專利名稱：一種誘導(dǎo)捕食線蟲真菌同步產(chǎn)生捕食器官的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)捕食線蟲真菌同步產(chǎn)生捕食器官的方法，屬于應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物寄生線蟲是植物的重要病害之一，全世界每年由于植物寄生線蟲所引起的農(nóng) 作物經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到780億美元(Barker, 1998)。在我國(guó)，線蟲危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、 大豆、花生、小麥、水稻、林木、中藥材等幾乎所有的經(jīng)濟(jì)作物，成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的限制 因子之一。目前對(duì)線蟲病害的防治仍然以化學(xué)防治為主，但由于化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的影 響以及寄生線蟲抗藥性的增加，使其應(yīng)用逐步受到限制，因此采用線蟲天敵進(jìn)行生物防治 已日益受到研究人員的關(guān)注(Siddiqui and Mahmood， 1996 ;劉杏忠等，2004)。對(duì)線蟲真 菌天敵的研究已經(jīng)有160多年的歷史，其中捕食線蟲真菌(Nematode-tr即ping fungi)是 自然界中控制線蟲種群數(shù)量的一類重要的真菌生物因子。捕食線蟲真菌根據(jù)形態(tài)學(xué)特征 劃分為節(jié)叢 包屬(Arthrobotrys)、單頂抱屬(Monacrosporium)禾口隔指抱屬(Dactylella) (Subramanian， 1963)，它們利用營(yíng)養(yǎng)菌絲特化形成的捕食器官，如收縮環(huán)、非收縮環(huán)、粘性 菌絲、粘性分枝、粘性網(wǎng)等完成對(duì)植物寄生線蟲的捕捉和侵染過程(張克勤等，2006)。捕食 線蟲真菌的捕食器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，不但在捕食線蟲的功能方面有重要意義，而且 也是鑒定和分類的重要依據(jù)之一。目前，捕食線蟲真菌作為一種有效的生物防治資源已經(jīng) 廣泛應(yīng)用于植物寄生線蟲的生物防治(劉杏忠等，2004)。然而，人們對(duì)捕食線蟲真菌的侵 染機(jī)制和分子背景的了解還非常有限，限制了高效線蟲生防制劑的研發(fā)和應(yīng)用。
捕食線蟲真菌的捕食器官是其侵染植物寄生線蟲的必要條件之一，捕食器官在營(yíng) 養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基上可以自發(fā)產(chǎn)生，也可以通過環(huán)境因子(氨基酸和多肽等)的誘導(dǎo)產(chǎn)生 (Friman et al. ， 1985)。目前所正式報(bào)道的捕食線蟲真菌捕食器官的誘導(dǎo)方法主要包括 饑餓法，在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基上如玉米粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生；誘導(dǎo)法，在固體或液體培養(yǎng)基 中加入特定的氨基酸或多肽等誘導(dǎo)物質(zhì)誘導(dǎo)捕食器官產(chǎn)生；小室法(挖塊法)在固體培養(yǎng) 基(平板內(nèi))中挖出一塊(0.5xlcm)，并在其中加入新鮮線蟲，誘導(dǎo)捕食器官產(chǎn)生。以上幾 種捕食器官的誘導(dǎo)方法存在產(chǎn)生的捕食器官數(shù)量有限、捕食器官產(chǎn)生不同步和可控制性不 強(qiáng)等缺點(diǎn)。 經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容相同文獻(xiàn)的公開報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種快速誘導(dǎo)捕食線蟲真菌同步產(chǎn)生捕 食器官的方法，迅速獲得大量同步的捕食器官，為進(jìn)一步研究捕食線蟲真菌捕食器官形成 的分子機(jī)制提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。 本發(fā)明涉及的秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)實(shí)驗(yàn)用線 蟲，能從國(guó)內(nèi)外的線蟲保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)買得到。
本發(fā)明在常規(guī)方法基礎(chǔ)上改進(jìn)而成。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的步驟如下
1.培養(yǎng)基和線蟲的培養(yǎng) 1)燕麥培養(yǎng)基用于培養(yǎng)線蟲。在250mL三角瓶中加入10g燕麥片(超市購(gòu)買) 加入30mL去離子水將燕麥片浸潤(rùn)，12rC滅菌20分鐘。 2)秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)在滅菌的燕麥培養(yǎng)基中加入lmL的線蟲懸液，21-26t:培 養(yǎng)6-7天。培養(yǎng)好的線蟲在4t:保存i周。 2.線蟲提取物的制備 1)用3層擦鏡紙將含有秀麗隱桿線蟲的燕麥培養(yǎng)基包好，用貝氏漏斗法過夜收集 燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)的線蟲； 2)將收集到的線蟲用M9緩沖液(磷酸氫二鈉6g ;磷酸二氫鉀3g ;氯化鈉5g ;硫 酸鎂O. 25g，水1000mL)清洗，去除殘留的培養(yǎng)基；
3)離心收集線蟲，4t:，8，000g，離心20分鐘; 4)用無(wú)菌去離子水懸浮線蟲，離心收集線蟲，4t:，8，000g，離心20分鐘；重復(fù)3
次；最后用無(wú)菌去離子水懸浮線蟲，10g (濕重)線蟲加入30mL無(wú)菌去離子水； 5)將線蟲懸浮液置于冰水混合物上超聲50%強(qiáng)度，6s 0N， 3s OFF， 10分鐘；放置
30分鐘后，再次超聲，6s 0N，3s 0FF，5分鐘； 6) 12， 000g，30分鐘，離心收集上清; 7)用0.22ym的濾膜過濾上清液，過濾后的上清液即為線蟲提取物，分裝后存 于-80。C待用。 3.捕食線蟲真菌的培養(yǎng)(以捕食線蟲真菌的模式菌株寡孢節(jié)叢孢A. oligospora 為例) 1)培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基和CMA培養(yǎng)基的組成和配制方法如下CMA培養(yǎng)基稱取20g玉米粉，加入1000mL去離子水，煮沸(IO(TC ) 20分鐘，用6
層紗布過濾收集液體，加入20g瓊脂，12rC滅菌20分鐘。 PDA培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g，切塊、煮沸30分鐘，6層紗布過濾收集上清液，加入 葡萄糖20g，加水補(bǔ)充體積到1000mL， 12rC滅菌20分鐘。 2)寡孢節(jié)叢孢的活化和孢子培養(yǎng)在CMA固體培養(yǎng)基上接種寡孢節(jié)叢孢，26°。恒 溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10天，以得到大量的孢子。用無(wú)菌水沖洗CMA平板上的寡孢節(jié)叢孢菌絲； 用移液器將平板上的液體轉(zhuǎn)移至裝有無(wú)菌擦鏡紙的漏斗內(nèi)過濾，收集孢子；用血球計(jì)數(shù)板 計(jì)數(shù)并計(jì)算孢子的濃度。 3)寡孢節(jié)叢孢的液體發(fā)酵及新鮮菌絲的收集 制備PDA液體培養(yǎng)基，分裝于500mL的三角瓶?jī)?nèi)，200mL培養(yǎng)基/瓶。在液體培養(yǎng) 基內(nèi)接種孢子，100個(gè)孢子/mL液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)26t:，160rpm，5-6天。用無(wú)菌的6層 紗布過濾收集菌絲，并用無(wú)菌去離子水沖洗菌絲3-4遍，去除培養(yǎng)基成份，用40mL無(wú)菌去離 子水懸浮菌絲，用于三維菌網(wǎng)的液體誘導(dǎo)。 4.捕食線蟲真菌捕食器官的誘導(dǎo)(以捕食線蟲真菌的模式菌株寡孢節(jié)叢孢 A. oligospora為例) 將收集得到的寡孢節(jié)叢孢新鮮菌絲用無(wú)菌去離子水懸浮后，實(shí)驗(yàn)組(三維菌網(wǎng)誘 導(dǎo)組)內(nèi)加入線蟲提取物(l : 10，v/v);對(duì)照組(營(yíng)養(yǎng)菌絲組)內(nèi)加入等量無(wú)菌去離子水；將平皿靜置于26t:恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24-48h，大量的捕食器官(三維菌網(wǎng))產(chǎn)生。誘導(dǎo)結(jié)
束后，用無(wú)菌的6層紗布分別過濾收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的菌絲，并用無(wú)菌去離子水沖洗菌
絲3-4遍；用無(wú)菌濾紙去除菌絲內(nèi)的水分；菌絲用液氮凍干后，存于-S(TC待用。 5.捕食線蟲真菌對(duì)秀麗隱桿線蟲的捕捉觀察(以捕食線蟲真菌的模式菌株寡孢
節(jié)叢孢A. oligospora為例) 1)用1%的次氯酸鈉對(duì)秀麗隱桿線蟲進(jìn)行消毒處理后，用無(wú)菌去離子水反復(fù)沖洗 蟲體3-4次。將液體誘導(dǎo)產(chǎn)生的三維菌網(wǎng)鋪在水瓊脂平板上，加入100條/皿消毒后的秀 麗隱桿線蟲。 2)用光學(xué)顯微鏡(Olympus, Japan)觀察液體誘導(dǎo)產(chǎn)生的三維菌網(wǎng)的形態(tài)和對(duì)線 蟲的捕捉。 與以往的報(bào)道相比，本發(fā)明有以下幾個(gè)特征1)線蟲提取物能夠有效誘導(dǎo)捕食線 蟲真菌產(chǎn)生大量同步的捕食器官(10e捕食器官/mg菌絲)；2)線蟲提取物為水溶性物質(zhì)， 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過過濾、無(wú)菌去離子水沖洗的方法即可將線蟲提取物去除，對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn) 沒有影響；3)線蟲提取物的制備方法和三維菌網(wǎng)誘導(dǎo)方法簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好，可控性強(qiáng)。 4)本發(fā)明為進(jìn)一步研究捕食線蟲真菌捕食器官形成的分子機(jī)制提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例一 捕食線蟲真菌寡孢節(jié)叢孢菌絲捕食器官的誘導(dǎo) 按照上面所描述的方法制備線蟲提取物，寡孢節(jié)叢孢接種PDA液體培養(yǎng)基，26°C ， 160rpm培養(yǎng)5或6天，過濾收集菌絲。并用無(wú)菌去離子水沖洗菌絲3或4遍，去除培養(yǎng)基成 份，用適量無(wú)菌無(wú)菌去離子水懸浮菌絲，用于三維菌網(wǎng)的誘導(dǎo)。 將收集得到的寡孢節(jié)叢孢新鮮菌絲用無(wú)菌去離子水懸浮后，置于玻璃平皿內(nèi)，
40mL/皿實(shí)驗(yàn)組(三維菌網(wǎng)誘導(dǎo)組)內(nèi)加入線蟲提取物(1 : 10， v/v);對(duì)照組(營(yíng)養(yǎng)菌
絲組)內(nèi)加入等量無(wú)菌去離子水；將平皿靜置于26t:恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24或36或48h。
寡孢節(jié)叢孢的菌絲誘導(dǎo)15h后即可觀察到三維菌網(wǎng)產(chǎn)生，在20或24h時(shí)，大量的捕食器官
(三維菌網(wǎng))產(chǎn)生。不同批次的線蟲提取物對(duì)捕食器官的誘導(dǎo)能力差異較小。 實(shí)施例二 捕食線蟲真菌寡孢節(jié)叢孢分生孢子形成捕食器官的誘導(dǎo) 按照上面所描述的方法制備線蟲提取物，寡孢節(jié)叢孢接種CMA固體培養(yǎng)基，26t:
恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10天，以得到大量的孢子。用無(wú)菌水沖洗CMA平板上的寡孢節(jié)叢孢菌絲，
用移液器將平板上的液體轉(zhuǎn)移至裝有無(wú)菌擦鏡紙的漏斗內(nèi)過濾，收集孢子。 將收集得到的寡孢節(jié)叢孢孢子用無(wú)菌去離子水懸浮后，置于玻璃平皿內(nèi)，20mL/
皿實(shí)驗(yàn)組(三維菌網(wǎng)誘導(dǎo)組)內(nèi)加入線蟲提取物(1 : 10， v/v);對(duì)照組(營(yíng)養(yǎng)菌絲組)
內(nèi)加入等量無(wú)菌去離子水；將平皿靜置于26t:恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24或36或48h。寡孢節(jié)
叢孢的菌絲誘導(dǎo)12-15h后即可觀察到三維菌網(wǎng)產(chǎn)生，在20或24h時(shí)，大量的捕食器官(三
維菌網(wǎng))產(chǎn)生。
權(quán)利要求
一種誘導(dǎo)捕食線蟲真菌同步產(chǎn)生捕食器官的方法，包括線蟲培養(yǎng)、線蟲提取物制備，捕食線蟲真菌培養(yǎng)和捕食器官誘導(dǎo)步驟，其特征在于本方法具體如下(1).培養(yǎng)基和線蟲的培養(yǎng)a.在250mL三角瓶中加入10g燕麥片，加入30mL去離子水將燕麥片浸潤(rùn)，121℃滅菌20分鐘；b.秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)在滅菌的燕麥培養(yǎng)基中加入1mL的線蟲懸液，21-26℃培養(yǎng)6-7天，培養(yǎng)好的線蟲在4℃保存1周；(2).線蟲提取物的制備a.用3層擦鏡紙將含有秀麗隱桿線蟲的燕麥培養(yǎng)基包好，用貝氏漏斗法過夜收集燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)的線蟲；b.將收集到的線蟲用M9緩沖液清洗，去除殘留的培養(yǎng)基；c.離心收集線蟲，4℃，8,000g，離心20分鐘；d.用無(wú)菌去離子水懸浮線蟲，4℃，8,000g，離心20分鐘收集線蟲；重復(fù)3次；最后用無(wú)菌去離子水懸浮線蟲，10g線蟲加入30mL無(wú)菌去離子水；e.將線蟲懸浮液置于冰水混合物上超聲50％強(qiáng)度，6s ON，3s OFF，10分鐘；放置30分鐘后，再次超聲，6s ON，3s OFF，5分鐘；f.12,000g，離心30分鐘收集上清液；g.用0.22μm的濾膜過濾上清液，過濾后的上清液即為線蟲提取物，分裝后存于-80℃待用；(3).捕食線蟲真菌的培養(yǎng)a.CMA和PDA培養(yǎng)基CMA培養(yǎng)基稱取20g玉米粉，加入1000mL去離子水，100℃煮沸20分鐘，用6層紗布過濾收集液體，加入20g瓊脂，121℃滅菌20分鐘；PDA培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g，切塊、煮沸30分鐘，6層紗布過濾收集上清液，加入葡萄糖20g，加水補(bǔ)充體積到1000mL，121℃滅菌20分鐘；b.捕食線蟲真菌的活化和孢子培養(yǎng)在CMA固體培養(yǎng)基上接種捕食線蟲真菌，26℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10天，以得到大量的孢子，用無(wú)菌水沖洗CMA平板上的捕食線蟲真菌菌絲；用移液器將平板上的液體轉(zhuǎn)移至裝有無(wú)菌擦鏡紙的漏斗內(nèi)過濾，收集孢子；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并的計(jì)算孢子的濃度；c.捕食線蟲真菌的液體培養(yǎng)和新鮮菌絲的收集制備PDA液體培養(yǎng)基，分裝于500mL的三角瓶?jī)?nèi)，200mL培養(yǎng)基/瓶，在液體培養(yǎng)基內(nèi)接種孢子，100個(gè)孢子/mL液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)26℃，160rpm，5-6天，用無(wú)菌的6層紗布過濾收集菌絲，并用無(wú)菌去離子水沖洗菌絲3-4遍，去除培養(yǎng)基成份，用40mL無(wú)菌去離子水懸浮菌絲，用于三維菌網(wǎng)的液體誘導(dǎo)；(4).捕食線蟲真菌捕食器官的誘導(dǎo)將收集得到的捕食線蟲真菌新鮮菌絲用無(wú)菌去離子水懸浮后，在三維菌網(wǎng)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)加入線蟲提取物，加入量為1∶10，v/v；在營(yíng)養(yǎng)菌絲對(duì)照組內(nèi)加入等體積的無(wú)菌去離子水；將平皿靜置于26℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24-48h，大量的捕食器官三維菌網(wǎng)產(chǎn)生；誘導(dǎo)結(jié)束后，用無(wú)菌的4層紗布分別過濾收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的菌絲，并用無(wú)菌去離子水沖洗菌絲3-4遍；用無(wú)菌濾紙去除菌絲內(nèi)的水分；菌絲用液氮凍干后，存于-80℃待用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)捕食線蟲真菌同步產(chǎn)生捕食器官的方法，屬于應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括線蟲培養(yǎng)、線蟲提取物制備，捕食線蟲真菌培養(yǎng)和捕食器官誘導(dǎo)步驟。本發(fā)明通過培養(yǎng)線蟲(秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans)，利用超聲波破碎和離心制備線蟲提取物，利用線蟲提取物誘導(dǎo)捕食線蟲真菌同步產(chǎn)生大量捕食器官(106捕食器官/mg菌絲)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好，可以獲得大量同步的三維菌網(wǎng)，為進(jìn)一步研究捕食線蟲真菌捕食器官形成的分子機(jī)制提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。
文檔編號(hào)A01P5/00GK101724569SQ20091021831
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日
發(fā)明者張克勤, 楊金奎, 梁連銘, 米其利 申請(qǐng)人:云南大學(xué)