專利名稱：一種改良禾谷類作物耐鹽性狀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及以種子作為繁殖方式的禾谷類作物的耐 鹽性狀的改良方法。
背景技術(shù)：
以種子作為繁殖方式的禾谷類作物中，小麥和水稻是我國(guó)的主要糧食作物，大麥 是我國(guó)制造啤酒的主要原料和藏區(qū)人民的主要糧食作物。隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的迅速發(fā) 展，人口增長(zhǎng)與可耕地減少的矛盾日益突出。我國(guó)擁有大片含鹽量不等的土壤，培育耐鹽性 提高的禾谷類作物可以增加我國(guó)的可耕地面積，提高糧食總產(chǎn)。以種子作為繁殖方式的禾谷類作物，例如小麥和水稻的耐鹽性較差，大麥的耐鹽 性一般，急需通過(guò)遺傳改良的方法，培育耐鹽性提高的新品種。通常大多采用誘變手段，在 其后代中篩選耐鹽性提高的變異材料；采用雜交育種方法，在其后代中篩選耐鹽性提高的 性狀重組優(yōu)良株系。也有通過(guò)花藥培養(yǎng)方法獲取耐鹽性提高的株系的報(bào)道。小孢子培養(yǎng)是真正意義上的單倍體細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)NaCl脅迫的反應(yīng)比花藥更為敏 感，并且每一攜帶抗鹽基因的細(xì)胞所受的脅迫更為相當(dāng)一致，小孢子經(jīng)NaCl脅迫培養(yǎng)后存 活的再生植株全部為單倍體或加倍單倍體植株。在小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng) 三個(gè)過(guò)程中連續(xù)給予NaCl脅迫處理后更易獲得耐鹽性提高的變異體或重組體材料。本領(lǐng)域仍需要獲得以種子作為繁殖方式的禾谷類作物耐鹽性狀的種質(zhì)材料，在我 國(guó)濱海鹽漬土上能夠大量種植，有效利用有限資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)禾谷類現(xiàn)有種質(zhì)材料中缺乏耐鹽品種的不足，提供一種新的禾谷類耐 鹽株系的獲得及離體篩選的方法，且篩選條件易于統(tǒng)一控制，不受外界自然條件的限制。因此，本發(fā)明第一方面涉及一種改良禾谷類作物耐鹽性狀的方法，該方法包括1)取該作物孕穗期的花藥游離小孢子，置于添加有NaCl 50 500mg/L的預(yù)處理 液中，獲取存活、耐鹽的小孢子；2)收集步驟1)獲得的小孢子置于添加NaCl 50 500mg/L、2，4，5-T 0. 5 2. 0mg/L、KT 0. 3 1. Omg/L，麥芽糖60 120g/L，pH 5. 6 6. 0的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 獲取胚狀體；3)將步驟2)所得胚狀體置于添加NaCl 50 500mg/L、6_BA 0. 5 1. 5mg/L、KT 0. 5 2. Omg/L、NAA 0. 01 0. lmg/L 和麥芽糖 10 50g/L, pH 為 5. 6 6. 0 的 2/3MS 分 化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取再生植株；4)將步驟3)獲得的再生植株置于添加NAA 0. 02 0. 08mg/L、多效唑2. 0 10. Omg/L和蔗糖10 40g/L, ρΗ5· 6 6. 0的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取根、莖、 葉完整的再生植株；從而獲得耐鹽性提高的禾谷類作物。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述方法還包括5)將步驟4)所得的再生植株移入土壤，待成熟后收獲種子；和6)將種子置于添加NaCl 50 500mg/L的培養(yǎng)基上發(fā)芽，選擇NaCl耐性強(qiáng)的材 料。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述禾谷類作物是大麥、小麥和水稻。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有200 400mg/L的NaCl，0. 8 1. 5mg/ L 的 2，4，5-T, 0. 4 0. 8mg/L 的 KT,和 80 100g/L 的麥芽糖，pH 為 5. 6 5. 9。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述2/3MS分化培養(yǎng)基含有200 400mg/L的NaCl，0. 4 1. Omg/L 的 6-BA, 1. 0 1. 8mg/L 的 KT, 0. 02 0. 08mg/L 的 NAA, 20 40g/L 的麥芽糖，pH 為 5. 7 5. 8。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基含有0. 03 0. 06mg/L的NAA， 3. 0 8. Omg/L 的 MET, 20 30g/L 的蔗糖，pH 為 5. 8 5. 9。在一優(yōu)選實(shí)施例中，該方法包括1)取所述作物孕穗期花藥游離小孢子，置于添加NaCl 50 500mg/L的預(yù)處理液 中，獲取存活、耐鹽的小孢子；2)收集處理后的小孢子置于添加NaCl 50 500mg/L、2，4，5-T 0. 5 2. Omg/L、 KT 0. 5 1. 0mg/L,麥芽糖90g/L，pH 5. 8的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取胚狀體；3)胚狀體置于添加 NaCl 50 500mg/L、6_BA 0. 5 1. 5mg/L、KT 0. 5 2. Omg/ L、NAA 0. 01 0. lmg/L和麥芽糖30g/L，PH為5. 8的2/3MS分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取再生 植株；4)再生植株置于添加 NAA 0. 05mg/L、多效唑(MET) 5. 0mg/L 和蔗糖 20g/L，pH5. 8 的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取根、莖、葉完整的再生植株；5)再生植株移入土壤，待成熟后收獲種子；和6)將種子置于添加NaCl 50 500mg/L的培養(yǎng)基上發(fā)芽，選擇NaCl耐性強(qiáng)的材 料。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述預(yù)處理液含有NaCl 50 500mg/L、甘露醇40 80g/L、 CaCl2O. 8 1. 5g/L 和 MES 0. 6 1. 5g/L。本發(fā)明另一方面涉及一種用于實(shí)施本發(fā)明所述的方法的套盒，所述套盒含有本文 所述的預(yù)處理液、N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基、2/3MS分化培養(yǎng)基和/或1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基。在一優(yōu)選實(shí)施例中，在所述套盒中所述預(yù)處理液含有NaCl 50 500mg/L、甘露醇 40 80g/L、CaCl20. 8 1. 5g/L、 和 MES 0. 6 1. 5g/L ；所述N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有 200 400mg/L 的 NaCl，0. 8 1. 5mg/L 的 2，4，5-T，0. 4
0.8mg/L 的 KT,和 80 100g/L 的麥芽糖，pH 為 5. 6 5. 9 ；所述2/3MS 分化培養(yǎng)基含有 200 400mg/L 的 NaCl，0. 4 1. 0mg/L 的 6-BA，1. 0
1.8mg/L 的 KT, 0. 02 0. 08mg/L 的 NAA, 20 40g/L 的麥芽糖，pH 為 5. 7 5. 8 ；所述1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基含有0. 03 0. 06mg/L的NAA，3. 0 8. 0mg/L的MET， 20 30g/L的蔗糖，pH為5. 8 5. 9。在一方面，本申請(qǐng)也包括本文所述的預(yù)處理液、N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基、2/3MS分化培養(yǎng)基
5和1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基。
具體實(shí)施例方式本申請(qǐng)涉及一種改良禾谷類作物耐鹽性狀的方法，該方法包括1)取該作物孕穗期的花藥游離小孢子，置于添加NaCl 50 500mg/L的預(yù)處理液 中，獲取存活、耐鹽的小孢子；2)收集處理后的小孢子置于添加NaCl 50 500mg/L、2，4，5-T 0. 5 2. Omg/L、 KT 0. 3 1. Omg/L，麥芽糖60 120g/L，pH 5. 6 6. 0的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取胚狀 體；3)胚狀體置于添加 NaCl 50 500mg/L、6_BA 0. 5 1. 5mg/L、KT 0. 5 2. Omg/ L、NAA 0. 01 0. lmg/L和麥芽糖10 50g/L，pH為5. 6 6. 0的2/3MS分化培養(yǎng)基上培 養(yǎng)，獲取再生植株；4)再生植株置于添加NAA 0. 02 0. Oftng/L、多效唑2. 0 10. Omg/L和蔗糖10 40g/L, pH5. 6 6. 0的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取根、莖、葉完整的再生植株；由此可獲得耐鹽性提高的禾谷類作物。實(shí)施本申請(qǐng)時(shí)，可從大田選取中部小花小孢子發(fā)育處于單核早期、中期的穗子， 放入冰箱冷藏12 20天左右。接種時(shí)，先用例如飽和的漂白粉溶液消毒穗子大約15 20min,然后用無(wú)菌水沖洗2 4次。每個(gè)試管接大約10 15個(gè)穗子，倒入約15 20ml 的 NaCl 50 500mg/L、甘露醇 40 80g/L、CaCl2O. 8 1. 5g/L、MES 0. 6 1. 5g/L 的提 取液，用高速分散器超速(例如3000-4000rpm)旋切，150目篩網(wǎng)過(guò)濾，低速(例如800 IOOrpm)離心濾液，重復(fù)2 3次，收集小孢子。然后用NaCl 50 500mg/L、甘露醇 40 80g/L、CaCl20. 8 1. 5g/L,MES(2-嗎啉 乙磺酸)0. 6 1. 5g/L的提取液(預(yù)處理液)于25°C左右、黑暗預(yù)處理小孢子1 3天。提取液中NaCl的優(yōu)選濃度范圍為200 400mg/L，更優(yōu)選可以為約300mg/L。甘露醇的優(yōu)選濃度范圍為50 70g/L，更優(yōu)選為約60g/L。CaCl2的優(yōu)選濃度范圍為1. 0 1. 3g/L，更優(yōu)選為約1. lg/L。MES的優(yōu)選濃度范圍為0. 8 1. 2g/L，更優(yōu)選為約1. 0 1. 2g/L。在一個(gè)具體實(shí) 施例中，MES的濃度為0. 976g/L。可用誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚狀體。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加有NaCl 50 500mg/L、2，4，5-T 0. 5 2. 0mg/L、KT 0. 3 1. Omg/L，麥芽糖 60 120g/L，pH 5. 6 6. 0。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，NaCl的優(yōu)選濃度范圍為200 400mg/L。在一具體實(shí)施例中，NaCl 的濃度為300mg/L。2，4，5-Τ(2，4，5_三氯苯氧乙酸)的優(yōu)選濃度范圍為0. 8 1. 5mg/L，更優(yōu)選為 1. 0 1. 2mg/L。KT (6-糠氨基嘌呤)的優(yōu)選濃度范圍為0.4 0.8mg/L，更優(yōu)選為0. 5 0.6mg/L。麥芽糖的優(yōu)選濃度范圍為80 100g/L。在一具體實(shí)施例中，麥芽糖的濃度為90g/ L0pH優(yōu)選為5. 6 5. 9，更優(yōu)選為5.8。
誘導(dǎo)培養(yǎng)前可將現(xiàn)有誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗滌小孢子1到2次，然后用誘導(dǎo)培養(yǎng)基將 小孢子密度調(diào)節(jié)至1. 0 1. 2XioVml,取大約1. 5 2ml小孢子懸浮液接種于培養(yǎng)皿 (30X 15mm) ,Parafilm封口，室溫下(大約25 )暗培養(yǎng)約15 25天。N6培養(yǎng)基的配方如下表1所示(單位mg/L)
表1
N6大量元素
(NH4)2SO4463
KNO32830
CaCl2 · 2H20166
MgSO4 · 7H20185
KH2PO4400
N6微量元素
H3BO31. 6
KI0. 83
MnSO4 · 4H205. 0
ZnSO4 · 7H201. 5
N6鐵鹽
Na2EDTA37. 3
FeSO4 · 7H2027. 8
N6有機(jī)元素
鹽酸硫胺素1. 0
鹽酸吡多辛0. 5
甘氨酸2. 0
煙酸0. 5
肌醇100. 0
N6培養(yǎng)基可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化學(xué)試劑公司購(gòu)買成
然后
根據(jù)本文所述配方配制本文的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可對(duì)上述表1所示 的濃度作出適當(dāng)?shù)淖儎?dòng)，例如有大約5% (例如3%左右、2%左右、左右，或更低的變動(dòng) 范圍)或更低的變動(dòng)，由此配制得到的培養(yǎng)基仍然具有所需的生物學(xué)功能，仍能用于實(shí)施 本發(fā)明。例如，以肌醇為例，每升N6培養(yǎng)基中可含有大約95 105mg的肌醇(5%的變動(dòng)幅 度)。其它成分的濃度也如此變動(dòng)。此外，N6培養(yǎng)基中的成分也可使用功能和性質(zhì)相同或 相似的成分加以替換。誘導(dǎo)培養(yǎng)后可將所得胚狀體轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上。分化培養(yǎng)基以2/3MS為基本培 養(yǎng)基，其中加有 NaCl 50 500mg/L、6-BA 0. 5 1. 5mg/L、KT 0. 5 2. 0mg/L、NAA 0. 01 0. lmg/L 和麥芽糖 10 50g/L, pH 為 5. 6 6. 0。分化培養(yǎng)基中所添加的NaCl優(yōu)選為200 400mg/L，更優(yōu)選300 400mg/L。6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)的優(yōu)選濃度為0. 4 1. Omg/L,更優(yōu)選為0. 5 0. 8mg/L。KT的優(yōu)選濃度為1. O 1. 8mg/L,更優(yōu)選為1. 2 1. 5mg/L。NAA (萘乙酸)的優(yōu)選濃度0. 02 0. 08mg/L,更優(yōu)選為0. 03 0. 06mg/L。在一具體實(shí)施方式
中，NAA的濃度為0. 05mg/L。麥芽糖的濃度為20 40g/L，更優(yōu)選為20 30g/L。分化培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為5. 7 5. 8。MS培養(yǎng)基的配方如下表2所示(單位mg/L)
0085]表 2
0086]MS大量元素
0087]NH4NO41650
0088]KNO31900
0089]CaCl2 · 2H20440
0090]MgSO4 · 7H20370
0091]KH2PO4170
0092]MS微量元素
0093]H3BO336. 2
0094]KI0. 83
0095]MnSO4 · 4H2022. 3
0096]ZnSO4 · 7H208. 6
0097]Na2MoO4 · 2H200. 25
0098]CuSO4 · 5H200. 025
0099]CoCl2 · 6H200. 025
0100]MS 鐵鹽
0101]Na2EDTA37. 3
0102]FeSO4 · 7H2027. 8
0103]MS有機(jī)元素
0104]鹽酸硫胺素0. 1
0105]鹽酸吡多辛0.5
0106]煙酸0.5
0107]甘氨酸2.0
0108]肌醇100.0MS可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化學(xué)試劑公司購(gòu)買成品。2/3MS培養(yǎng) 基則是將MS培養(yǎng)基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機(jī)元素不變。然后根據(jù)本文 所述配方配制本文的2/3MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可對(duì)上述表1所示的濃 度作出適當(dāng)?shù)淖儎?dòng)，例如有大約5 % (例如3 %左右、2 %左右、1 %左右，或更低的變動(dòng)范圍) 或更低的變動(dòng)，由此配制得到的培養(yǎng)基仍然具有所需的生物學(xué)功能，仍能用于實(shí)施本發(fā)明。 例如，以肌醇為例，每升2/3MS培養(yǎng)基中可含有大約95 105mg的肌醇(5%的變動(dòng)幅度)。 其它成分的濃度也如此變動(dòng)。此外，2/3MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的成分也可使用功能和性質(zhì)相同或 相似的成分加以替換。在一具體實(shí)施例中，使用添加了NaCl 300mg/L、6-BA 0. 5mg/L、KT 1. 5mg/L、NAA 0. 05mg/L和麥芽糖30g/L，PH為5. 8的2/3MS分化培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)胚狀體。可在25士 1°C，每天10 12小時(shí)光照的條件下分化脅迫培養(yǎng)25 30天，直至分化出綠色再生植株。分化出的再生植株可轉(zhuǎn)入NAA 0. 02 0. 08mg/L、多效唑(MET) 2. 0 10. Omg/L和 蔗糖10 40g/L，pH5. 6 6. O的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基。在25士 1°C，每天10 12小時(shí) 光照的條件下進(jìn)行25 30天的生根壯苗培養(yǎng)。生根壯苗培養(yǎng)基中，NAA的優(yōu)選濃度范圍為0. 03 0. 06mg/L,更優(yōu)選為0. 04
0.05mg/LoMET的優(yōu)選濃度范圍為3. O 8. Omg/L，更優(yōu)選為4. O 6. Omg/L。在一具體實(shí)施例中，MET的濃度為5. Omg/L。蔗糖的優(yōu)選濃度范圍為20 30g/L。在一具體實(shí)施例中，蔗糖的濃度為20g/L。生根壯苗培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為5.8 5.9。1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基是將表2所示的MS培養(yǎng)基的大量元素減半，并加入本申請(qǐng) 所述的添加成分后而配制得到。在一具體實(shí)施例中，生根壯苗培養(yǎng)基是添加NAA 0. 05mg/L、多效唑(MET) 5. Omg/L 和蔗糖20g/L，pH5. 8的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基。經(jīng)生根壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的再生植株即為耐鹽植株。在本申請(qǐng)的具體實(shí)施方式
中，本申請(qǐng)的方法還可包括5)將經(jīng)生根壯苗培養(yǎng)的再生植株移入土壤，待成熟后收獲種子；和6)將種子置于添加NaCl 50 500mg/L的培養(yǎng)基上發(fā)芽，選擇NaCl耐性強(qiáng)的材 料。經(jīng)過(guò)生根壯苗培養(yǎng)的耐鹽植株成為根莖葉齊全的完整植株，移栽前1天先將培養(yǎng) 瓶打開(kāi)，在實(shí)驗(yàn)室中煉苗。煉苗結(jié)束后，用鑷子小心地把植株從培養(yǎng)瓶中移出，盡量保持根 系的完整，洗去附著的培養(yǎng)基，將苗移入育苗缽中，澆水后用塑料薄膜罩住，保濕2 3天。 去掉塑料薄膜后在20士 1°C，每天10 12小時(shí)光照的條件下生長(zhǎng)至成熟。成熟后的種子按 株收獲?？蛇x用直徑9cm的培養(yǎng)皿，清洗干凈后滅菌并烘干，放入兩張濾紙。每個(gè)株系選取 大約30 40粒健康種子，用例如3%雙氧水(H2O2)消毒6 lOmin，蒸餾水沖洗2 3次， 然后在大約30°C左右將種子浸泡于蒸餾水6 8小時(shí)，結(jié)束后保濕過(guò)夜。等種子露白后均 勻排放于培養(yǎng)皿中間，加入5 15g/L、較佳8 12g/L的NaCl溶液，用蒸餾水作對(duì)照，并將 所有培養(yǎng)皿置于約27°C恒溫每天10 12小時(shí)光照的光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽。5天后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽 率、主根長(zhǎng)度、胚芽鞘長(zhǎng)度?？蛇x擇發(fā)芽率高、主根長(zhǎng)度、胚芽鞘長(zhǎng)度與對(duì)照相比差異小的株系種植于大田。因此，本申請(qǐng)也包括采用本申請(qǐng)方法篩選得到的植株、及其它繁殖材料等。本申請(qǐng)也包括用于實(shí)施本申請(qǐng)方法的上述各種提取液和培養(yǎng)基。本申請(qǐng)另一方面提供一種提取液，所述提取液含有NaCl 50 500mg/L、甘露醇 40 80g/L、CaCl2O. 8 1. 5g/L、MES 0. 6 1. 5g/L。本申請(qǐng)也包括一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用于實(shí)施本申請(qǐng)所述的篩選方法。該誘導(dǎo)培養(yǎng)基 以N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加有NaCl 50 500mg/L、2，4，5-T 0. 5 2. 0mg/L、KT 0. 3
1.0mg/L，麥芽糖 60 120g/L, pH 5. 6 6. 0。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，NaCl的優(yōu)選濃度范圍為200 400mg/L。在一具體實(shí)施例中，NaCl的濃度為300mg/L。2,4,5-T的優(yōu)選濃度范圍為0. 8 1. 5mg/L，更優(yōu)選為1. 0 1. 2mg/L。KT的優(yōu)選濃度范圍為0. 4 0. 8mg/L，更優(yōu)選為0. 5 0. 6mg/L。麥芽糖的優(yōu)選濃度范圍為80 100g/L。在一具體實(shí)施例中，麥芽糖的濃度為90g/ L0pH優(yōu)選為5.6 5. 9，更優(yōu)選為5.8。本申請(qǐng)還包括含有上述甘露醇提取液、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根壯苗培養(yǎng) 基的套盒。各提取液和培養(yǎng)基可分裝在不同的容器中。任選地，該套盒還可包括指導(dǎo)使用 其中所包含的試劑實(shí)施獲得耐鹽性狀穩(wěn)定的材料的方法的說(shuō)明書(shū)。本申請(qǐng)中，所述禾谷類作物包括大麥、小麥和水稻。與傳統(tǒng)育種方法相比，本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，易于掌握、實(shí)施；耐鹽株系的獲得和耐鹽 性狀的篩選都在實(shí)驗(yàn)室完全一致的條件下進(jìn)行，不受外界條件的影響；利用小孢子作為起 始材料，可獲得大量的胚狀體，在小孢子培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行耐鹽性狀離體篩選，可嚴(yán)格篩選， 大膽淘汰；整個(gè)過(guò)程都在培養(yǎng)室中進(jìn)行，同時(shí)又降低了勞動(dòng)力和農(nóng)田的使用，且可周年重復(fù) 試驗(yàn)，不斷提供篩選材料，既縮短了育種時(shí)間，又能獲得大量的種質(zhì)材料；采用小孢子、胚狀 體誘導(dǎo)和再生植株分化三個(gè)階段分別進(jìn)行離體耐鹽篩選，并結(jié)合耐鹽株系種子萌發(fā)過(guò)程中 的回復(fù)篩選，篩選結(jié)果真實(shí)可信。申請(qǐng)人:的實(shí)驗(yàn)表明，利用本發(fā)明可在不到半年的時(shí)間內(nèi)完成禾谷類株系篩選，獲 得耐鹽性狀穩(wěn)定的材料種植后獲得種子用于進(jìn)一步的田間檢測(cè)。本發(fā)明可大大縮短育種時(shí) 間。所得材料是經(jīng)過(guò)三步篩選，經(jīng)過(guò)染色體加倍后耐鹽性狀得以純合、固定，同一株系的后 代，表現(xiàn)統(tǒng)一。利用本發(fā)明，在一年時(shí)間內(nèi)，已離體篩選獲得5份耐鹽株系。因此，本發(fā)明另一方面還包括采用本發(fā)明方法獲得的各步驟所產(chǎn)生的胚狀體、最 后所獲得的耐鹽株系等。下文將以大麥為例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。應(yīng)理解，在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情 況下可對(duì)本發(fā)明做出各種修改和變動(dòng)。且也可采用本發(fā)明的方法用于其它禾谷類作物，并 能產(chǎn)生相同的效果。以下實(shí)施例僅僅是闡述性的，本發(fā)明的范圍由本申請(qǐng)的權(quán)利要求加以 限定。如無(wú)特別說(shuō)明，本發(fā)明所用的百分比為重量體積百分比。此外，應(yīng)理解，上述各試劑 的優(yōu)選范圍可任意組合，只要其能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的即可。實(shí)施例實(shí)施例1 大麥小孢子的耐鹽篩選從大田選取中部小花小孢子發(fā)育處于單核早期、中期的穗子，放入冰箱冷藏15 天。接種時(shí)，穗子用飽和的漂白粉溶液消毒15min，無(wú)菌水沖洗3 4次。每個(gè)試管接10 個(gè)穗子，倒入 15ml NaCl 300mg/L、甘露醇 60g/L、CaCl2L lg/L、MES 0. 976g/L 的提取液，用 3000rpm的高速分散器超速旋切，150目篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液以SOOrpm低速離心，重復(fù)3次，收集 小孢子。小孢子用NaCl 300mg/L、甘露醇60g/L、CaCl2L lg/L、MES 0. 976g/L的提取液于 25°C、黑暗預(yù)處理2d。實(shí)施例2 耐鹽胚狀體的獲取誘導(dǎo)培養(yǎng)基以N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其中加有NaCl 300mg/L、2，4，5-T1. Omg/L、 KT 0.5mg/L，麥芽糖90g/L，pH 5.8。培養(yǎng)前將小孢子用培養(yǎng)基洗滌1次，然后用培養(yǎng)基將小孢子密度調(diào)節(jié)至1. 0 1. 2X 105/ml，取1. 5ml小孢子懸浮液接種于培養(yǎng)皿(30 X 15mm)， Parafilm 封口，25°C暗培養(yǎng) 2Id。實(shí)施例3 耐鹽再生植株的獲取誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后將胚狀體轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上。分化培養(yǎng)基以2/3MS為基本培養(yǎng) 基，其中加有 NaCl 300mg/L、6-BA 0. 5mg/L、KT 1. 5mg/L、NAA 0. 05mg/L 和麥芽糖 30g/L，PH 為5. 8。在25士 1°C，每天10 12小時(shí)光照的條件下分化脅迫培養(yǎng)25 30天，直至分化 出綠色再生植株。實(shí)施例4 耐鹽再生植株的生根培養(yǎng)選取分化出的再生植株，轉(zhuǎn)入添加NAA 0.05mg/L、多效唑(MET)5.0mg/L和蔗糖 20g/L，pH5. 8的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基。在25士 1°C，每天10 12小時(shí)光照的條件下進(jìn)行 25 30天的生根壯苗培養(yǎng)。實(shí)施例5 耐鹽植株的移栽及種子收獲經(jīng)過(guò)生根壯苗培養(yǎng)的耐鹽植株成為根莖葉齊全的完整植株，移栽前1天先將培養(yǎng) 瓶打開(kāi)，在實(shí)驗(yàn)室中煉苗。煉苗結(jié)束后，用鑷子小心地把植株從培養(yǎng)瓶中移出，盡量保持根 系的完整，洗去附著的培養(yǎng)基，將苗移入育苗缽中，澆水后用塑料薄膜罩住，保濕3d。去掉塑 料薄膜后在20士 1°C，每天10 12小時(shí)光照的條件下生長(zhǎng)至成熟。成熟后的種子按株收
-M-犾。實(shí)施例6 耐鹽株系的再次篩選選用直徑9cm的培養(yǎng)皿，清洗干凈后滅菌并烘干，放入兩張濾紙。每個(gè)株系選取30 粒健康種子，用3%雙氧水(H2O2)消毒8min，蒸餾水沖洗3次，然后將種子浸泡于蒸餾水， 30°C、8h，結(jié)束后保濕過(guò)夜，等種子露白后均勻排放于培養(yǎng)皿中間，加入NaCl 10g/L溶液， 用蒸餾水作對(duì)照，并將所有培養(yǎng)皿置于27°C恒溫每天10 12小時(shí)光照的光照培養(yǎng)箱中發(fā) 芽。5d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、主根長(zhǎng)度、胚芽鞘長(zhǎng)度。選擇發(fā)芽率高、主根長(zhǎng)度、胚芽鞘長(zhǎng)度與對(duì)照 相比差異小的株系種植于大田。實(shí)施例7按實(shí)施例1收集大麥品種“花30”的小孢子并處理，按實(shí)施例2進(jìn)行小孢子培養(yǎng)誘 導(dǎo)胚狀體，按實(shí)施例3獲取耐鹽的再生植株，按實(shí)施例4進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)，按實(shí)施例5移 栽并收獲種子，收獲后的種子按實(shí)施例6進(jìn)行進(jìn)一步的耐鹽株系篩選，在含NaCl 10g/L萌 發(fā)液中，耐鹽株系自交一代的萌發(fā)率在50% 70%、主根長(zhǎng)度2. 10 3. 60cm、胚芽鞘長(zhǎng)度 1. 79 2. 96cm，選擇5個(gè)耐鹽性強(qiáng)的株系種植于大田，結(jié)實(shí)后收獲種子。將收獲的自交二代種子30粒如實(shí)施例6進(jìn)行耐鹽萌發(fā)試驗(yàn)，并以原始材料的種子 作為對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行耐鹽萌發(fā)。實(shí)驗(yàn)證明，在含NaCl 10g/L萌發(fā)液中，在27士 1°C，每天10 12小時(shí)光照的條 件下培養(yǎng)，5天后，5份耐鹽株系自交二代種子萌發(fā)率在60% 70%、主根長(zhǎng)度2. 59 3. 59cm、胚芽鞘長(zhǎng)度在1. 95 3. 02cm,而起始材料花30的萌發(fā)率只有33. 3%、主根長(zhǎng)度 1.70cm、胚芽鞘長(zhǎng)度1.47cm。由此可見(jiàn)，耐鹽株系的耐鹽性狀穩(wěn)定。具體結(jié)果見(jiàn)下表3。表權(quán)利要求
1.一種改良禾谷類作物耐鹽性狀的方法，該方法包括1)取該作物孕穗期的花藥游離小孢子，置于添加有NaCl50 500mg/L的預(yù)處理液中， 獲取存活、耐鹽的小孢子；2)收集步驟1)獲得的小孢子置于添加NaCl50 500mg/L、2，4，5-T 0.5-2. Omg/L、 KT 0. 3 1. Omg/L，麥芽糖60 120g/L，pH 5. 6 6. 0的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取胚狀 體；3)將步驟2)所得胚狀體置于添加NaCl50 500mg/L、6-BA 0. 5 1. 5mg/L、KT 0. 5 2. Omg/L、NAA 0. 01 0. lmg/L 和麥芽糖 10 50g/L，pH 為 5. 6 6. 0 的 2/3MS 分化培養(yǎng) 基上培養(yǎng)，獲取再生植株；4)將步驟3)獲得的再生植株置于添加添加NAA0. 02 0. 08mg/L、多效唑2. 0 10. Omg/L和蔗糖10 40g/L, ρΗ5· 6 6. 0的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取根、莖、 葉完整的再生植株；從而獲得耐鹽的禾谷類作物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括5)將步驟4)所得的再生植株移入土壤，待成熟后收獲種子；和6)將種子置于添加NaCl50 500mg/L的培養(yǎng)基上發(fā)芽，選擇NaCl耐性強(qiáng)的材料。
3.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述禾谷類作物是大麥、小麥和 水稻。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有200 400mg/L的 NaCl,0. 8 ~ 1. 5mg/L 的 2，4，5-T，0. 4 0. 8mg/L 的 ΚΤ，禾口 80 100g/L 的麥芽糖，pH 為 5. 6 5. 9。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述2/3MS分化培養(yǎng)基含有200 400mg/L 的 NaCl, 0. 4 1. 0mg/L 的 6-BA，1. 0 1. 8mg/L 的 KT, 0. 02 0. 08mg/L 的 NAA, 20 40g/ L的麥芽糖，pH為5. 7 5. 8。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基含有0.03 0. 06mg/L 的 NAA, 3. 0 8. 0mg/L 的 MET, 20 30g/L 的蔗糖，pH 為 5. 8 5. 9。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法包括1)取所述作物孕穗期花藥游離小孢子，置于添加NaCl50 500mg/L的預(yù)處理液中，獲 取存活、耐鹽的小孢子；2)收集處理后的小孢子置于添加NaCl50 500mg/L、2，4，5-T 0. 5 2. 0mg/L、KT 0. 5 1. 0mg/L,麥芽糖90g/L，pH 5. 8的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取胚狀體；3)胚狀體置于添加NaCl 50 500mg/L、6_BA 0. 5 1. 5mg/L、KT 0. 5 2. 0mg/L,NAA 0. 01 0. lmg/L和麥芽糖30g/L，PH為5. 8的2/3MS分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取再生植株；4)再生植株置于添加NAA0. 05mg/L、多效唑(MET) 5. 0mg/L和蔗糖20g/L, ρΗ5· 8的 1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取根、莖、葉完整的再生植株；5)再生植株移入土壤，待成熟后收獲種子；和6)將種子置于添加NaCl50 500mg/L的培養(yǎng)基上發(fā)芽，選擇NaCl耐性強(qiáng)的材料。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述預(yù)處理液含有NaCl50 500mg/L、甘 露醇 40 80g/L、CaCl2 0. 8 1. 5g/L 和 MES 0. 6 1. 5g/L。
9.一種用于實(shí)施權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法的套盒，其特征在于，所述套盒含 有權(quán)利要求1所述的預(yù)處理液、N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基、2/3MS分化培養(yǎng)基和/或1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基。
10.如權(quán)利要求9所述的套盒，其特征在于所述預(yù)處理液含有NaCl 50 500mg/L、甘露醇40 80g/L、CaCl2 0. 8 1. 5g/L、和 MES 0. 6 1. 5g/L ；所述N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有200 400mg/L的NaCl，0. 8 1. 5mg/L的2，4，5-T，0. 4 .0.8mg/L 的 KT,和 80 100g/L 的麥芽糖，pH 為 5. 6 5. 9 ；所述2/3MS分化培養(yǎng)基含有200 400mg/L的NaCl,0. 4 1. Omg/L的6-BA，1. 0 .1.8mg/L 的 KT，0. 02 0. 08mg/L 的 NAA，20 40g/L 的麥芽糖，pH 為 5. 7 5. 8 ；所述1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基含有0. 03 0. 06mg/L的NAA，3. 0 8. Omg/L的MET，20 30g/L的蔗糖，pH為5. 8 5. 9。
全文摘要
本發(fā)明提供一種禾谷類作物耐鹽性狀改良的方法，該方法包括在游離后小孢子、胚狀體誘導(dǎo)、再生植株的分化培養(yǎng)過(guò)程中分別給予NaCl脅迫篩選，用NaCl對(duì)所述作物的小孢子進(jìn)行離體處理，在誘導(dǎo)培養(yǎng)期、植株分化期分別給予NaCl脅迫篩選，層層淘汰，獲得生根的再生植株后，移栽至溫室，成熟后按株收獲。收獲后的種子置于添加NaCl的脅迫培養(yǎng)基上發(fā)芽，從中篩選出耐鹽性強(qiáng)的加倍單倍體株系。本發(fā)明實(shí)施方法簡(jiǎn)便，易于掌握，整個(gè)篩選過(guò)程都在實(shí)驗(yàn)室完全一致的可控條件下進(jìn)行，使結(jié)果真實(shí)可靠。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102106259SQ200910200610
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者何婷, 王亦菲, 陸瑞菊, 陳志偉, 黃劍華 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 上?？屏⑻剞r(nóng)科(集團(tuán))有限公司, 上海綠劍農(nóng)業(yè)科技有限公司