專利名稱：完全弗氏佐劑在制備脛骨炎癥痛模型中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及骨炎癥痛模型，尤其涉及完全弗氏佐劑(CFA)在制 備脛骨炎癥痛模型中的用途。
背景技術(shù)：
骨髓炎是一種常見病，由于炎癥反復(fù)刺激骨膜引起的劇痛嚴(yán)重影響了患者的生活 質(zhì)量。然而目前對骨炎癥引起的疼痛的研究仍鮮見報道，因此應(yīng)用簡單易行的方法建立穩(wěn) 定的骨炎癥模型具有重要的實(shí)踐意義。骨炎癥痛模型的建立將為研究骨髓炎引起的疼痛提 供了一種有價值的動物模型。完全弗氏佐劑(CFA)是一種常用的致炎劑，現(xiàn)有技術(shù)公開了完全弗氏佐劑(CFA) 被廣泛應(yīng)用于腳掌皮膚、踝關(guān)節(jié)炎癥痛等慢性疼痛模型的制作，尚未見有報道可應(yīng)用CFA 制作骨炎癥痛模型。骨炎癥痛模型的建立能為開展骨癌痛的研究提供很有價值的對照模型。癌癥引起 的疼痛即癌癥痛，是臨床上常見的慢性病理性疼痛之一，據(jù)有關(guān)觀察得知，約三分之一的晚 期癌癥患者都會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，腫瘤引起的疼痛已嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。目前，臨床實(shí) 踐中，由于對癌痛機(jī)理認(rèn)識不足，加之各種藥物、療法的諸多局限性，致使相當(dāng)一部分的癌 痛得不到理想控制。近年來的研究表明，癌痛是一種機(jī)理復(fù)雜的慢性疼痛，與神經(jīng)痛、炎癥痛既有相似 但又有不同之處，提示癌痛可能同時具有神經(jīng)痛和炎癥痛兩種因素。以往的研究均是采用 癌痛與腳掌或深部組織炎癥痛模型進(jìn)行比較研究，其中，有研究表明皮膚等淺表組織與關(guān) 節(jié)、肌肉等機(jī)體深部組織感覺纖維投射不同，因此認(rèn)為，機(jī)體淺表組織與深部組織的炎癥疼 痛機(jī)理上存在差別。由此可見，采用腳掌或深部組織炎癥痛模型與癌痛進(jìn)行比較所得結(jié)論 尚存在一定的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供完全弗氏佐劑(CFA)在制備脛骨炎癥痛模型中的用途。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供應(yīng)用完全弗氏佐劑(CFA)制備的脛骨炎癥痛模型。本發(fā)明的應(yīng)用CFA制作骨炎癥痛模型，能為開展骨癌痛研究提供更合適的骨炎癥 對照模型，也為骨炎癥痛研究提供一個有用的實(shí)驗(yàn)動物模型。本發(fā)明通過下述方法制備所述的骨炎癥痛模型實(shí)驗(yàn)動物麻醉以后，膝關(guān)節(jié)部位剔毛，皮膚消毒，膝關(guān)節(jié)屈曲狀態(tài)下，采用本領(lǐng)域 常規(guī)方法技術(shù)將CFA置入實(shí)驗(yàn)動物脛骨骨髓腔內(nèi)后，碘敷消毒，繼續(xù)飼養(yǎng)2 16天即建成 脛骨炎癥痛模型。本發(fā)明中，采用的實(shí)驗(yàn)動物優(yōu)選為大鼠，更優(yōu)選SD或者Wistar大鼠，體重100 300 克。具體的，所述的大鼠經(jīng)8%水合氯醛腹腔注射麻醉后，膝關(guān)節(jié)部位剔毛，皮膚以碘敷或70%酒精消毒，膝關(guān)節(jié)屈曲狀態(tài)下，在膝關(guān)節(jié)處(髕韌帶邊緣)沿脛骨縱軸走向往脛骨 遠(yuǎn)端腔內(nèi)，置入CFA5 30ul，碘敷消毒繼續(xù)飼養(yǎng)2 16天即建成脛骨炎癥痛模型。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)大鼠取膝關(guān)節(jié)屈曲狀態(tài)，CFA置入點(diǎn)緊貼大鼠膝關(guān)節(jié)臏韌帶的 外側(cè)或內(nèi)側(cè)斜至脛骨髁間隆起處，CFA置入方向與脛骨縱軸方向一致。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中，所述的CFA制備骨炎癥痛模型在無菌條件下進(jìn)行。本發(fā)明對應(yīng)用CFA制備的骨炎癥痛模型進(jìn)行了脛骨組織病理和行為學(xué)指標(biāo)測試， 所述的行為學(xué)指標(biāo)包括熱痛閾值變化、機(jī)械痛閾值變化等相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)鼠的 炎癥顯著，行為學(xué)指標(biāo)水平較低。本發(fā)明采用CFA制得脛骨炎癥痛模型。該骨炎癥痛模型將為骨癌痛研究尤其是癌 痛的機(jī)制研究提供有價值的骨炎癥痛對照模型；為研究臨床骨髓炎引起的疼痛提供了有價 值的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用時豐富了慢性疼痛實(shí)驗(yàn)動物模型類型，具有重要的學(xué)術(shù)研究價值和應(yīng)用 前景。


圖1為脛骨炎癥痛模型第2天的大鼠脛骨HE病理切片，其中，A、B為生理鹽水組，C、D為CFA組第2天，E、F為CFA組第14天。圖2為脛骨炎癥痛模型大鼠CFA接種側(cè)后肢機(jī)械性痛閾變化情況。圖3為脛骨炎癥痛模型大鼠CFA接種對側(cè)后肢機(jī)械性痛閾變化情況。圖4為脛骨炎癥痛模型大鼠CFA接種側(cè)后肢腳掌熱痛閾變化情況。圖5為脛骨炎癥痛模型大鼠CFA接種對側(cè)后肢腳掌熱痛閾變化情況。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實(shí)施例11.材料和方法致炎劑完全弗氏佐劑(CompleteFreund ‘ s adjuvant, CFA)，購自 Sigma-Aldrich中國分公司；動物SD雌性大鼠，體重140 160克，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供；主要儀器vonFrey hair (Stoelting, Wood Dale, Illinois,USA)；輻射熱測痛儀 (Model 390 Paw Stimulator Analgesia Meter, IITC/Life ScienceInstruments, USA)；造模方法模型組大鼠經(jīng)8%水合氯醛腹腔注射麻醉后，膝關(guān)節(jié)部位剔毛，表面皮膚以碘敷 或70%酒精消毒，膝關(guān)節(jié)屈曲狀態(tài)下，在大鼠膝關(guān)節(jié)處(髕韌帶邊緣)沿脛骨縱軸走向往脛 骨遠(yuǎn)端處髓腔內(nèi)，置入5 30ul CFA，碘敷消毒；對照組大鼠脛骨髓腔內(nèi)置入等體積的生理鹽水，其余操作同模型組。2.指標(biāo)測定2. 1脛骨組織病理學(xué)大鼠以8 %水合氯醛麻醉后，經(jīng)4 %多聚甲醛灌流后取脛骨，經(jīng)脫鈣石蠟包埋切片(7um)，HE染色，鏡下觀察脛骨炎癥情況。2. 2 行為學(xué)分別于造模前及造模后第2、4、6、8、10、12、14、16天用von Freyhair和輻射熱法 測定機(jī)械痛閾值和熱痛閾值。機(jī)械痛閾測定安靜環(huán)境中，室溫22士 1°C，大鼠置于底為網(wǎng)格的特制有機(jī)玻璃格 子Q6X20 X Hcm)內(nèi)，適應(yīng)20分鐘后，根據(jù)Dixon介紹的up-and-down法，將一系列von Frey 細(xì)絲(0. 4g，0. 6g，1. 4g，2. 0g, 4. 0g, 6. 0g, 8. 0g, 15. Og)按照一定的順序刺激大鼠腳掌 中部皮膚，觀察大鼠縮足反應(yīng)。每根細(xì)絲每次刺激時間為1 2秒，前后兩次不同刺激間隔 10分鐘，然后用軟件計算出50% von Frey反應(yīng)閾值作為機(jī)械性痛閾值。熱痛閾值測定安靜環(huán)境中，室溫22士 1°C，熱痛覺過敏采用，大鼠置于底為光滑 玻璃的有機(jī)玻璃格子內(nèi)，適應(yīng)20分鐘待大鼠安靜后，將強(qiáng)熱光束照射至大鼠腳掌中心皮 膚，引起大鼠縮爪反應(yīng)的時間為大鼠縮爪潛伏期(paw withdrawal latency，PWL)，輻射熱 強(qiáng)度設(shè)定在引起正常大鼠縮爪潛伏期為10 12秒，取3次算平均值，兩次間隔10分鐘，結(jié) 果以痛覺過敏分?jǐn)?shù)(=模型側(cè)縮爪潛伏期-正常側(cè)縮爪潛伏期)表示。為防止大鼠熱輻射 燙傷，將的上限值(cut-off time)定為20秒。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSSl 1. 0軟件進(jìn)行方差分析，以P < 0. 05認(rèn)為差異有顯著性。3.結(jié)果3.1脛骨組織病理學(xué)造模后第二天的脛骨病理切片顯示，與注射生理鹽水組相比，注射CFA組大鼠脛 骨骨髓腔內(nèi)細(xì)胞核固縮、碎裂顯著，有大量的嗜中性粒細(xì)胞，同時可觀察到明顯的纖維素性 滲出，提示炎癥顯著。注射CFA第14天脛骨內(nèi)可觀察到顯著的組織纖維化(如圖1所示，)。3. 2行為學(xué)機(jī)械痛閾(如圖2所示)與正常組、生理鹽水注射組相比，CFA10ul、20ul、30ul模 型組大鼠CFA注射側(cè)后肢對von Frey刺激引起的機(jī)械性痛閾值在造模后第2天開始顯著 降低(P < 0. 01)，直到造模后第16天一直維持在較低水平。注射CFAlOul、20ul、30ul各組 間注射側(cè)后肢機(jī)械性痛閾無顯著性差異(P > 0. 05)。(如圖3所示)與正常組、生理鹽水 組相比，CFAlOul、20ul、30ul模型組大鼠CFA注射對側(cè)后肢對von Frey刺激引起的機(jī)械性 痛閾值在造模后第2天開始均有不同程度降低，以后逐漸降低，直到造模后第16天一直維 持在較低水平(P < 0. 05)。而注射生理鹽水組大鼠雙側(cè)后肢機(jī)械性痛閾與正常組大鼠無顯 著性差異(P > 0. 05)。熱痛閾(如圖4、5所示)與正常組大鼠相比，注射生理鹽水對照組、注射 CFAlOul、20ul、30ul模型組大鼠雙側(cè)后肢對輻射熱刺激引起的熱痛閾無顯著改變(ρ > 0. 05)。
權(quán)利要求
1.完全弗氏佐劑在制備脛骨炎癥痛模型中的用途。
2.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的脛骨炎癥痛模型是大鼠脛骨炎癥痛 模型。
3.按權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述的脛骨炎癥痛模型按下述方法制備實(shí)驗(yàn) 大鼠麻醉以后，膝關(guān)節(jié)部位剔毛，皮膚消毒，膝關(guān)節(jié)屈曲狀態(tài)下，采用本領(lǐng)域常規(guī)方法技術(shù) 將完全弗氏佐劑置入實(shí)驗(yàn)大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)后，碘敷消毒，繼續(xù)飼養(yǎng)2 16天，建成脛骨炎 癥痛模型。
4.按權(quán)利要求3所述的用途，其中所述的實(shí)驗(yàn)大鼠為SD或Wistar大鼠，體重為100 300 克。
5.按權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的實(shí)驗(yàn)大鼠采用8%水合氯醛腹腔麻 醉，其皮膚以碘敷或70%酒精消毒；所述的完全弗氏佐劑的置入量為5 30ul。
6.按權(quán)利要求3所述的用途，其中所述的脛骨炎癥痛模型在無菌條件下制備。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及骨炎癥痛模型，尤其涉及完全弗氏佐劑CFA在制備脛骨炎癥痛模型中的用途。本發(fā)明對應(yīng)用完全弗氏佐劑CFA制備的骨炎癥痛模型進(jìn)行了脛骨組織病理和熱痛閾值和機(jī)械痛閾值等行為學(xué)指標(biāo)測試，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难装Y顯著，行為學(xué)指標(biāo)水平較低。本發(fā)明制得脛骨炎癥痛模型將為骨癌痛研究尤其是癌痛的機(jī)制研究提供有價值的骨炎癥痛對照模型；為研究臨床骨髓炎引起的疼痛提供了有價值的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用時豐富了慢性疼痛實(shí)驗(yàn)動物模型類型，具有重要的學(xué)術(shù)研究價值和應(yīng)用前景。
文檔編號A01K67/027GK102068693SQ20091019923
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日
發(fā)明者楊長江, 毛應(yīng)啟梁, 王彥青 申請人:復(fù)旦大學(xué)