專利名稱：一種真姬菇單單雜交育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌的雜交育種方法，具體涉及一種高效的真姬菇(Hypsizygus marmoreus)單單雜交育種方法。公開了真姬菇單單雜交育種方法的整個(gè)流程及操作要求， 包括所需的培養(yǎng)基、親本的選擇、雜交的過程和技術(shù)、栽培出菇。
背景技術(shù)：
真姬菇(Hypsizigus marmoreus)又名玉覃、斑玉覃、海鮮菇、膠玉蘑、鴻喜菇、蟹味 菇、假松茸等。隸屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、離褶菌族、玉蕈屬，是北溫帶一種 優(yōu)良的食用菌。真姬菇味比平菇鮮，肉比滑菇厚，質(zhì)比香菇韌，口感極佳，還具有獨(dú)特的蟹香 味，在日本有“香在松口蘑、味在玉覃”之說。真姬菇分布在日本、北美和歐洲等北溫帶地區(qū)，是春秋季生木腐菌，主要生長在山 毛櫸及其他闊葉樹的枯木、風(fēng)倒木和樹樁上。真姬菇的蛋白質(zhì)中氨基酸種類齊全，包括8種 人體必需氨基酸，其中賴氨酸、精氨酸含量高于一般菇類。并且真姬菇是一種低熱量、低脂 肪的保健食品，其味鮮美、性平、甘溫，有利尿滲濕，健脾止渴之功能，清熱平肝之效?？诟袠O 佳，常食可提高免疫力、預(yù)防衰老、延長壽命，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。真姬菇的需溫特性，屬中低溫型。菌絲生長的適宜溫度為22°C _M°C，菇蕾分化的 適宜溫度為ire -14°C，子實(shí)體成長的適宜溫度是14°C -18°c。擔(dān)子菌亞門中多數(shù)擔(dān)子菌的雙核菌絲，在進(jìn)行細(xì)胞分裂時(shí)，于菌絲的分隔處形成 的一個(gè)側(cè)生的喙?fàn)罱Y(jié)構(gòu)。只出現(xiàn)在雙核菌絲上。其形成過程是首先，在細(xì)胞的兩核之間 生出一個(gè)喙?fàn)钔黄?，雙核中的一個(gè)移入喙?fàn)钔黄穑硪粋€(gè)仍留在細(xì)胞下部。兩異質(zhì)核同時(shí)分 裂，成為4個(gè)子核。分裂完成后，原位于喙基部的一子核與原位于細(xì)胞中的一子核移至細(xì)胞 上部配對(duì)；另外兩子核，一個(gè)進(jìn)入喙突中，一個(gè)留在細(xì)胞下部。此時(shí)細(xì)胞中部和喙基部均生 出橫隔，將原細(xì)胞分成三部分。上部是雙核細(xì)胞，下部和喙突部暫為兩單核細(xì)胞。此后，喙 突尖端繼續(xù)下延與細(xì)胞下部接觸并融通。同時(shí)喙突中的核進(jìn)入下部細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞下部也 成為雙核。經(jīng)如上變化后，4個(gè)子核分成2對(duì)，一個(gè)雙核細(xì)胞分裂為兩個(gè)。此過程結(jié)束后，在 兩細(xì)胞分融處殘留一個(gè)喙?fàn)罱Y(jié)構(gòu)，即鎖狀聯(lián)合。鎖狀聯(lián)合保證了雙核菌絲在進(jìn)行細(xì)胞分裂 時(shí)，每節(jié)(每個(gè)細(xì)胞)都能含有兩個(gè)異質(zhì)(遺傳型不同)的核，為進(jìn)行有性生殖，通過核配 形成擔(dān)子打下基礎(chǔ)。鎖狀聯(lián)合是雙核菌絲的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，凡是產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合的菌絲均可斷定 為雙核。鎖狀聯(lián)合也是擔(dān)子菌亞門的明顯特征之一。真姬菇也具有產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合的特征?，F(xiàn)有的專業(yè)蕈菌遺傳育種的方法，如《覃菌遺傳育種》張樹挺、林芳燦介紹，流程如 下(1)親本的選擇。選擇優(yōu)點(diǎn)多、能互補(bǔ)、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、其中一個(gè)是當(dāng)?shù)卮竺娣e推廣 的品種。(2)孢子采集、孢子稀釋涂布、挑單孢。(3)鏡檢鎖狀聯(lián)合的有無以獲得單核菌絲。(4)單核菌絲配對(duì)。
(5)鏡檢鎖狀聯(lián)合的有無以獲得雜合子。(6)雜合子小試、大試和推廣。因?yàn)檎婕Ч骄哂辛己玫氖袌?，中國、日本和韓國的一些企業(yè)開始在控制溫度、濕 度、光照和空氣交換的人工環(huán)境進(jìn)行工廠化栽培生產(chǎn)，但是真姬菇的菌株選育效率不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的高效的真姬菇單單雜交育種方法，通過此方法可 以提高優(yōu)良菌株的選育效率。該發(fā)明適用于真姬菇的育種，特別適于真姬菇的工廠化栽培生產(chǎn)。擔(dān)子菌亞門中多數(shù)擔(dān)子菌的雙核菌絲，在進(jìn)行細(xì)胞分裂時(shí)，于菌絲的分隔處形成 的一個(gè)側(cè)生的喙?fàn)罱Y(jié)構(gòu)。只出現(xiàn)在雙核菌絲上。鎖狀聯(lián)合保證了雙核菌絲在進(jìn)行細(xì)胞分裂 時(shí)，每節(jié)(每個(gè)細(xì)胞)都能含有兩個(gè)異質(zhì)(遺傳型不同)的核，為進(jìn)行有性生殖，通過核配 形成擔(dān)子打下基礎(chǔ)。鎖狀聯(lián)合是雙核菌絲的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，凡是產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合的菌絲均可斷定 為雙核。鎖狀聯(lián)合也是擔(dān)子菌亞門的明顯特征之一。真姬菇也具有產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合的特征。 應(yīng)用鎖狀聯(lián)合作為區(qū)分單核菌絲和雙核菌絲的標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種真姬菇單單雜交育種方法，包括(1)親本的選擇根據(jù)育種目標(biāo)選擇合適的親本，熟悉各親本的特點(diǎn)，熟悉其優(yōu)缺 點(diǎn)，親本之間有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，有好的配合力；(2)孢子采集、孢子稀釋涂布、挑單孢、鏡檢鎖狀聯(lián)合的有無以獲得單核菌絲；無 鎖狀聯(lián)合的為單核菌絲；所述孢子采集主要采用鉤懸法收集孢子；所述孢子稀釋涂布為無菌操作，涂布濃度為在40倍顯微視野中有2 3個(gè)孢子， 在16 21°C培養(yǎng)8-10天；所述挑單孢在稀疏的部位挑取單孢；(3)單核菌絲組合雜交親本單核菌絲要進(jìn)行配對(duì)雜交，選擇發(fā)菌速度快、菌絲濃 密、潔白的單核菌絲進(jìn)行配對(duì)雜交；所述單核菌絲鏡檢、擴(kuò)繁保種操作在63倍視野中，在不同的區(qū)域?qū)ふ? 5個(gè)視 野，無鎖狀聯(lián)合則為單核菌絲；配對(duì)雜交選擇發(fā)菌速度快，菌絲濃密潔白的單核菌絲配對(duì)；(4)鏡檢鎖狀聯(lián)合有無以獲得雜合子，有鎖狀聯(lián)合的為雜合子，然后進(jìn)行雜合子挑 取；所述雜合子鏡檢操作在63倍視野中，在不同的區(qū)域?qū)ふ? 5個(gè)視野，若有鎖狀 聯(lián)合則是雜合子挑取；所述雜合子挑取的條件a.當(dāng)兩單核菌絲生長到接觸后，鏡檢鎖狀聯(lián)合的有無，若有鎖狀聯(lián)合則說明雜交 成功，挑取雜合子。所述雜合子挑取原則a. 一個(gè)雜交組合能得出多種雜交后代，這些后代間的拮抗并不一定明顯；
b.若一個(gè)雜交組合的所有菌絲一股腦的都用來出菇，即便其中有優(yōu)良的部分也得 不到好的菌株；(5)栽培出菇試管種轉(zhuǎn)三角瓶種23-25天菌齡；三角瓶種轉(zhuǎn)原種33-35天菌齡；原種轉(zhuǎn)栽培種43-45天菌齡；栽培種搔菌83-85天菌齡；栽培出菇根據(jù)育種目標(biāo)設(shè)計(jì)栽培參數(shù)；所述栽培參數(shù)栽培室溫度設(shè)定為13 15°C，濕度90 95%，C02濃度1000 2000ppm,前1 7天光照強(qiáng)度50 lOOLux，后8 20天光照強(qiáng)度200 300Lux，每天間 隙式開啟層架燈；22 M天開始采收；出菇試驗(yàn)菌株開發(fā)、小試根據(jù)育種目標(biāo)設(shè)計(jì)合理的開發(fā)方案；a.每一個(gè)菌株有其營養(yǎng)和栽培條件的需要，對(duì)培養(yǎng)基、溫、濕、光、氣的要求不同；栽培種培養(yǎng)基玉米芯40 50%、大豆皮20 30%、米糠10 15%、麩皮15 20 %，玉米粉5 %，含水量64 66 %。栽培室溫度設(shè)定為13 15°C，濕度90 95%，C02濃度1000 2000ppm，前1 7天光照強(qiáng)度50 lOOLux，后8 20天光照強(qiáng)度200 300Lux，每天間隙式開啟層架燈； 22 M天開始采收。b.各個(gè)菌株有其優(yōu)勢方向，要發(fā)揚(yáng)優(yōu)勢，避免劣勢；比如低菌齡，開發(fā)出的白色蟹味菇菌株較普通白色蟹味菇的菌齡縮短19-21天， 開發(fā)出的棕色蟹味菇菌株較普通棕色蟹味菇縮短M-26天；又如無瘤蓋，開發(fā)出的白色蟹味菇菌株的菌蓋較普通白色蟹味菇的菌蓋不會(huì)出現(xiàn) 瘤蓋菇現(xiàn)象，開發(fā)出的棕色蟹味菇菌株的菌蓋較普通棕色蟹味菇的菌蓋不會(huì)出現(xiàn)瘤蓋菇現(xiàn)象。c.根據(jù)育種目標(biāo)設(shè)計(jì)有效地開發(fā)方法，比如目的獲得短菌齡的菌株，要設(shè)計(jì)較 寬的從55天菌齡到100天菌齡，5天菌齡作為一個(gè)梯度的菌齡實(shí)驗(yàn)；(6)中試、大試、推廣；將經(jīng)過中試、大試的農(nóng)藝性狀優(yōu)良的菌株進(jìn)行常規(guī)經(jīng)過法定技術(shù)鑒定而成為食用 菌新品種，進(jìn)行推廣。本發(fā)明的有益效果遺傳有細(xì)胞質(zhì)遺傳和細(xì)胞核遺傳，本發(fā)明方法滿足了好的遺傳物質(zhì)(DNA、基因) 需要合適的環(huán)境(細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器)配合的要求，能發(fā)揮其最大效應(yīng)。本方法大大提高了育種效率。把育種時(shí)間從幾年降為18個(gè)月，得到多個(gè)高產(chǎn)、優(yōu) 質(zhì)、抗逆強(qiáng)的菌株，并且它們適合工廠化栽培。
以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
來進(jìn)一步說明本發(fā)明。


圖1為本發(fā)明的真姬菇單單雜交流程圖。圖2為本發(fā)明的真姬菇雜合子挑取方式的示意圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具 體圖示，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。一種真姬菇單單雜交育種方法，如
圖1所示所示，包括(1)親本的選擇根據(jù)育種目標(biāo)選擇合適的真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)親本 F-ff(白色)和親本F-4(棕色)，熟悉各親本的特點(diǎn)，熟悉其優(yōu)缺點(diǎn)，親本之間有較遠(yuǎn)的親緣 關(guān)系，有好的配合力；(2)孢子采集、孢子稀釋涂布、挑單孢、鏡檢鎖狀聯(lián)合的有無以獲得單核菌絲；無 鎖狀聯(lián)合的為單核菌絲；試管、平皿培養(yǎng)基、三角瓶培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基。孢子采集主要采用鉤懸法收 集孢子；鉤懸法取成熟菌蓋的幾片菌褶或一小塊真姬菇，用無菌不銹鋼絲或鐵絲、棉線等 其他懸掛材料懸掛于三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基的上方，培養(yǎng)基的厚度為1cm，勿使接觸到培養(yǎng)基或 四周瓶壁。25°C、24h現(xiàn)孢子粉，取出分離材料，22°C -25°C，挑健壯尖端菌絲轉(zhuǎn)管，純化。孢子稀釋涂布為無菌操作，涂布濃度為在40倍顯微視野中有2 3個(gè)孢子，在 16 21°C培養(yǎng)8-10天；所述挑單孢在稀疏的部位挑取單孢；(3)單核菌絲組合雜交親本單核菌絲要進(jìn)行配對(duì)雜交，選擇發(fā)菌速度快、菌絲濃 密、潔白的單核菌絲進(jìn)行配對(duì)雜交；單核菌絲鏡檢、擴(kuò)繁保種操作在63倍視野中，在不同的區(qū)域?qū)ふ? 5個(gè)視野，無 鎖狀聯(lián)合則為單核菌絲；配對(duì)雜交選擇發(fā)菌速度快，菌絲濃密潔白的單核菌絲配對(duì)；(4)鏡檢鎖狀聯(lián)合有無以獲得雜合子，有鎖狀聯(lián)合的為雜合子，然后進(jìn)行雜合子挑 ??；雜合子鏡檢操作在63倍視野中，在不同的區(qū)域?qū)ふ? 5個(gè)視野，若有鎖狀聯(lián)合 則是雜合子挑?。凰鲭s合子挑取的條件a.當(dāng)兩單核菌絲生長到接觸后，鏡檢鎖狀聯(lián)合的有無，若有鎖狀聯(lián)合則說明雜交 成功，挑取雜合子。雜合子挑取原則如圖2所示。a. 一個(gè)雜交組合能得出多種雜交后代，這些后代間的拮抗并不一定明顯；b.若一個(gè)雜交組合的所有菌絲一股腦的都用來出菇，即便其中有優(yōu)良的部分也得 不到好的菌株；(5)栽培出菇，每個(gè)育種者必須也會(huì)栽培，良種還要有良法栽培室溫度設(shè)定為13 15°C，濕度90 95%，C02濃度1000 2000ppm，前1 7天光照強(qiáng)度50 lOOLux，后8 20天光照強(qiáng)度200 300Lux，每天間隙式開啟層架燈。 22 M天開始采收；試管種轉(zhuǎn)三角瓶種23-25天菌齡；三角瓶種轉(zhuǎn)原種33-35天菌齡；原種培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g；原種轉(zhuǎn)栽培種43-45天菌齡；栽培種培養(yǎng)基玉米芯40 50%、大豆皮20 30%、米糠10 15%、麩皮15 20%，玉米粉5%，含水量64 66%。栽培種搔菌83-85天菌齡；栽培出菇根據(jù)育種目標(biāo)設(shè)計(jì)栽培參數(shù)，栽培室溫度設(shè)定為13 15°C，濕度90 95%,C02濃度1000 2000ppm，前1 7天光照強(qiáng)度50 lOOLux，后8 20天光照強(qiáng)度 200 300LUX，每天間隙式開啟層架燈。22 M天開始采收；出菇試驗(yàn)(菌株開發(fā)、小試)根據(jù)育種目標(biāo)設(shè)計(jì)合理的開發(fā)方案；a.每一個(gè)菌株有其營養(yǎng)和栽培條件的需要，對(duì)培養(yǎng)基、溫、濕、光、氣的要求不同；栽培種培養(yǎng)基玉米芯40 50%、大豆皮20 30%、米糠10 15%、麩皮15 20%，玉米粉5%，含水量64 66%。栽培室溫度設(shè)定為13 15°C，濕度90 95%，C02濃度1000 2000ppm，前1 7天光照強(qiáng)度50 lOOLux，后8 20天光照強(qiáng)度200 300Lux，每天間隙式開啟層架燈。 22 M天開始采收。b.各個(gè)菌株有其優(yōu)勢方向，要發(fā)揚(yáng)優(yōu)勢，避免劣勢；比如低菌齡，開發(fā)出的白色蟹味菇菌株較普通白色蟹味菇的菌齡縮短19-21天， 開發(fā)出的棕色蟹味菇菌株較普通棕色蟹味菇縮短M-26天；又如無瘤蓋，開發(fā)出的白色蟹味菇菌株的菌蓋較普通白色蟹味菇的菌蓋不會(huì)出現(xiàn) 瘤蓋菇現(xiàn)象，開發(fā)出的棕色蟹味菇菌株的菌蓋較普通棕色蟹味菇的菌蓋不會(huì)出現(xiàn)瘤蓋菇現(xiàn)象。c.根據(jù)育種目標(biāo)設(shè)計(jì)有效地開發(fā)方法，比如目的獲得短菌齡的菌株，要設(shè)計(jì)較 寬的從55天菌齡到100天菌齡，5天菌齡作為一個(gè)梯度的菌齡實(shí)驗(yàn)；(6)中試、大試、推廣；將經(jīng)過中試、大試的農(nóng)藝性狀優(yōu)良的菌株進(jìn)行常規(guī)經(jīng)過法定技術(shù)鑒定而成為食用 菌新品種，進(jìn)行推廣。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變 化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其 等同物界定。
權(quán)利要求
1.一種真姬菇單單雜交育種方法，包括如下步驟(1)親本的選擇根據(jù)育種目標(biāo)選擇合適的親本，熟悉各親本的特點(diǎn)，熟悉其優(yōu)缺點(diǎn)， 親本之間有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，有好的配合力；(2)孢子采集、孢子稀釋涂布、挑單孢、鏡檢鎖狀聯(lián)合的有無以獲得單核菌絲；無鎖狀 聯(lián)合的為單核菌絲；(3)單核菌絲組合雜交親本單核菌絲要進(jìn)行配對(duì)雜交，選擇發(fā)菌速度快、菌絲濃密、 潔白的單核菌絲進(jìn)行配對(duì)雜交；(4)鏡檢鎖狀聯(lián)合有無以獲得雜合子，有鎖狀聯(lián)合的為雜合子，然后進(jìn)行雜合子挑??；所述雜合子挑取的條件a.當(dāng)兩單核菌絲生長到接觸后，鏡檢鎖狀聯(lián)合的有無，若有鎖狀聯(lián)合則說明雜交成功， 挑取雜合子。(5)栽培出菇試管種轉(zhuǎn)三角瓶種23-25天菌齡；三角瓶種轉(zhuǎn)原種33-35天菌齡；原種轉(zhuǎn)栽培種43-45天菌齡；栽培種搔菌83-85天菌齡；栽培出菇根據(jù)育種目標(biāo)設(shè)計(jì)栽培參數(shù)；出菇試驗(yàn)菌株開發(fā)、小試根據(jù)育種目標(biāo)設(shè)計(jì)合理的開發(fā)方案；(6)中試、大試、推廣。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種真姬菇單單雜交育種方法，其特征在于，步驟2中所述孢 子采集主要采用鉤懸法收集孢子；所述孢子稀釋涂布為無菌操作，涂布濃度為在40倍顯微 視野中有2 3個(gè)孢子，在16 21°C培養(yǎng)8-10天；所述挑單孢在稀疏的部位挑取單孢。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種真姬菇單單雜交育種方法，其特征在于，步驟3中所述單 核菌絲鏡檢、擴(kuò)繁保種操作在63倍視野中，在不同的區(qū)域?qū)ふ? 5個(gè)視野，無鎖狀聯(lián)合則 為單核菌絲；配對(duì)雜交選擇發(fā)菌速度快，菌絲濃密潔白的單核菌絲配對(duì)；單核菌絲組合雜 交親本單核要進(jìn)行合適的組合，選擇發(fā)菌速度快、菌絲濃密的單核菌絲進(jìn)行組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種真姬菇單單雜交育種方法，其特征在于，所述雜合子鏡 檢操作在63倍視野中，在不同的區(qū)域?qū)ふ? 5個(gè)視野，若有鎖狀聯(lián)合則是雜合子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種真姬菇單單雜交育種方法，其特征在于，步驟5中所述栽 培參數(shù)栽培室溫度設(shè)定為13 15°C，濕度90 95%，C02濃度1000 2000ppm，前1 7天光照強(qiáng)度50 lOOLux，后8 20天光照強(qiáng)度200 300Lux，每天間隙式開啟層架燈； 22 M天開始采收。
全文摘要
一種真姬菇單單雜交育種方法，包括親本的選擇；孢子采集、孢子稀釋涂布、挑單孢、鏡檢無鎖狀聯(lián)合的為單核菌絲；所述孢子稀釋涂布為無菌操作，涂布濃度為在40倍顯微視野中有2～3個(gè)孢子，在16～21℃培養(yǎng)8-10天；在稀疏的部位挑取單孢；單核菌絲組合雜交親本單核菌絲要進(jìn)行配對(duì)雜交，選擇發(fā)菌速度快、菌絲濃密、潔白的單核菌絲進(jìn)行配對(duì)雜交；鏡檢有鎖狀聯(lián)合的為雜合子，然后進(jìn)行雜合子挑取；所述雜合子鏡檢操作在63倍視野中，在不同的區(qū)域?qū)ふ?～5個(gè)視野，若有鎖狀聯(lián)合則是雜合子；栽培出菇；中試、大試、推廣；本方法把育種時(shí)間從幾年降為18個(gè)月，得到多個(gè)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆強(qiáng)的菌株。
文檔編號(hào)A01H15/00GK102047839SQ200910221369
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日
發(fā)明者劉玉, 程繼紅, 陳傳喜 申請(qǐng)人:上海豐科生物科技股份有限公司