專利名稱：：枯草芽孢桿菌三環(huán)唑復(fù)配可濕性殺菌粉劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種復(fù)配可濕性殺菌粉劑及其應(yīng)用，尤其是一種將枯草芽孢桿菌和三環(huán)唑復(fù)配的可濕性殺菌粉劑及其在防治水稻真菌病害中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著國民經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，對農(nóng)產(chǎn)品的數(shù)量、質(zhì)量及其安全性提出了越來越高的要求。保障無公害、優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的供給和實(shí)現(xiàn)資源的可持續(xù)利用是21世紀(jì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的最大挑戰(zhàn)。但是，近十年來，由于大面積種植晚熟型的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)水稻品種，以及氣候變暖和輕型栽培技術(shù)的推廣使用，水稻病蟲害的發(fā)生為害總體呈大幅度上升態(tài)勢。2006年全國水稻稻瘟病發(fā)生約8000萬畝，在西南稻區(qū)和北方局部稻區(qū)偏重發(fā)生；全國水稻紋枯病發(fā)生2.3億畝，在華南、江南、長江流域及江淮稻區(qū)偏重發(fā)生。上述兩種病害嚴(yán)重威脅水稻安全生產(chǎn)。目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上防治水稻稻瘟病、水稻紋枯病主要依賴化學(xué)藥劑，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年用于防治水稻稻瘟病、紋枯病的藥劑多達(dá)上萬噸，這不僅造成了嚴(yán)重的水田生態(tài)環(huán)境和水質(zhì)污染，而且直接增加了稻米中有毒化學(xué)物質(zhì)的殘留，對人類健康造成嚴(yán)重威脅。因此，"優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)"與"安全性"已成為水稻生產(chǎn)中十分突出的矛盾。解決這一問題的根本途徑是突破目前以化學(xué)農(nóng)藥為主的防治對策的局限性，開拓以高效、無公害微生物復(fù)配農(nóng)藥為主的綜合防治水稻病害的技術(shù)體系，為無公害優(yōu)質(zhì)稻米的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供可持續(xù)發(fā)展的核心保障技術(shù)?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)是一類好氧、產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌；是分布在土壤、植物表面和根際的重要微生物種類，能產(chǎn)生一系列代謝產(chǎn)物抑制其它微生物的生長，具有防治植物病害的作用。目前在全世界保存的野生型枯草芽孢桿菌菌株有幾百種，研究證實(shí)枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生40多種具有不同結(jié)構(gòu)和功能的抗菌物質(zhì)。江蘇省農(nóng)科院篩選獲得的、對水稻真菌病害有很好防效的枯草芽孢桿菌sf-628于2006年8月1日被中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)受理保藏，保藏編號為:CGMCCNo.1772，拉丁學(xué)名為Bacillussubtilissf-628(本文簡稱sf-628)。其生物學(xué)性狀記載為sf-628在YPGA(酵母膏5.0g，胰蛋白胨5.0g;葡萄糖5.0g，瓊脂17.0g;水1000ml)培養(yǎng)基平板上生長24h的菌落3-5mm，菌落圓形，四周光滑，米色，表面有皺褶。革蘭氏反應(yīng)陽性，細(xì)胞形狀桿狀，細(xì)胞直徑大于lPm，嚴(yán)格好氣，L-阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、淀粉水解、明膠液化等利用反應(yīng)均為陽性?？莶菅挎邨U菌sf-628是一株對化學(xué)藥劑三環(huán)唑有天然抗性的菌株，用三環(huán)唑進(jìn)一步抗性誘導(dǎo)處理，能夠在三環(huán)唑含量10000卯m的YGPA培養(yǎng)基上正常生長?？莶菅挎邨U菌sf-628還具有許多優(yōu)良性能，如有較廣的抑菌譜，對多種植物病原菌有很強(qiáng)的抑制作用；生長速度快，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，能在土壤和植物表面定殖，并形成優(yōu)勢種群；誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性；分泌產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)；對水稻紋枯病、稻曲病有相當(dāng)好的防治效果，對水稻稻瘟病也有一定的防治效果。目前，江蘇省蘇科農(nóng)化有限責(zé)任公司利用枯草芽孢桿菌sf-628生產(chǎn)了具有不同含菌量的枯草芽孢桿菌可濕性粉劑。三環(huán)唑，英文通用名tricyclazole;化學(xué)名稱為5_甲基-l，2，4-三唑并[3，4_b]苯并噻唑。其他名稱比艷、克瘟唑。原粉(含有效成分95%)外觀為白色結(jié)晶固體，熔點(diǎn)187-188t:，水中溶解度為0.7克/升，在氯仿中大于500克/升。三環(huán)唑在水中穩(wěn)定，對光和熱(高至187°C)亦穩(wěn)定。屬于中等毒性殺菌劑，三環(huán)唑原粉大鼠急性經(jīng)口LD5。為305毫克/公斤，急性經(jīng)皮LD5。>2000毫升/公斤。對兔眼和皮膚有輕度剌激作用，在試驗(yàn)劑量下無慢性毒性。三環(huán)唑內(nèi)吸性較強(qiáng)，能迅速被水稻根、莖、葉吸收，并輸送到稻株各部?？箾_刷力強(qiáng)，噴藥一小時后遇雨，也不需補(bǔ)噴藥。作用機(jī)理主要是通過抑制稻瘟病菌附著孢內(nèi)黑色素的形成，使得病菌無法形成附著孢和萌發(fā)孢子，從而有效地阻止病菌侵入和稻瘟病病減少菌孢子的產(chǎn)生，因而有很好的保護(hù)性。適用于水稻稻瘟病的防治。目前，將枯草芽孢桿菌sf-628和三環(huán)唑復(fù)配的可濕性殺菌粉劑并未見諸報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對目前生產(chǎn)上大量使用化學(xué)農(nóng)藥防治水稻病害、嚴(yán)重污染農(nóng)田生態(tài)環(huán)境、導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)、影響優(yōu)質(zhì)稻米品質(zhì)的問題，提出一種對水稻真菌病害具有良好防治效果的枯草芽孢桿菌三環(huán)唑微生物復(fù)配的可濕性殺菌粉劑及其在防治水稻真菌病害中的應(yīng)用?？莶菅挎邨U菌sf-628和三環(huán)唑復(fù)配后，形成優(yōu)勢互補(bǔ)的作用，既能發(fā)揮化學(xué)藥劑高效、快速的抑菌作用，又能發(fā)揮sf-628在田間定殖、誘導(dǎo)水稻植物抗病性、大量繁殖后微生物群落合理分布的調(diào)整功能等作用。通過使用該微生物復(fù)配劑，在稻田生態(tài)環(huán)境引進(jìn)大量有益微生物，惡化病原菌的生存環(huán)境，結(jié)合栽培管理等農(nóng)業(yè)措施，形成一個穩(wěn)定的、平衡的、生物多樣化的水稻生態(tài)系統(tǒng)，達(dá)到一藥多治、減少化學(xué)藥劑使用量、持久地控制水稻病害流行的目的。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種枯草芽孢桿菌三環(huán)唑復(fù)配可濕性殺菌粉劑，成品藥劑中包括有效活性成分、助劑以及填充輔料，其特征在于有效活性成分占成品藥劑的重量百分比為1085%，所述的有效活性成分由枯草芽孢桿菌和三環(huán)唑組成，在有效活性成分中，枯草芽孢桿菌的重量百分比為10-90%。在本發(fā)明中助劑為農(nóng)藥中可濕性粉劑的常規(guī)助劑，填充輔料為農(nóng)藥中可濕性粉劑的常規(guī)填充輔料；在成品藥劑中助劑和填充輔料所占的重量百分比分別為120%和1075%。上述復(fù)配可濕性殺菌粉劑的應(yīng)用，其特征在于將成品藥劑稀釋后在水稻生長期噴灑在水稻上用于防治水稻真菌病害。在上述的復(fù)配殺菌粉劑的應(yīng)用中，所述的水稻真菌病害是指水稻稻瘟病、或水稻紋枯病。在上述的復(fù)配殺菌粉劑的應(yīng)用中，將成品藥劑稀釋5001500倍，稀釋后的有效藥物成分含量至少為1.2g/L。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于將生防微生物枯草芽孢桿菌sf-628和化學(xué)藥劑三環(huán)唑按一定比例混合使用，不僅能發(fā)揮化學(xué)藥劑三環(huán)唑抑菌速度快、對水稻稻瘟病防治效果穩(wěn)定的優(yōu)勢，同時還能保持生防微生物枯草芽孢桿菌sf-628對水稻紋枯病有較好的防治效果、能在植物根葉圍定殖、分泌抗生素、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等特點(diǎn)，通過復(fù)配、協(xié)作用，達(dá)到互補(bǔ)優(yōu)勢、擴(kuò)大防治范圍，減少化學(xué)藥劑用藥量、提高防治效果的目的。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l10%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的配制有效藥物三環(huán)唑原藥(98%)由江蘇豐登農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)提供；200億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑由江蘇省蘇科農(nóng)化有限責(zé)任公司生產(chǎn)提供。助劑NNO(亞甲基二萘磺酸鈉)。填充輔料輕質(zhì)碳酸牽丐將各組分按照重量百分比備料三環(huán)唑原藥10.2%;200億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑50%;助劑NNO:8%;輕質(zhì)碳酸鈣31.8%。制備過程將三環(huán)唑、枯草芽孢桿菌按上述比例置于混合器中，加入一定比例的助劑NNO，用輕質(zhì)碳酸鈣填充至100%，所有物料在混合器中混合均勻后，經(jīng)氣流粉碎機(jī)粉碎2次，即成10%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑。實(shí)施例210%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑抑制水稻稻瘟病菌的增效作用測定供試菌株水稻稻瘟病菌，由江蘇省農(nóng)科院植保所提供。被測藥劑由實(shí)施例1提供的10%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑。對比藥劑20%三環(huán)唑可濕性粉劑(江蘇豐登農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)提供)；200億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(江蘇省蘇科農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)提供)。室內(nèi)增效生物測定供試水稻稻瘟病菌株移植RCA(玉米粉40克、稻桿50克、瓊脂20克)培養(yǎng)基上，在25t:下培養(yǎng)7d，用黑光燈照射72h后稻瘟病菌產(chǎn)生孢子，備用。將3種待測藥劑各稀釋成7個不同濃度的藥液，供試水稻34葉期，剪下6-8cm長水稻葉片浸泡在不同濃度的藥液中2小時，恒溫27t:保濕24小時；噴霧接種稻瘟病菌孢子懸浮液(100X，每視野約200個孢子)，噴霧量以葉片濕潤為度，30次重復(fù)。繼續(xù)保濕，6天后調(diào)查病情，計(jì)算抑制率。將抑制率觀察值轉(zhuǎn)化為抑制率的等值偏差，以各處理的培養(yǎng)基中殺菌劑的濃度對數(shù)為X，以相應(yīng)處理對病原菌菌絲生長抑制率的等值偏差為Y，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)回歸方法，擬合出濃度對數(shù)一抑制百分率機(jī)率值毒力曲線，計(jì)算EC5。值和SR。參考Wadley公式(增效指數(shù)SR=混合物的理論EC5。/混合物的實(shí)測EC5。，SR>1.5為增效作用，O.5《SR《1.5為相加作用，SR〈0.5為拮抗作用)。分級標(biāo)準(zhǔn)為O級無病斑；1級病斑面積占整個葉面積的5%以下；3級病斑面積占整個葉面積的6%10%以下；5級病斑面積占整個葉面積的11%25%以下；7級病斑面積占整個葉面積的26%50%以下；9級病斑面積占整個葉面積的50%以上。E(各級病葉數(shù)x代表級值)病情指數(shù)=-X100調(diào)査總?cè)~數(shù)x最高代表級值處理區(qū)平均病情指數(shù)防治效果=(1--)X100對照區(qū)平均病情指數(shù)室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果(表l)表明，被測的10%三環(huán)唑*100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑增效系數(shù)為6.53，該復(fù)配組合表現(xiàn)出對抑制水稻稻瘟病菌孢子萌發(fā)、侵入和為害有顯著的增效作用。表110%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑抑制水稻稻瘟病菌的增效作用測定藥劑回歸方程EC50(ug/kg)增效系數(shù)20%三環(huán)唑可濕性粉劑Y=0.4571x+5.15020.7199/200億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑Y=0.8323x+5.99110.3039/10%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑Y=0.4991x+6.36100.06546.53實(shí)施例310%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑抑制水稻紋枯病菌菌絲生長的增效作用測定供試菌株水稻紋枯病菌，由江蘇省農(nóng)科院植保所提供。被測藥劑由實(shí)施例1提供的10%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑。對比藥劑20%三環(huán)唑可濕性粉劑(江蘇豐登農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)提供)；200億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(江蘇省蘇科農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)提供)。室內(nèi)增效生物測定供試水稻紋枯病菌株移植PSA(馬鈴薯200克、蔗糖20克、瓊脂20克)培養(yǎng)基上，在25t:下培養(yǎng)2d，備用。將20%三環(huán)唑配成0.01iig/ml、0.1iig/ml、liig/ml、10iig/ml帶藥的PSA培養(yǎng)基平板；將200億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑配成2X106cfu枯草芽孢桿菌/ml、2X105cfu枯草芽孢桿菌/ml、2X104cfu枯草芽孢桿菌/ml、2X103cfu枯草芽孢桿菌/ml帶菌的PSA培養(yǎng)基平板；將10%三環(huán)唑*100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對水稻紋枯病菌進(jìn)行毒力測定，分別稀釋2500倍、5000倍、10000倍、20000倍、40000倍，制備成帶不同梯度藥液的PSA培養(yǎng)基平板。再將水稻紋枯病菌(直徑7mm)接入帶毒平板，三環(huán)唑單劑和枯草芽孢桿菌單劑做對照，同時設(shè)立清水對照平板，待清水對照平板長滿時，測量菌落直徑。計(jì)算抑制率抑制率(％)=[(對照菌落直徑_藥劑處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)]X100%增效指數(shù)SR計(jì)算與實(shí)施例2相同。試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，被測的10%三環(huán)唑*100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑增效系數(shù)為1.ll，該復(fù)配組合表現(xiàn)出對防治水稻紋枯病有相加作用。表210%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑抑制水稻紋枯病菌的增效作用測定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例4、試驗(yàn)時間于2007年8月29日(水稻破口期)在金壇市薛埠鎮(zhèn)茅東村一承包戶的水稻田內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)水稻品種武育粳3號試驗(yàn)藥劑由實(shí)施例1提供的10%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑。對比藥劑20%三環(huán)唑可濕性粉劑(江蘇豐登農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)提供)；200億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(江蘇省蘇科農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)提供)。田間藥效試驗(yàn)采用噴霧法防治水稻稻瘟病。在水稻破口期施藥，按每畝用量兌水50Kg均勻噴霧，每小區(qū)133.4m2;每個處理設(shè)4次重復(fù)，處理間以小埂分隔，并設(shè)保護(hù)行。藥后42天調(diào)查各個小區(qū)的稻瘟病發(fā)病指數(shù)，計(jì)算防治效果。病情分級標(biāo)準(zhǔn)如下0級無病1級1/4以下枝梗發(fā)?。?級1/4以上枝梗發(fā)病或主軸中部發(fā)病，或頸部有病，但是對產(chǎn)量影響不大；3級主軸中部或頸部發(fā)病，對產(chǎn)量有顯著影響；4級穗頸部發(fā)病，造成白穗。E(病級株數(shù)X代表級值)病情指數(shù)=-X100調(diào)査總株數(shù)X最高代表值處理區(qū)平均病情指數(shù)防治效果二(1--)X100對照區(qū)平均病情指數(shù)田間試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明10%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑畝用量100克施藥后42天，對水稻稻瘟病的防治效果為84.67%，微生物復(fù)配殺菌劑的防治效果優(yōu)于20%三環(huán)唑可濕性粉劑(畝用量75克)和200億枯草芽孢桿菌(畝用量100克)的防治效果。表310%三環(huán)唑IOO億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑防治水稻稻瘟病的田間小區(qū)效果小區(qū)處理用量(克/畝)有效含量病情指數(shù)防治效果％20%三環(huán)唑可濕性粉劑75克(稀釋666倍)15克1.1075.56200億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑100克(稀釋500倍)1002.8037.7810%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑100克(稀釋500倍)10克三環(huán)唑+50克200億枯草芽孢桿菌0.6984.67空白對照/4.50/實(shí)施例5、試驗(yàn)時間于2007年8月15日(水稻孕穗期)在興化市荻垛鎮(zhèn)野陳村一承包戶的水稻田內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)水稻品種武育粳3號。試驗(yàn)藥劑由實(shí)施例1提供的10%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑。對比藥劑20%三環(huán)唑可濕性粉劑(江蘇豐登農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)提供)；200億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(江蘇省蘇科農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)提供)。田間藥效試驗(yàn)采用噴霧法防治水稻紋枯病。在水稻孕穗期施藥，按每畝用量兌水50Kg均勻噴霧，每小區(qū)133.4m2;每個處理設(shè)4次重復(fù)，處理間以小埂分隔，并設(shè)保護(hù)行。藥后15天調(diào)查各個小區(qū)的紋枯病發(fā)病指數(shù)，計(jì)算防治效果。病情分級標(biāo)準(zhǔn)如下0級無病斑；1級基部有少量病斑；2級基部有較多病斑，并上升到第2葉(倒4葉)；3級倒3葉有病斑;4級倒2葉有病斑;5級劍葉有病斑或全株枯死。田間試驗(yàn)結(jié)果(表5)表明10%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑畝用量100克施藥后15天，對水稻紋枯病的防治效果為70.68%，微生物復(fù)配殺菌劑的防治效果優(yōu)于20%三環(huán)唑可濕性粉劑(畝用量75克)的防治效果。表510%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑防治水稻紋枯病的田間小區(qū)效果小區(qū)處理用量(克/畝)有效含量病情指數(shù)防治效果％20%三環(huán)唑可濕性粉劑75克(稀釋666倍)15克35.9010.00200億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑100克(稀釋500倍)100克8.9077.6910%三環(huán)唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑100克(稀釋500倍)10克三環(huán)唑+50克200億枯草芽孢桿菌11.7070.68空白對照/39.90/權(quán)利要求一種枯草芽孢桿菌三環(huán)唑復(fù)配可濕性殺菌粉劑，成品藥劑中包括有效活性成分、助劑以及填充輔料，其特征在于有效活性成分占成品藥劑的重量百分比為10～85％，所述的有效活性成分由枯草芽孢桿菌和三環(huán)唑組成，在有效活性成分中，枯草芽孢桿菌的重量百分比為10-90％。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌三環(huán)唑復(fù)配可濕性殺菌粉劑，其特征在于助劑為農(nóng)藥中可濕性粉劑的常規(guī)助劑，填充輔料為農(nóng)藥中可濕性粉劑的常規(guī)填充輔料；在成品藥劑中助劑和填充輔料所占的重量百分比分別為120%和1075%。3.—種如權(quán)利要求1所述復(fù)配可濕性殺菌粉劑的應(yīng)用，其特征在于將成品藥劑稀釋后在水稻生長期噴灑在水稻上用于防治水稻真菌病害。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的復(fù)配殺菌劑的應(yīng)用，其特征在于所述的水稻真菌病害是指真菌引起的水稻稻瘟病、或水稻紋枯病。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的復(fù)配殺菌劑的應(yīng)用，其特征在于將成品藥劑稀釋5001500倍，稀釋后的有效藥物成分含量至少為1.2g/L。全文摘要本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌三環(huán)唑復(fù)配可濕性殺菌粉劑，成品藥劑中包括有效活性成分、助劑以及填充輔料，其特征在于有效活性成分占成品藥劑的重量百分比為10～85％，所述的有效活性成分由枯草芽孢桿菌和三環(huán)唑組成，在有效活性成分中，枯草芽孢桿菌的重量百分比為10-90％。應(yīng)用時，將成品藥劑稀釋后噴灑在水稻上用于防治水稻水稻稻瘟病、或水稻紋枯病。其優(yōu)點(diǎn)是將枯草芽孢桿菌與化學(xué)藥劑三環(huán)唑按一定比例混合使用，能充分發(fā)揮微生物和化學(xué)藥劑的協(xié)同作用，達(dá)到優(yōu)勢互補(bǔ)、擴(kuò)大防治范圍，減少化學(xué)藥劑用藥量、降低用藥成本，在提高防治效果的同時，改善了生態(tài)環(huán)境、減少了化學(xué)藥劑在水稻中的殘留量。文檔編號A01N43/90GK101697737SQ200910212779公開日2010年4月28日申請日期2009年11月9日優(yōu)先權(quán)日2009年11月9日發(fā)明者劉永鋒,劉郵洲,陳志誼申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院