生長后移栽到田間。第二部分節(jié)瓜抗鐮刀菌酸的離體篩選2.1試驗材料選用節(jié)瓜抗病品種A02和感病品種A06進行鐮刀菌酸抗性篩選試驗；鐮刀菌酸為Sigma公司產(chǎn)品，配制時先用少量無水乙醇溶解，再用純凈水配成不同濃度的溶液。2.2篩選方法52.2.1幼苗處理方法的確定將節(jié)瓜種子播種于育苗盤中，幼苗1片真葉展開到2葉1心時，小心移出植株，用水輕輕洗凈根部育苗基質(zhì)，采用切除部分須根、切除全部根系2種方法處理方式，將幼苗基部浸于鐮刀菌酸FA濃度為200mg/L溶液中，每隔lh觀察萎蔫情況，統(tǒng)計萎蔫指數(shù)，確定適宜的幼苗處理方式。2.2.2鐮刀菌酸濃度的確定利用切除須根的幼苗處理方法，將幼苗基部浸于FA濃度分別為50、100、200、400mg/L的溶液中，每隔lh觀察萎蔫情況，統(tǒng)計萎蔫指數(shù)，確定適宜的鐮刀菌酸處理方式。2.2.3篩選方法有效性的驗證選用抗鐮刀菌酸技術(shù)篩選出的3個抗性株系，用苗期人工接種法(傳統(tǒng)的抗性鑒定技術(shù))進行抗性驗證，調(diào)査其病情指數(shù)。2.3實驗結(jié)果2.3.1幼苗處理方法的確定利用切除部分須根、切除全部根系2種幼苗處理方法，分別將不同處理的幼苗浸于鐮刀菌酸FA濃度為200mg/L的溶液中，觀察其幼苗萎蔫情況。如附圖l所示，發(fā)現(xiàn)切除全部根系的處理無論是抗病材料或感病材料，浸泡2h即可觀察到萎蔫現(xiàn)象，但抗病材料和感病材料的萎蔫指數(shù)均同步上升，至浸16h，感病材料A06的萎蔫指數(shù)達到60%，抗病材料的萎蔫指數(shù)也達到73%，雖然抗/感材料間有一定差異，但區(qū)分度不夠明顯。如附圖2所示，切除部分須根的處理中，感病材料從浸泡2h后植株就開始萎蔫，且萎蔫指數(shù)隨時間延長而快速上升，至浸泡16h，萎蔫指數(shù)已達到75%;而抗病材料則表現(xiàn)出對鐮刀菌酸的高度耐受性，直至浸泡10h才開始出現(xiàn)萎蔫癥狀。因此認為切除部分須根的幼苗處理方式可以將抗性材料和感病材料明顯區(qū)分，適宜用于節(jié)瓜FA抗性篩選。2.3.2鐮刀菌酸濃度的確定將感病材料A06、抗病材料A02的幼苗進行切須根處理后，浸于不同濃度的鐮刀菌酸溶液中，觀察感病材料A06和抗病材料A02在不同濃度鐮刀菌酸和不同浸泡時間條件下對節(jié)瓜幼苗萎蔫指數(shù)的影響。如附圖3所示，對于感病材料A06，鐮刀菌酸濃度為50mg/L時植株未顯示明顯萎蔫現(xiàn)象，濃度為100mg/L時處理伊始萎蔫不明顯，5h以后萎蔫指數(shù)逐漸提高，而濃度為200mg/L和400mg/L時，萎蔫現(xiàn)象發(fā)展迅速，處理4-511萎蔫指數(shù)已經(jīng)超過50%。如附圖4所示，而抗性材料在50mg/L~200mg/L的處理濃度下，植株萎蔫指數(shù)均小于10%，即使400mg/L的濃度下植株萎蔫指數(shù)也僅為19.9%。分析上述結(jié)果認為，鐮刀菌酸濃度為100mg/L~400mg/L時抗病品種和感病品種間萎蔫現(xiàn)象差異顯著，可以作為抗性篩選的濃度，其中200mg/L和400mg/L處理的萎蔫指數(shù)走勢相似，篩選效果穩(wěn)定。因此認為200mg/L是節(jié)瓜幼苗抗性篩選的最佳濃度，經(jīng)大田試驗證實，在鐮刀菌酸的濃度為150250mg/L的鐮刀菌酸溶液中，在2025。C條件下浸泡69h后，將尚存活無萎蔫或極少萎蔫的幼苗在常規(guī)育苗條件下進行恢復(fù)培養(yǎng)，待幼苗恢復(fù)生長后移栽到田間效果很好，尤其是當(dāng)鐮刀菌酸的濃度為195~205mg/L時，將切除部分須根的節(jié)瓜幼苗莖基部浸于鐮刀菌酸溶液中在20-25'C浸泡8h時效果最好。2.3.3篩選方法有效性的驗證利用鐮刀菌酸苗期篩選技術(shù)篩選出的3個抗鐮刀菌酸株系，經(jīng)苗期接種節(jié)瓜枯萎病菌，結(jié)果表明，抗性分別達到抗病水平。表明利用苗期快速篩選技術(shù)篩選節(jié)瓜抗枯萎病材料是有效的。表1抗鐮刀菌酸株系枯萎病抗性表現(xiàn)脅迫8h后苗期人工接種鑒定FA，，，旨m病情指數(shù)抗病等級<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、一種快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法，其特征在于，將切除部分須根的節(jié)瓜幼苗莖基部浸于濃度為150～250mg/L的鐮刀菌酸溶液中，在20～27℃條件下浸泡6～9h后，將尚存活無萎蔫或極少萎蔫的幼苗在常規(guī)育苗條件下進行恢復(fù)培養(yǎng)，待幼苗恢復(fù)生長后移栽到田間即可。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法，其特征在于，所述節(jié)瓜幼苗的培育過程為取節(jié)瓜種子用水浸泡3~5h，在3(TC恒溫箱中催芽，待種子萌發(fā)后播種于育苗盤中，按正常育苗程序育苗。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法，其特征在于，在按正常育苗程序育苗后，待節(jié)瓜幼苗達到1片真葉展開至2葉1心時移出植株，用水洗凈根部育苗基質(zhì)，切除部分須根即可。4、根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法，其特征在于，將所述切除部分須根的節(jié)瓜幼苗莖基部浸于鐮刀菌酸溶液中在2327'C浸泡8h。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法，其特征在于，所述鐮刀菌酸的濃度為195~205mg/L。全文摘要本發(fā)明提供了一種快速篩選節(jié)瓜抗枯萎病變異體的方法，將切除部分須根的節(jié)瓜幼苗莖基部浸于濃度為150～250mg/L的鐮刀菌酸溶液中，在20～27℃條件下浸泡6～9h后，將尚存活無萎蔫或極少萎蔫的幼苗在常規(guī)育苗條件下進行恢復(fù)培養(yǎng)，待幼苗恢復(fù)生長后移栽到田間即可。該方法具有適應(yīng)性廣，選擇效率高，實用性強，對環(huán)境影響小的特點。文檔編號A01H1/04GK101647389SQ20091019230公開日2010年2月17日申請日期2009年9月11日優(yōu)先權(quán)日2009年9月11日發(fā)明者何曉明,彭慶務(wù),謝大森,芹趙申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所