專利名稱：：一種小麥組織培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種小麥組織培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
：組織培養(yǎng)高頻率再生是細(xì)胞工程育種、基因工程育種和功能基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)，煙草、擬南芥等雙子葉植物和水稻、短柄草等單子葉植物再生非常容易，因而成為了基因工程研究的模式植物。相比之下，小麥組織培養(yǎng)還不穩(wěn)定，在很大程度上受外植體類型、生理狀態(tài)、基因型和培養(yǎng)基等因素的限制，影響了基因工程育種和功能基因組學(xué)研究的進(jìn)程。目前為止，小麥組織培養(yǎng)成功的外植體包括幼胚、幼穗、花藥、成熟胚等，幼胚培養(yǎng)最為容易，花藥培養(yǎng)和幼穗培養(yǎng)次之，成熟胚培養(yǎng)最難。因此，幼胚一直被用作小麥組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因研究的理想材料，愈傷組織誘導(dǎo)率和植株再生率相對(duì)較高。小麥成熟胚培養(yǎng)取得了一定進(jìn)展，并已成功用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化。無論是小麥哪種外植體的組織培養(yǎng)，常規(guī)方法是先將外植體接種在含有2.0mg/12，4-D或Dicamba等生長素的培養(yǎng)基上黑暗條件下培養(yǎng)4周左右誘導(dǎo)愈傷組織，然后轉(zhuǎn)移到去掉2.0mg/12，4-D或Dicamba等生長素的培養(yǎng)基上，光照條件下分化植株。利用這樣的技術(shù)體系，不同小麥基因型在相同條件下和同一小麥基因型在不同生理狀態(tài)，培養(yǎng)效果差異顯著，很多基因型不能成功再生或再生率很低，不能滿足基因工程研究的需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種小麥的組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明所提供的小麥組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟先將小麥胚誘導(dǎo)培養(yǎng)成胚性愈傷組織；再將所述胚性愈傷組織分化培養(yǎng)成小麥再生植株；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法包括如下步驟將所述小麥胚依次用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)1、用不含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)n、再用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)III，得到胚性愈傷組織。上述過程中，所述小麥胚可為小麥幼胚。當(dāng)所述小麥胚為小麥幼胚時(shí)，所述含有生長素的培養(yǎng)基具體組成如下由終濃度為1650mg/L的NH4N0p終濃度為1900mg/L的KN0p終濃度為440mg/L的CaCl2*21120、終濃度為370mg/L的MgS04*71120、終濃度為1700mg/L的1(1^04、終濃度為0.83mg/L的KI、終濃度為6.2mg/L的！13803、終濃度為22.3mg/L的MnS0441120、終濃度為8.6mg/L的ZnS0471120、終濃度為0.25mg/L的Na2Mo04*21120、終濃度為0.025mg/L的CuS04*51120、終濃度為0.025mg/L的CoCl261120、終濃度為27.8mg/L的FeS0471120、終濃度為37.3mg/L的Na廠EDTA2H20、終濃度為30g/L的蔗糖、終濃度為10mg/L的維生素B1、終濃度為150mg/L的谷氨酰胺、終濃度為2.Omg/L的2，4-D、終濃度為2.4g/L的Phytagel(植物凝膠)組成；所述終濃度為各物質(zhì)在所述含有生長素的培養(yǎng)基中的濃度。該含有生長素的培養(yǎng)基的PH值具體可為6.0。當(dāng)所述小麥胚為小麥幼胚時(shí)，所述不含有生長素的培養(yǎng)基的組成為除了不含有2，4-D夕卜，其余組成與上述含有生長素的培養(yǎng)基的組成相同。當(dāng)所述小麥胚為小麥幼胚時(shí)，所述分化培養(yǎng)中用到的培養(yǎng)基的組成具體如下由終濃度為1650mg/L的NH4N0p終濃度為1900mg/L的KNOy終濃度為440mg/L的CaCl2*2H20、終濃度為370mg/L的MgS047H20、終濃度為1700mg/L的KH2P04、終濃度為0.83mg/L的KI、終濃度為6.2mg/L的！13803、終濃度為22.3mg/L的MnS0441120、終濃度為8.6mg/L的ZnS0471120、終濃度為0.25mg/L的Na2Mo0421120、終濃度為0.025mg/L的CuS045叫、終濃度為0.025mg/L的CoCl261120、終濃度為27.8mg/L的FeS0471120、終濃度為37.3mg/L的Na2-EDTA*21120、終濃度為lmg/L的V『終濃度為0.5mg/L的Vp終濃度為0.5mg/L的煙酸、終濃度為2mg/L的甘氨酸、終濃度為100mg/L的肌醇、終濃度為20g/L的蔗糖、終濃度為2.4g/L的Phytagel組成；所述終濃度為各物質(zhì)在所述分化培養(yǎng)中用到的培養(yǎng)基中的濃度；該分化培養(yǎng)中用到的培養(yǎng)基的PH值為6.0。上述過程中，所述小麥幼胚可為心形期小麥幼胚。上述過程中，當(dāng)所述小麥胚為小麥幼胚時(shí)，所述小麥具體可為小麥品系中8601、小麥品系HW642或小麥品種濟(jì)麥22。上述過程中，所述小麥胚還可為小麥成熟胚。上述過程中，當(dāng)所述小麥胚為小麥成熟胚時(shí)，所述含有生長素的培養(yǎng)基的組成具體如下由終濃度為1650mg/L的朋4冊(cè)3、終濃度為1900mg/L的KNOy終濃度為440mg/L的CaCl221120、終濃度為370mg/L的MgS0471120、終濃度為1700mg/L的,04、終濃度為0.83mg/L的KI、終濃度為6.2mg/L的！13803、終濃度為22.3mg/L的MnS0441120、終濃度為8.6mg/L的ZnS0471120、終濃度為0.25mg/L的Na2Mo0421120、終濃度為0.025mg/L的CuS0451120、終濃度為0.025mg/L的CoCl261120、終濃度為27.8mg/L的FeS0471120、終濃度為37.3mg/L的Na2-EDTA*21120、終濃度為0.75g/L的MgCl"終濃度為15g/L的甘露醇、終濃度為15g/L的山梨醇、終濃度為2.4g/L的植物凝膠、終濃度為5mg/L的谷氨酰氨、終濃度為500mg/L的水解酪蛋白、終濃度為12g/L的葡萄糖、終濃度為10mg/L的維生素B1、終濃度為lmg/L的維生素B6、終濃度為lmg/L的煙酸、終濃度為2mg/L的甘氨酸、終濃度為39mg/L的乙酰丁香酮、終濃度為2mg/L的Dicamba、終濃度為4mg/L的AgNO終濃度為40mg/L的半胱氨酸、終濃度為100mg/L的Vc組成；所述終濃度為各物質(zhì)在所述含有生長素的培養(yǎng)基中的濃度；該含有生長素的培養(yǎng)基的PH值具體可為6.0。上述過程中，當(dāng)所述小麥胚為小麥成熟胚時(shí)，所述不含有生長素的培養(yǎng)基的組成為除了不含有Dicamba夕卜，其余組成與所述含有生長素的培養(yǎng)基的組成相同。上述過程中，當(dāng)所述小麥胚為小麥成熟胚時(shí)，所述分化培養(yǎng)中用到的培養(yǎng)基的組成具體可如下由終濃度為1650mg/L的朋4冊(cè)3、終濃度為1900mg/L的KNO終濃度為440mg/L的CaCl2*21120、終濃度為370mg/L的MgS0471120、終濃度為1700mg/L的KH2P04Jf濃度為0.83mg/L的KI、終濃度為6.2mg/L的！13803、終濃度為22.3mg/L的MnS0441120、終濃度為8.6mg/L的ZnS0471120、終濃度為0.25mg/L的Na2Mo0421120、終濃度為0.025mg/L的CuS0451120、終濃度為0.025mg/L的CoCl261120、終濃度為27.8mg/L的FeS0471120、終濃度為37.3mg/L的Na2-EDTA21120、終濃度為30g/L的蔗糖、終濃度為10mg/L的V『終濃度為lmg/L的V『終濃度為lmg/L的煙酸、終濃度為2mg/L的甘氨酸、終濃度為5mg/L的谷氨酰胺、終濃度為0.2mg/L的IAA、終濃度為2.4g/L的Phytagel組成；該分化培養(yǎng)中用到的培養(yǎng)基的pH值為6.0。上述過程中，當(dāng)所述小麥胚為小麥成熟胚時(shí)，所述小麥具體可為小麥品系CB037。上述過程中，所述用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)I的時(shí)間可為7-9天，優(yōu)選為8天；所述用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)III的時(shí)間可為7-9天，優(yōu)選為8天；所述用不含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)II的時(shí)間可為6-14天，進(jìn)一步可為6-12天、具體可為10-14天，優(yōu)選為12天。上述過程中，所述用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)1、所述用不含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)II和所述用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)III中，培養(yǎng)的條件為黑暗、溫度為24°C_26°C。—般的小麥組培中，在誘導(dǎo)形成愈傷組織階段均是持續(xù)用生長素處理，本發(fā)明的小麥組織培養(yǎng)方法，在誘導(dǎo)形成愈傷組織階段采用"生長素_中斷生長素_生長素"培養(yǎng)模式，使小麥綠苗的獲得率大大提高。實(shí)驗(yàn)證明，小麥中8601幼胚培養(yǎng)綠苗獲得率為208.2%，常規(guī)培養(yǎng)方法沒有獲得再生植株(圖1，圖3，表1);小麥濟(jì)麥22幼胚培養(yǎng)綠苗獲得率為25.3%，常規(guī)培養(yǎng)方法再生率僅為0.9%(圖4);小麥HW642幼胚培養(yǎng)綠苗獲得率為211.3%，常規(guī)培養(yǎng)方法再生率僅為26.2%(圖5);小麥CB037成熟胚培養(yǎng)綠苗獲得率為67.1%，常規(guī)培養(yǎng)方法再生率為32.4%(圖6);本發(fā)明方法使綠苗獲得率提高了10-20倍。在生長素中斷處理0-12天的范圍內(nèi)，綠苗獲得率隨生長素中斷時(shí)間的延長顯著增加(圖l，表l)，過氧化氫酶等再生相關(guān)基因表達(dá)量隨生長素中斷時(shí)間的延長明顯增強(qiáng)，生長素中斷9天表達(dá)量最高，表明過氧化氫酶基因與再生性狀具有正相關(guān)性(圖2)。結(jié)果表明，小麥幼胚、成熟胚經(jīng)生長素處理7-9天足以誘導(dǎo)小麥細(xì)胞脫分化；相反，較長時(shí)間生長素處理抑制了小麥再生相關(guān)基因表達(dá)和細(xì)胞再分化，不利于胚性愈傷組織形成，降低了綠苗獲得率。本發(fā)明方法通過改進(jìn)培養(yǎng)程序等技術(shù)環(huán)節(jié)，進(jìn)一步提高了小麥幼胚和成熟胚再生頻率，克服基因型、生理狀態(tài)等條件對(duì)再生的障礙，減弱小麥組織培養(yǎng)對(duì)基因型、生理狀態(tài)等因素的強(qiáng)烈依賴性，為小麥細(xì)胞工程育種、基因工程育種和功能基因組學(xué)研究提供技術(shù)支撐，大大提高了工作效率，對(duì)于小麥生物技術(shù)育種和功能基因組學(xué)研究具有重要意義。圖1.生長素間歇處理不同時(shí)間對(duì)小麥幼胚再生效果的影響圖2.生長素間歇處理不同時(shí)間小麥幼胚愈傷組織中再生相關(guān)基因表達(dá)情況(過氧化氫酶編碼基因)圖3.利用本發(fā)明技術(shù)和常用技術(shù)培養(yǎng)小麥中8601幼胚再生效果比較圖4.利用本發(fā)明技術(shù)和常用技術(shù)培養(yǎng)小麥濟(jì)麥22幼胚再生效果比較圖5.利用本發(fā)明技術(shù)培養(yǎng)小麥HW642幼胚再生效果比較圖6.利用本發(fā)明技術(shù)和常用技術(shù)培養(yǎng)小麥CB037成熟胚再生效果比較具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。小麥幼胚的定義小麥子房授粉后發(fā)育13-14天的小麥幼嫩籽粒上剝?nèi)〉男←溑?；小麥成熟胚的定義成熟期從小麥植株上收獲后儲(chǔ)藏2-3個(gè)月的小麥籽粒上剝?nèi)〉男←溑摺?品種"為國家或省市品種審定委員會(huì)審定的遺傳材料，可在適宜地區(qū)推廣種植；"品系"為育種單位選育的具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的高代遺傳材料，通過審定后成為品種或作為品種資源進(jìn)行育種和研究利用；多數(shù)情況下也把品系寫作品種。小麥品種濟(jì)麥22(世界農(nóng)業(yè)，2009，9:78)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)；小麥品系中8601(徐惠君等，遺傳學(xué)報(bào)，1996，5:377-381)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)；小麥品系CB037(陶麗莉，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文，2009年6月)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)；小麥品系HW642(張?jiān)銎G等，作物學(xué)報(bào)，2002，28(4):486-491)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)；遺傳資源名稱小麥品種濟(jì)麥22。遺傳資源的獲取途徑I、遺傳資源取自植物，n、獲取方式贈(zèng)送。直接來源獲取時(shí)間2007年8月；非采集方式，提供者姓名或名稱山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，提供者所處國家或地區(qū)中國山東省，提供者聯(lián)系方式(山東省濟(jì)南市桑園路28號(hào)山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所)。原始來源不清楚。遺傳資源名稱小麥品系中8601。遺傳資源的獲取途徑I、遺傳資源取自植物，11、獲取方式國家種質(zhì)庫。直接來源獲取時(shí)間2006年3月；非采集方式，提供者姓名或名稱中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所作物種質(zhì)資源保存中心，提供者所處國家或地區(qū)中國北京市，提供者聯(lián)系方式北京市中關(guān)村南大街12號(hào)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。原始來源不清楚。遺傳資源名稱小麥品系CB037。遺傳資源的獲取途徑I、遺傳資源取自植物，I工、獲取方式其他(發(fā)明人課題組選育并保存)。直接來源2006年；非采集方式，提供者姓名或名稱中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，提供者所處國家或地區(qū)中國北京市，提供者聯(lián)系方式北京市中關(guān)村南大街12號(hào)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。原始來源不清楚。遺傳資源名稱小麥品系HW642。遺傳資源的獲取途徑I、遺傳資源取自植物，11、獲取方式其他(發(fā)明人課題組選育并保存)。直接來源獲取時(shí)間2005年；非采集方式，提供者姓名或名稱中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，提供者所處國家或地區(qū)中國北京市，提供者聯(lián)系方式北京市中關(guān)村南大街12號(hào)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所；原始來源不清楚。實(shí)施例1、用小麥幼胚進(jìn)行組織培養(yǎng)本實(shí)施例中，分別以如下小麥品種為實(shí)驗(yàn)對(duì)象小麥中8601、小麥HW642和小麥濟(jì)麥22。每個(gè)小麥材料的組培方法步驟如下—、小麥幼胚的獲得將小麥中8601、小麥HW642和小麥濟(jì)麥22種植在河北沽源夏繁基地(4_7月份小麥生長期間溫度10-25°C)，開花授粉后13-14天，收集小麥中8601、小麥HW642和小麥濟(jì)麥22的幼胚(心形期，大小為1.0-1.2mm)。二、組織培養(yǎng)1、誘導(dǎo)培養(yǎng)得到胚性愈傷組織將上述小麥幼胚接種在下述SD2培養(yǎng)基上培養(yǎng)8天(黑暗，25°C)，得到愈傷組織6I;將愈傷組織轉(zhuǎn)移到下述SD0培養(yǎng)基培養(yǎng)3、6、9或12天(黑暗，25tO(中8601做了培養(yǎng)3、6、9或12天的實(shí)驗(yàn)，HW642和濟(jì)麥22只培養(yǎng)了12天)，得到愈傷組織II;再將愈傷組織II轉(zhuǎn)移到下述SD2培養(yǎng)基培養(yǎng)8天(黑暗，25t:)，得到胚性愈傷組織III。2、分化培養(yǎng)得到小麥再生植株將胚性愈傷組織III轉(zhuǎn)移到下述FHCK培養(yǎng)基上培養(yǎng)20-25天(光照強(qiáng)度為3500Lx，溫度為25°C)，分化得到小麥苗。記錄接種幼胚數(shù)目，統(tǒng)計(jì)得到的胚性愈傷組織數(shù)目、愈傷組織分化數(shù)目、分化得到的小麥苗數(shù)目、胚性愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織分化率、綠苗獲得率。胚性愈傷組織誘導(dǎo)率(％)=(胚性愈傷組織數(shù)+接種幼胚數(shù))X100愈傷組織分化率(％)=(分化愈傷組織數(shù)+接種幼胚數(shù))X100綠苗獲得率(％)=(分化綠苗數(shù)+接種幼胚數(shù))X100各培養(yǎng)基均采用12rC高壓濕熱滅菌20分鐘。SD2培養(yǎng)基組成由終濃度為1650mg/L的NH4N03、終濃度為1900mg/L的KN03、終濃度為440mg/L的CaCl221120、終濃度為370mg/L的MgS0471120、終濃度為1700mg/L的KH2P04、終濃度為0.83mg/L的KI、終濃度為6.2mg/L的H萬、終濃度為22.3mg/L的MnS0441120、終濃度為8.6mg/L的ZnS0471120、終濃度為0.25mg/L的Na2Mo0421120、終濃度為0.025mg/L的CuS04*51120、終濃度為0.025mg/L的CoCl261120、終濃度為27.8mg/L的FeS04*71120、終濃度為37.3mg/L的Na2_EDTA*21120、終濃度為30g/L的蔗糖、終濃度為10mg/L的維生素Bl、終濃度為150mg/L的谷氨酰胺、終濃度為2.Omg/L的2，4-D、終濃度為2.4g/L的Phytagel(植物凝膠)組成；所述終濃度為各物質(zhì)在所述SD2培養(yǎng)基中的濃度；SD2培養(yǎng)基的pH值為6.0。以上成分采用12rC高壓濕熱滅菌20分鐘。SDO培養(yǎng)基除了不含有2，4_D夕卜，其它成份與用量與SD2培養(yǎng)基完全相同。FHCK培養(yǎng)基組成由終濃度為1650mg/L的NH4N03、終濃度為1900mg/L的KN03、終濃度為440mg/L的CaCl221120、終濃度為370mg/L的MgS0471120、終濃度為1700mg/L的KH2P04、終濃度為0.83mg/L的KI、終濃度為6.2mg/L的H萬、終濃度為22.3mg/L的MnS0441120、終濃度為8.6mg/L的ZnS0471120、終濃度為0.25mg/L的Na2Mo0421120、終濃度為0.025mg/L的CuS04*51120、終濃度為0.025mg/L的CoCl261120、終濃度為27.8mg/L的FeS04*71120、終濃度為37.3mg/L的Na2_EDTA*21120、終濃度為lmg/L的V『終濃度為0.5mg/L的V朋、終濃度為0.5mg/L的煙酸、終濃度為2mg/L的甘氨酸、終濃度為100mg/L的肌醇、終濃度為20g/L的蔗糖、終濃度為2.4g/L的Phytagel組成；所述終濃度為各物質(zhì)在所述FHCK培養(yǎng)基中的濃度；FHCK培養(yǎng)基的pH值為6.0。以上成分采用12rC高壓濕熱滅菌20分鐘。三、對(duì)照組2，4-D持續(xù)處理對(duì)照方法將相同的小麥幼胚接種在SD2培養(yǎng)基上黑暗條件下培養(yǎng)4周左右，誘導(dǎo)得到愈傷組織，然后轉(zhuǎn)移到FHCK培養(yǎng)基上，光照條件下(光照強(qiáng)度為3500Lx，溫度25°C)分化得到小麥再生植株。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果取平均數(shù)。中8601小麥幼胚的組織培養(yǎng)情況如表1所示。小麥中8601綠苗獲得率為208.2%(圖1，圖3，表1)，對(duì)照組沒有獲得再生植株；小麥濟(jì)麥22綠苗獲得率為25.3%，對(duì)照組綠苗獲得率僅為0.9%(圖4);小麥HW642綠苗獲得率為211.3%，對(duì)照組綠苗獲得率僅為26.2%(圖5)。圖1中，A:對(duì)照(生長素持續(xù)處理)；B:生長素間歇3天；C:生長素間歇6天；D:生長素間歇9天；E:生長素間歇12天。圖3中，圖4中，圖5中，A為對(duì)照組，B為本發(fā)明方法組。表1.中8601小麥幼胚生長素不同間歇時(shí)間的再生情況<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>四、中8601愈傷組織中過氧化氫酶基因表達(dá)分析對(duì)于不同生長素間歇處理的中8601(即中斷生長素3、6、9、12天的處理)，在分化培養(yǎng)基上取愈傷組織，迅速置于液氮速凍，-7(TC保存供RNA提取之用。采用TRIzol試劑盒(Tiangen，Beijing)進(jìn)行材料總RNA提取，方法參考試劑盒說明。反轉(zhuǎn)錄按照PrimeScript1ststrandcDNASynthesis(TaKaRa，大連)試劑盒進(jìn)行。以小麥Tubulin作為內(nèi)標(biāo)，采用半定量RT-PCR法進(jìn)行模板均一化，均一好的模板立即進(jìn)行過氧化氫酶基因的表達(dá)分析。模板均一的PCR擴(kuò)增條件94t:變性4min，28個(gè)循環(huán)包括94。C變性30s，6rC退火30s，72。C延伸20s，最后72。C延伸10min;過氧化氫酶基因RT-PCR擴(kuò)增條件94t:變性4min，25個(gè)循環(huán)包括94。C變性30s，55-62t:退火30s，72t:延伸20s，最后72。C延伸10min;1%瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，采用Quantity-Onediscoveryseries(BioRad，USA)進(jìn)行定量分析。Tubulin內(nèi)標(biāo)引物5'-TCCTCCTATGCCCCAGTGATC—3'，5'-ACTCATCGCCCTCATCACCG-3'。過氧化氫酶基因引物5'-CAAGGGCTTCTTCGAGGTCAC-3'，5'-TGTAGAAGGTCCACTCCGGGTAG-3，。結(jié)果如圖2所示(0d:表示生長素持續(xù)處理(對(duì)照)；3d、6d、9d、12d:分別表示生長素間歇3天、6天、9天和12天)。表明過氧化氫酶再生相關(guān)基因表達(dá)量隨生長素中斷時(shí)間的延長明顯增強(qiáng)，生長素中斷9天表達(dá)量最高，表明過氧化氫酶再生相關(guān)基因與再生性狀具有正相關(guān)性。實(shí)施例2、用小麥成熟胚進(jìn)行組織培養(yǎng)本實(shí)施例中，分別以品種CB037為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。組培方法步驟如下1、小麥種子的消毒處理將小麥CB037成熟種依次用70%酒精滅菌10分鐘、25%次氯酸鈉滅菌25分鐘、無菌水沖洗5次后在無菌水中浸泡15-18小時(shí)，次日用15%次氯酸鈉滅菌15分鐘、無菌水沖洗5次。2、成熟胚誘導(dǎo)成胚性愈傷組織用接種刀在消毒處理過的種子上將成熟胚刮碎，接種在下述Adi培養(yǎng)基上培養(yǎng)8天(黑暗，25°C)，誘導(dǎo)愈傷組織，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到去掉Dicamba的下述Ad0培養(yǎng)基上培養(yǎng)12天(黑暗，25°C)，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有Dicamba的Adi培養(yǎng)基上培養(yǎng)8天，得到胚性愈傷組織。3、分化培養(yǎng)得到小麥再生植株將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到下述XCFH培養(yǎng)基上培養(yǎng)20-25天(光照強(qiáng)度為3500Lx，溫度為25°C)，分化得到小麥再生植株。記錄接種成熟胚數(shù)目，統(tǒng)計(jì)分化得到的小麥再生苗數(shù)目和植株再生率。Adi培養(yǎng)基組成由終濃度為1650mg/L的NH4N03、終濃度為1900mg/L的KN03、終濃度為440mg/L的CaCl221120、終濃度為370mg/L的MgS0471120、終濃度為1700mg/L的KH2P04、終濃度為0.83mg/L的KI、終濃度為6.2mg/L的H萬、終濃度為22.3mg/L的MnS0441120、終濃度為8.6mg/L的ZnS0471120、終濃度為0.25mg/L的Na2Mo0421120、終濃度為0.025mg/L的CuS04*51120、終濃度為0.025mg/L的CoCl261120、終濃度為27.8mg/L的FeS0471120、終濃度為37.3mg/L的Na2_EDTA21120、終濃度為0.75g/L的MgCl"終濃度為15g/L的甘露醇、終濃度為15g/L的山梨醇、終濃度為2.4g/L的Phytagel(植物凝膠)、終濃度為5mg/L的谷氨酰氨、終濃度為500mg/L的水解酪蛋白、終濃度為12g/L的葡萄糖、終濃度為10mg/L的維生素Bl、終濃度為lmg/L的維生素B6、終濃度為lmg/L的煙酸、終濃度為2mg/L的甘氨酸、終濃度為39mg/L的乙酰丁香酮、終濃度為2mg/L的Dicamba、終濃度為4mg/L的AgNOy終濃度為40mg/L的半胱氨酸、終濃度為100mg/L的Vc組成；所述終濃度為各物質(zhì)在所述Adi培養(yǎng)基中的濃度；Adi培養(yǎng)基的pH值為6.0。以上成分采用12rC高壓濕熱滅菌20分鐘。AdO培養(yǎng)基除了不含有Dicamba外，其它成份和配制方式及滅菌方式與Adi培養(yǎng)基完全相同。XCFH培養(yǎng)基組成由終濃度為1650mg/L的NH4N03、終濃度為1900mg/L的KN03、終濃度為440mg/L的CaCl221120、終濃度為370mg/L的MgS0471120、終濃度為1700mg/L的KH2P04、終濃度為0.83mg/L的KI、終濃度為6.2mg/L的H萬、終濃度為22.3mg/L的MnS0441120、終濃度為8.6mg/L的ZnS0471120、終濃度為0.25mg/L的Na2Mo0421120、終濃度為0.025mg/L的CuS04*51120、終濃度為0.025mg/L的CoCl261120、終濃度為27.8mg/L的FeS04*71120、終濃度為37.3mg/L的Na2_EDTA*21120、終濃度為30g/L的蔗糖、終濃度為10mg/L的V『終濃度為lmg/L的U冬濃度為lmg/L的煙酸、終濃度為2mg/L的甘氨酸、終濃度為5mg/L的谷氨酰胺、終濃度為0.2mg/L的IAA、終濃度為2.4g/L的Phytagel組成；XCFH培養(yǎng)基的pH值為6.0。以上成分采用12rC高壓濕熱滅菌20分鐘。二、對(duì)照組Dicamba持續(xù)處理對(duì)照將成熟胚破碎組織接種在Adi培養(yǎng)基上黑暗條件下培養(yǎng)4周左右，誘導(dǎo)得到愈傷組織，然后轉(zhuǎn)移到去掉Dicamba生長素的XCFH培養(yǎng)基上，光照條件下(光照強(qiáng)度為3500Lx，溫度為25°C)分化得到小麥再生植株。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果取平均數(shù)。用本發(fā)明方法組中，小麥CB037綠苗獲得率為67.1%(圖6_B);對(duì)照組中，小麥CB037綠苗獲得率為32.4%(圖6-A)。權(quán)利要求一種小麥的組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟先將小麥胚誘導(dǎo)培養(yǎng)成胚性愈傷組織；再將所述胚性愈傷組織分化培養(yǎng)成小麥再生植株；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法包括如下步驟將所述小麥胚依次用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)I、用不含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)II、再用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)III，得到胚性愈傷組織。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述小麥胚為小麥幼胚。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述小麥幼胚為心形期小麥幼胚。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述小麥為小麥品系中8601、小麥品系HW642或小麥品種濟(jì)麥22。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述小麥胚為小麥成熟胚。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述小麥為小麥品系CB037。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)I的時(shí)間為7天_9天；所述用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)III的時(shí)間為7天-9天；所述用不含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)II的時(shí)間為6天-14天。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)I的時(shí)間為8天；所述用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)III的時(shí)間為8天；所述用不含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)II的時(shí)間為12天。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)1、所述用不含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)II和所述用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)III中，培養(yǎng)的條件為黑暗、溫度為24°C-26°C。全文摘要本發(fā)明公開了一種小麥組織培養(yǎng)的方法。該方法包括如下步驟先將小麥胚誘導(dǎo)培養(yǎng)成胚性愈傷組織；再將所述胚性愈傷組織分化培養(yǎng)成小麥再生植株；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法包括如下步驟將所述小麥胚依次用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)、用不含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)、再用含有生長素的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織。本發(fā)明方法進(jìn)一步提高了小麥幼胚和成熟胚再生頻率，減弱了基因型、生理狀態(tài)等條件對(duì)再生的障礙，為小麥細(xì)胞工程育種、基因工程育種和功能基因組學(xué)研究提供技術(shù)支撐，對(duì)于小麥生物技術(shù)育種和功能基因組學(xué)研究具有重要意義。文檔編號(hào)A01H4/00GK101703004SQ20091023736公開日2010年5月12日申請(qǐng)日期2009年11月16日優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日發(fā)明者佘茂云,別曉敏,葉興國,孫偉珊,徐惠君,李欣,杜麗璞,殷桂香,陳朵朵申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所