專利名稱：：肝組織特異性表達rtTA的載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種肝組織特異性表達rtTA的載體及其應(yīng)用，特別涉及該載體及其在創(chuàng)建肝組織特異性表達rtTA小鼠模型中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肝組織特異性表達的rtTA，能被強力霉素(Dox)所誘導(dǎo)和激活，并與Tet反應(yīng)性元件(TRE)的操縱基因序列TetO結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，實現(xiàn)外源基因肝組織特異性表達，以肝組織特異性表達rtTA的載體制備的轉(zhuǎn)基因小鼠，可與TRE效應(yīng)載體轉(zhuǎn)基因小鼠雜交獲得雙轉(zhuǎn)基因小鼠，通過強力霉素(Dox)誘導(dǎo)實現(xiàn)目的基因在小鼠肝臟特異性表達，可用于特定基因在個體發(fā)育中的功能及基因治療研究、肝炎病毒基因表達及致病機制研究、uPA人鼠嵌合肝模型及肝炎病毒感染研究等。基因的組織特異性表達在生物體的個體發(fā)育過程中起重要作用，此過程受組織特異性啟動子控制。組織特異性啟動子在外源基因的組織細胞特異性表達、基因治療等方面有重要的應(yīng)用前景。組織特異性表達可降低機體免疫反應(yīng)，并且避免對其他器官的副作用。目前已發(fā)現(xiàn)許多肝細胞特異性啟動子，如甲胎蛋白(AFP)啟動子、白蛋白(Albumin)啟動子、al-抗胰蛋白酶(al-AT)啟動子等，已被用于目的基因在肝組織特異性表達，如He等將白細胞介素-2(IL-2)構(gòu)建在AFP增強子及白蛋白啟動子驅(qū)動下，使得IL-2只在肝癌細胞系中表達(HeP，TangZY，YcSL，etal.Thetargetedexpressionofinterleukin_2inhumanhepatocellularcarcinomacells.JExpClinCancerRes，2000，19(2):183-187)。增強子等反應(yīng)元件對這些啟動子的轉(zhuǎn)錄活性也有影響，如Kramer等將白蛋白、al-AT、植物血凝素蛋白、乙肝病毒增強子II等各種肝特異性啟動子和增強子隨機串聯(lián)組合，篩選出了能在肝細胞中長期穩(wěn)定高水平表達的最佳組合(KramerMG，BarajasM，RazquinN，etal.Invitroandinvivocomparativestudyofchimericliver—specificpromoters.MolTher，2003，7(3):375-385)。血清白蛋白是由哺乳動物肝臟細胞合成的具有重要生理功能的蛋白質(zhì)，其合成受到肝臟的生長發(fā)育調(diào)控，在發(fā)育過程中合成量逐漸升高，血清白蛋白只能由分化成熟的肝臟細胞合成，其他組織細胞中的白蛋白基因處于關(guān)閉狀態(tài)(VorachetWR，St印panCM，LimaM，etal.Distantenhancersstimulatethealbuminpromoterthroughcomplexproximalbindingsites[J].JBiologicalChemistry,2000，275(37):29-31)。白蛋白基因主要在轉(zhuǎn)錄水平上受到白蛋白啟動子(Albuminpromoter)調(diào)控，白蛋白啟動子的克隆及真核表達載體構(gòu)建對于外源基因的肝組織特異性表達具有重要意義。利用血清白蛋白啟動子進行外源基因的表達具有較好的肝組織特異性，并且由于血清白蛋白在體內(nèi)含量高，啟動子在體內(nèi)較高的轉(zhuǎn)錄活性。由于白蛋白的表達水平與白蛋白啟動子活性密切相關(guān)，而肝癌細胞系中白蛋白的表達水平僅為肝臟細胞的5%10%，因此白蛋白啟動子在肝癌細胞中的轉(zhuǎn)錄活性與體內(nèi)肝臟細胞中的活性并不完全相同，在體內(nèi)該啟動子的轉(zhuǎn)錄活性可能遠高于肝癌細胞系中的活性(ClaytonDF，WeissM，DarnellJE.Liver-specificRNAmetabolisminhepatomacells-variationsintranscriptionratesandmRNAlevels[J].MolecularCellularBiology,1985，5:2633;ZaretKS，DiPersioCM，JacksonSA，etal.Conditionalenhancementofliver-specificgenetranscription[J].ProcNatlAcadSciUSA，1988，85:9076)。利用該啟動子建立肝組織特異性可調(diào)控表達的轉(zhuǎn)基因動物模型是可行的。Tet-On系統(tǒng)是比較成熟的真核生物外源基因誘導(dǎo)表達系統(tǒng)之一，它利用大腸桿菌Tnl0轉(zhuǎn)座子中四環(huán)素操縱子原理來實施調(diào)控外源基因在真核細胞中定量并特異地表達，具有高效、無毒、開/關(guān)較嚴密等特點，已被成功地應(yīng)用于細胞和轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)表達外源基因的研究。四環(huán)素操縱子(tetoperon)誘導(dǎo)表達系統(tǒng)利用細菌四環(huán)素操縱子的阻遏與去阻遏作用，實現(xiàn)外源基因在真核細胞中的表達，由于該系統(tǒng)調(diào)控元件來自原核生物，對真核細胞的基因表達不會有影響，具有高效和操作方便等優(yōu)點。Tet-0n系統(tǒng)由兩部分組成①Tet反應(yīng)性元件(tetracyclineresponsiveelement,TRE)，由7拷貝的細菌四環(huán)素耐藥操縱子的操縱基因序列(Tet0)和人類巨噬細胞的立早啟動子(PminCMV)組成；②融合的轉(zhuǎn)錄活化因子rtTA(reversetet-controlledtranscriptionalactivator)，是由細菌的四環(huán)素阻遏物TetR和人類單純皰疹病毒(HSV)的毒粒蛋白VP16轉(zhuǎn)錄激活蛋白融合而成的一個融合蛋白，能被強力霉素(Dox)所誘導(dǎo)和激活，并與Tet0結(jié)合，通過VP16發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。此系統(tǒng)既有四環(huán)素阻遏物-操縱子相互作用的特異性，又具有VP16轉(zhuǎn)錄活化因子的激活潛能，它們在體外培養(yǎng)細胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中能使目的基因的表達提高約105倍(UrlingerS，BaronU，Thellma皿M，etal.Exploringthesequencespacefortetracycline—d印endenttranscriptionalactivators:novelmutationsyieldexpandedrangeandsensitivity[J].ProNatlAcadSciUSA，2000，97:7963-7968)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種肝組織特異性表達rtTA的載體及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的肝組織特異性表達rtTA的載體，其核苷酸序列包括依次串連的小鼠血清白蛋白增強子序列、小鼠血清白蛋白啟動子序列和rtTA基因序列；所述小鼠血清白蛋白增強子的核苷酸序列為自GENBANK號(Accession.Version)為AC140220.4的5'端第104540-106528位核苷酸序列；所述小鼠血清白蛋白啟動子的核苷酸序列為自GENBANK號(Accession.Version)為AC140220.4的5'端第115631-115832位核苷酸序列;所述rtTA基因的核苷酸序列為自GENBANK號(Accession.Version)為U89930.1的5'端第774-1781位核苷酸序列。所述肝組織特異性表達rtTA的載體的出發(fā)質(zhì)粒為pTet-on質(zhì)粒。所述肝組織特異性表達rtTA的載體的核苷酸序列優(yōu)選為序列表中序列1。本發(fā)明還提供上述的肝組織特異性表達rtTA的載體在構(gòu)建肝組織特異性表達rtTA的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的應(yīng)用。所述培育肝組織特異性表達rtTA的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法，是將權(quán)利要求1-3中任意一項所述的肝組織特異性表達rtTA的載體酶切線性化后，顯微注射到小鼠受精卵內(nèi)，將注射后的小鼠受精卵移植到假孕母鼠輸卵管中，對出生的小鼠篩選是否轉(zhuǎn)入所述肝組織特異性表達rtTA的載體，篩選結(jié)果陽性的即為肝組織特異性表達rtTA的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。所述酶切線性化所用的內(nèi)切酶為Xhol。本發(fā)明利用小鼠血清白蛋白基因增強子和啟動子與Tet-On系統(tǒng)的有效結(jié)合，構(gòu)建了成功創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型的載體，該載體創(chuàng)建肝組織特異性表達rtTA的轉(zhuǎn)基因小鼠(Albumin:rtTA小鼠)模型的效率高(陽性率高)，并且其雜交一代也具有較高的陽性率，創(chuàng)建的小鼠模型均能穩(wěn)定肝組織特異性高效表達rtTA。本發(fā)明通過上述載體創(chuàng)建Albumin:rtTA小鼠模型，為進一步構(gòu)建肝組織特異可調(diào)控表達的轉(zhuǎn)基因動物模型，用于特定基因在肝組織中功能研究以及實現(xiàn)肝組織特異的基因治療奠定了堅實基礎(chǔ)。圖1為pTet-on-1ink酶切鑒定結(jié)果圖2為pTet-on-albumin酶切鑒定結(jié)果圖3為小鼠白蛋白增強子及啟動子接頭處測序鑒定結(jié)果圖4為pTRE2_EGFP酶切鑒定結(jié)果圖5為Tet-on系統(tǒng)中白蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄活性的體外鑒定結(jié)果圖6為Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因首建鼠鑒定引物設(shè)計示意圖圖7為Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因首建鼠PCR鑒定結(jié)果圖8為234號轉(zhuǎn)基因陽性鼠不同組織rtTA和GAPDHmRNART-PCR檢測圖9為232號轉(zhuǎn)基因陰性鼠不同組織rtTA和GAPDHmRNART-PCR檢測圖10為222號轉(zhuǎn)基因陽性鼠不同組織rtTA和GAPDHmRNART-PCR檢測圖11為223號轉(zhuǎn)基因陰性鼠不同組織rtTA和GAPDHmRNART-PCR檢測圖12為234號轉(zhuǎn)基因陽性鼠不同組織rtTA和GAPDH蛋白Westernblot檢測圖13為222號轉(zhuǎn)基因陽性鼠不同組織rtTA和GAPDH蛋白Westernblot檢測圖14為232號和223號轉(zhuǎn)基因陰性鼠不同組織rtTA和GAPDH蛋白Westernblot檢測具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。下述實施例中所用的實驗材料如下所示pGEM-7ZF購自Promega公司、pEGFP-Nl購自Clontech公司，Huh7細胞系購自武漢博士德生物工程有限公司，胎牛血清(FCS)購自Gibco公司，H印es、雙抗，谷氨酰胺等均購自Clontech公司。DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒購自Promega公司;RNeasyMiniKit購自Qiagen公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol試劑為Invitrogen產(chǎn)品。E.coliDH5acompetentcells禾口DNAstandardMarker購自北京t専邁H發(fā)展有限公司；QIApr印SpinMinipr印Kit禾口GelExtractionMiniKit購自Qiagen公司；T4DNApolymerase、PyrobestDNAPolymerase、T4D亂igase、TakaraRNALAPCRKit(AMV)Verl.1、DNAMarker購自Takara公司。蛋白酶抑制齊[jAprotinin、P印statinA、Leup印tin、PMSF均購自Amresco公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司和Takara公司；引物由上海生工合5成。TetRmonoclonalantibody(Cat.No.631108)購自Clontech公司；Anti-GAPDHpolyclonalantibody(Cat.No.G9545)購自Sigma公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG及HRP標記山羊抗兔IgG均購自中杉金橋公司；SuperSignalWestDuraTrialKit(Code#37071，Lot#KE132546)購自ThermoSCIENTIFIC公司。野生型C57BL/6J小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。四環(huán)素誘導(dǎo)性真核表達載體pTet-on和pTRE2質(zhì)粒購自Clontech公司。轉(zhuǎn)基因動物載體DNA顯微注射由上海模式生物有限公司完成。實施例1、肝組織特異性表達rtTA的載體pTet-on-albumin的構(gòu)建及鑒定—、肝組織特異性表達rtTA的載體pTet-on-albumin的構(gòu)建[OO36]1、pTet-on質(zhì)粒的改構(gòu)為了將小鼠血清白蛋白基因啟動子及增強子序列插入pTet-on啟動子位置，以代替pTet-on載體中的CMV啟動子，合成link以引入合適的酶切位點，依次為Spel、EcoRV、Spe工、Kpn工、Apa工、Not1、EcoRI;具體方法如下所述合成link弓l物，序列為tet_on_linkerF:5'-ctaggatatcactagtggtaccgggcccgcggccgcg-3'，tet_on_linkerR:5'_aattcgcggccgcgggcccggtaccactagtgatatc_3'，將tet-on-linkerF和tet-on-linkerR在PCR儀中95。C退火10min，獲得PCR產(chǎn)物。將上述獲得的PCR產(chǎn)物同樣用EcoRI和SpeI雙酶切，回收純化后，插入到pTet-on的EcoRI和SpeI酶切位點之間，得到重組載體，將獲得的重組載體用EcoRV/SalI雙酶切、EcoRV/BamHI雙酶切鑒定(圖1)，然后測序鑒定，結(jié)果表明linker已插入pTet-on載體中；將鑒定表明正確的含有上述PCR獲得的link序列的重組載體命名為pTet-on-link。pTet-on-link的酶切鑒定結(jié)果如圖l所示，圖1中，泳道1為分子量marker，泳道2為EcoRV/SalI雙酶切鑒定結(jié)果，泳道3為EcoRV/BamHI雙酶切鑒定結(jié)果。2、肝組織特異性表達rtTA的載體pTet-on-albumin質(zhì)粒的構(gòu)建將克隆并鑒定正確的增強子序列及啟動子序列插入改構(gòu)以后的pTet-on載體中，構(gòu)建pTet-on-albumin載體，具體方法如下所述按照分子克隆的方法提取C57BL/6J小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)肝組織基因組DNA，以此為模板PCR擴增小鼠血清白蛋白增強子序列(自GENBANK號(Accession.Version)為AC140220.4的5'端第104540-106528位核苷酸序列)，上游弓I物F5'-gccgagctcctgccggctagcttccttagcatg-3'(弓l入SacI位點)，下游弓l物R5'-gggttaaggatcccaagctggag-3'(存在BamHI位點)，PCR擴增獲得1993bp的片段，經(jīng)測序表明該片段具有自GENBANK號(Accession.Version)為AC140220.4的5'端第104540-106528位核苷酸序列，即為小鼠血清白蛋白增強子序列；將PCR獲得的片段用SacI和BamHI雙酶切，克隆至pGEM_7ZF載體SacI和BamHI酶切位點之間，得到重組載體，將該重組載體進行酶切和測序驗證，將驗證正確的含有小鼠血清白蛋白增強子序列的載體命名為p7ZF_Up_promoter。以小鼠C57BL/6J小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)基因組DNA為模板PCR擴增小鼠血清白蛋白啟動子序列(自GENBANK號(Accession.Version)為AC140220.4的5'端第115631-115832位核苷酸序列)，上游引物F5'-cgggatccacagctccagatggcaaacatac-3，(弓|入BamHI位點)，下游弓l物R5，-tttgccagaggctagtggggttg-3，，6擴增產(chǎn)物用BamHI酶切，經(jīng)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化獲得小鼠血清白蛋白啟動子。將p7ZF-up-promoter用BamHI和SmaI雙酶切，切膠回收作為載體，將純化后的小鼠血清白蛋白啟動子連接入載體中，獲得重組載體，將獲得的重組載體用BamHI酶切鑒定并測序，將酶切鑒定和測序表明正確的重組載體命名為p7ZF-up-albumin。將p7ZF-up-albumin用SacI酶切，T4DNAPolymerase消平，KpnI酶切，切膠回收2233bp的片段，將回收的片段連接入EcoRV和KpnI雙酶切后的pTet-on-link載體中，獲得重組載體，將重組載體用BamHI酶切可見5022bp、1284bp、2689bp的條帶出現(xiàn)(圖2)，與預(yù)測結(jié)果相符；對重組載體的增強子和啟動子接頭處進行測序，結(jié)果與預(yù)期相符(圖3)。將該載體進行酶切和測序鑒定，將鑒定表明正確的載體命名為pTet-on-alb咖in。pTet-on-albumin的序列中小鼠血清白蛋白增強子、小鼠血清白蛋白啟動子和rtTA基因(自GENBANK號(Accession.Version)為U89930.1的5'端第774-1781位核苷酸序列)依次串連，該pTet-on-albumin的序列見序列表中序列1。其中小鼠血清白蛋白增強子、小鼠血清白蛋白啟動子和rtTA基因分別是序列1中第115-2103位、第2109-2310位、第2370-3377位核苷酸序列。圖2中泳道1為M2KplusMarker,泳道2為pTet-on-alb咖in的BamHI酶切鑒定結(jié)果，泳道3為15KMarker。二、肝組織特異性表達rtTA的載體pTet-on-albumin的白蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄活性的體外鑒定1、pTRE2_EGFP載體的構(gòu)建及鑒定為鑒定血清白蛋白啟動子對rtTA的轉(zhuǎn)錄起始功能，我們構(gòu)建了Tet-on系統(tǒng)中表達報告基因EGFP的效應(yīng)載體pTRE2-EGFP，用于與pTet-on-albumin共轉(zhuǎn)染，通過DOX的誘導(dǎo)表達檢測血清白蛋白啟動子在此系統(tǒng)中的功能。具體方法如下所述以BamHI和NotI雙酶切pEGFP-Nl，回收720bp的EGFP基因序列，以相同的內(nèi)切酶雙酶切pTRE2載體，并將EGFP插入pTRE2載體的BamHI和NotI酶切位點之間得到重組載體，將重組載體用BamHI和NotI雙酶切鑒定和測序鑒定，將鑒定表明正確的載體命名為pTRE2-EGFP。pTRE2-EGFP的酶切鑒定結(jié)果如圖4所示，圖4中，泳道1為分子量maker,泳道2為pTRE2-EGFP的BamHI和NotI雙酶切鑒定結(jié)果。2、pTet-on-albumin的白蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄活性的體外鑒定將人肝癌細胞系Huh7培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基中(10%(v/v)胎牛血清FCS(Gibco公司)，10mmol/L羥乙基呱嗪乙硫磺酸H印es，100u/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素，2mmol/LL_谷氨酰胺)37°C，5%C02條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，將細胞分至六孔板，用不含雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，第二日按Invitrogen轉(zhuǎn)染試劑盒說明書的要求將載體質(zhì)粒pTet-on-albumin和pTRE2-EGFP分別以質(zhì)量比為1:1的比例共轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系Huh7，轉(zhuǎn)染8h后換液并加入四環(huán)素類似物Dox(lug/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)48h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達；分別以未轉(zhuǎn)染(正常對照組)及轉(zhuǎn)染但未加Dox(未誘導(dǎo)組)及pTet-on與pTRE2-EGFP共轉(zhuǎn)染的Huh7細胞作為對照。上述實驗原理加入強力霉素(Dox)誘導(dǎo)時，rtTA表現(xiàn)為活性形式，與pTRE2_EGFP中操縱基因序列Tet0結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，EGFP就會表達，可以觀察到綠色熒光；不加入Dox時，rtTA表現(xiàn)為無活性形式，不與pTRE2-EGFP中操縱基因序列TetO結(jié)合，不發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，EGFP不表達，觀察不到綠色熒光。結(jié)果如圖5所示，圖5中A顯示載體質(zhì)粒pTet-on-albumin和pTRE2-EGFP共轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系Huh7在加入Dox誘導(dǎo)時可見少量綠色熒光，表明albumin啟動子啟動rtTA轉(zhuǎn)錄因子的表達，并在Dox誘導(dǎo)下發(fā)揮調(diào)節(jié)效應(yīng)載體pTRE2-EGFP中報告基因的表達的功能；而未加Dox誘導(dǎo)的細胞(未誘導(dǎo)組)幾乎未觀察到綠色熒光蛋白表達(圖未顯示)。pTet-on與pTRE2-EGFP共轉(zhuǎn)染的細胞可見強綠色熒光蛋白表達(圖5中B)。圖5中，A為pTet-on-albumin和pTRE2_EGFP共轉(zhuǎn)染后經(jīng)Dox誘導(dǎo)后結(jié)果；B為pTet-on和pTRE2_EGFP共轉(zhuǎn)染后經(jīng)Dox誘導(dǎo)后結(jié)果。三、肝組織特異性表達rtTA的載體pTet-on-albumin的白蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄活性的活體鑒定1、Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因首建鼠制備及PCR鑒定pTet-on-albumin質(zhì)粒用Xhol酶切，瓊脂糖凝膠回收6034bp片段，進行C57XCBAFl小鼠受精卵(母本為CBA小鼠，父本為C57小鼠，均購自北京華阜生物科技股份有限公司)細胞原核DNA顯微注射，注射卵分別移植到假孕母鼠輸卵管中，轉(zhuǎn)基因小鼠出生后第2周剪取約O.5cm鼠尾，提取基因組DNA，在轉(zhuǎn)基因載體上下游各設(shè)計一對引物進行PCR鑒定，引物設(shè)計示意圖及序列如圖6所示，引物序列如下所述上游序列引物1-up-F:GTGCAGCTTGGCTTGAACTCGTTC;1-up-R:GAGTATGGTGCCTATCTAACATCTC。下游序列引物1-down-F:GACGCGCTAGACGATTTCGATCTG;1-down-R:ACCTTGCACAGATAGCGTGGTC。PCR反應(yīng)體系如下2.5ii110XBuffer(含MgCl2)，2ii1d證，0.2ii1Taq，0.5ii1(10iimol/L)引物(1-up-F和l-卯-R，或者l-down-F和1-down-R)，1.5ii1上述提取的基因組DNA，17.8illddH20。PCR反應(yīng)條件如下先5°C5min;再4。C30S，54。C30S，72。C30S，進行34個循環(huán)；最后72°C7min。PCR陽性小鼠即為Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因首建小鼠。結(jié)果表明，顯微注射出生49只小鼠于2-3周齡剪尾抽提基因組DNA，經(jīng)PCR篩選發(fā)現(xiàn)9只轉(zhuǎn)基因陽性小鼠(部分PCR鑒定結(jié)果見圖7)，耳號標記如下yc-063(早)，yc_051(早)，yc_071(早)，yc—073(早)，yc—065(早)，yc—068($)，yc_064($)，yc-056($)，yc-059($)。圖7中A為上游序列引物鑒定結(jié)果，B為下游序列引物鑒定結(jié)果。圖7中A和B中，泳道1-9為不同首建鼠，泳道10為分子量marker,泳道11為正常鼠，泳道12為陽性對照。2、Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因Fl代鼠的獲得與鑒定取步驟1獲得的9只首建鼠，培養(yǎng)至8周齡性成熟首建鼠，將其與8周齡的野生型小鼠C57BL/6J交配，2周齡仔鼠進行耳號標記，其中4只首建鼠共產(chǎn)仔8窩，yc-063和yc-065分別產(chǎn)3窩，yc-064和yc-056分別產(chǎn)1窩，3周齡時剪尾按分子克隆提取基因組DNA，PCR檢測陽性F1代小鼠，PCR體系及反應(yīng)條件同步驟1。進行陽性鼠統(tǒng)計，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示表1.Fl代轉(zhuǎn)基因陽性鼠統(tǒng)計表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、轉(zhuǎn)基因小鼠Fl代rtTA轉(zhuǎn)錄水平鑒定取不同首建小鼠所生F1代轉(zhuǎn)基因陽性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代轉(zhuǎn)基因陽性小鼠234和222)及陰性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代轉(zhuǎn)基因陰性小鼠232和223)，斷頸處死后剪取腦、胸腺、心、肺、腎、腸、脾、肝等不同組織少許(不超過30mg)，于1.5mlEP管中剪碎，總RNA提取使用RNeasyMiniKit(Qiagen，Cat.No.74106)，提取的總RNA經(jīng)Nanodrop1000分光光度儀測定濃度及純度，各種組織總RNA取400ng，使用TakaraRNALAPCRKit(AMV)Verl.l進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系為2iilMgCl2(25,1/L)，1ii110XRNAPCRBuffer,lii1d證Mixture,0.25ii1RNaseInhibitor，0.5ii1AMVReverseTranscriptase,0.5li1Random9mers，0.5ulOligodT-AdaptorPrimer,400ngRNA，用RNaseFreedH20補足至10ii1體系，反應(yīng)條件為30。C10min，42。C30min，99。C5min，5°C5min，在RT反應(yīng)結(jié)束后加入以下PCR體系3ii1MgCl2(25,1/L)，4ii110XLAPCRBuffer11,31.75illdH20，0.25iiITakaraLATaq，O.5ii1引物(10iimol/L，分別用引物對rtTA-F和rtTA-R，或者GAPDH-F和GAPDH-R進行擴增)反應(yīng)條件如下94。C2min，(94°C30S，56。C30S，72。C30S)X32，72。C10min，RT-PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。總RNA提取過程中勻漿操作使用T10basicULTRA-TURRAX勻漿機5檔勻漿40S即可(購自IKA公司)。引物序列如下rtTA-F:5—-GACGCGCTAGACGATTTCGATCTG-3—rtTA-R:5—-ACCTTGCACAGATAGCGTGGTC-3—GAPDH-F:5—-ACCACCATGGAGAAGGCTGC-3—GAPDH-R:5—-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3—Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因Fl代陽性小鼠rtTAmRNA表達鑒定結(jié)果如圖8-圖11所示，結(jié)果表明234號陽性小鼠rtTAmRNA在肝組織特異性表達，222號陽性小鼠除在肝組織表達外，在肺和腎也有少量表達，232號和223號陰性小鼠各種組織均不表達。圖8-圖11中左圖均為轉(zhuǎn)基因鼠不同組織rtTART-PCR檢測，右圖均為轉(zhuǎn)基因鼠不同組織GAPDHmRNART-PCR檢測。圖8-圖11中左圖的PC表示瞬時轉(zhuǎn)染pTet-on質(zhì)粒48h后Huh7細胞提取總RNART-PCR結(jié)果。4、Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因陽性鼠Fl代rtTA蛋白表達鑒定Fl代轉(zhuǎn)基因陽性小鼠(yc-063及yC_065所生Fl代轉(zhuǎn)基因陽性鼠234和222)及陰性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代轉(zhuǎn)基因陰性鼠232和223)不同組織總蛋白的提取，使用以下配方的組織蛋白裂解液10mM1MTris-HCl，l%(V/V)TritonX-lOO，1%(V/V)去氧膽酸鈉，O.1%(V/V)10%(g/ml)SDS，0.4%(V/V)NP_40，150mMNaCl，5mMEDTA，0.2mM原釩酸鈉，蒸餾水定容。提取前分別在組織蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制劑Aprotinin、P印statinA、Leup印tin、PMSF，使其終濃度分另U為2ug/ml，0.7ug/ml，0.5ug/ml，lmM。組織蛋白提取的具體方法為取不超過30mg各種組織，加入上述組織蛋白裂解液及4種蛋白酶抑制劑，TIObasicULTRA-TURRAX分散機5檔勻槳40S后，冰浴30min，每5min振勻1次，13000rpm4。C離心15min，上清即為總蛋白溶液?？偟鞍锥渴褂肂radford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司，P0006)，各取50yg總蛋白溶液，加入5XSDS上樣緩沖液及1/20體積|3-巰基乙醇，煮沸10min，10000rpm離心5min，上清用于rtTA蛋白的Western檢測，其余置于_80°〇保存。rtTA蛋白檢測一抗使用TetRmonoclonalantibody(Clontech，Cat.No.631108)，稀釋度1:1000，GAPDH蛋白一抗使用Anti-GAPDHpolyclonalantibody(Sigma，Cat.No.G9545)，二抗分別使用HRP標記山羊抗小鼠IgG及HRP標記山羊抗兔IgG(中杉金橋公司，Lot.No.80259)，稀釋度1:5000，顯影液使用SuperSignalWestDuraTrialKit(ThermoSCIENTIFIC,Code#37071，Lot#KE132546)。Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因Fl代陽性鼠rtTA蛋白表達鑒定結(jié)果如圖12-圖14所示，結(jié)果表明，234號和222號陽性鼠rtTA蛋白在肝組織特異性表達，而232號和223號陰性鼠則在各組織均不表達。圖12-13中左圖分別為轉(zhuǎn)基因陽性鼠234和222不同組織rtTAWesternblot檢測結(jié)果，右圖均為左圖中相應(yīng)組織GAPDH蛋白Westernblot檢測結(jié)果。圖14為轉(zhuǎn)基因陰性鼠232(左圖)和223(右圖)不同組織rtTAWesternblot檢測結(jié)果，圖12-14中PC均表示瞬時轉(zhuǎn)染pTet-on質(zhì)粒48h后Huh7細胞提取總蛋白Westernblot結(jié)果。取已鑒定rtTA蛋白在肝組織特異性表達的同窩Fl代轉(zhuǎn)基因陽性鼠雌雄自交，所生F2代轉(zhuǎn)基因陽性小鼠用于保種繁育。序列表〈160>1〈210>1〈211>8987〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉1ctcgaggagcttggcccattgcatecgttgtetccatetcateatetgtecatttetett60ggctcatgtccaacatteccgccatgttgacattgattettgacteggatatcactegct120tccttegcatgacgttccacttttttcteaggtggagcttacttctttgatttgatcttt180tgtgaaacttcccatcttccteagcttctgcttctctcagttttctgctt240gctcattccacttttccagctgaccctgccccctecc皿cattgctccac300tcatccagagcteagttttetegttgtttggatcgcateggtegcte朋g360aggtggcgacCC3C3C3tCCtteggcatgagcttgattttttttgatttegaaccttccc420ctctctgttcctegactecactecacattctgc皿gcategC3C3g3gC3atgttctect■tteattectttcattttcttgtetcctcac3gcctega皿ateacctgcgttecagcatc540cactcagtetcccttgagcatg郷tg織ctectteacategggacgagatggtecttt600gtgtctcctgctctgtcagcacttgctgat3CC3ggg皿tgtttgttctt660attccggacgtgtttgccttggccagttttccatgtecat720gtttggactgatc^tecagtcctctgcctagg皿皿ggccaacttgtct780acgtttegtetgtggctgteg腿gggtet3tg3朋tggC840agtcttecacatttttggcagcttettteaagtcttggtgtteagtecgctggagctgtc■acagcteccatctggg皿tgagtecacggggaccateagttectgacatt960cgtttcccattccatttgaatecacacttttgtcatggtettgcttgctgaaattgtttt1020gc皿皿皿皿ccccttcaaattetttteatteatttetct1080caatgtteteteggtecttetetecccaat1140aatcatttttaaacatttgtttettgagcttettetggatgaatctetctctetetectc1200tetetectct皿皿皿g皿g皿3g3ccategacaatcatctetttgatetgtgte朋gtt1260tecatgtgagatgctccatttctcactgteateccatttetegttecttg1320tggaattcteggactte皿tatttteagttttegctgggtgactggttgg1380gteagtectga朋gtttteg1440^gtgatcatteccctcteaCC3朋gttg3gctecag朋31500tttcaacateagctgteac3atgteatttgttgtctettttcttttgaga1560tecagttttttctgtctegctttggctgtcctggaccttgctctgtegaccaggttggtc1620ttgaactcagagatctgcttgcctctgccttgc皿gtgct3ggatte皿3gcatgtgcra1680ccactgcctggctecaatctatgtttteteagagattete皿gctctggctttgtgacat1740teatctttcagateateagtcttttggattgtgtctggag皿catec3g3ctgtgagrag1800atgttcagaggtetetttgctteggggtgaattc朋tctgcagc^teattetgagc3ga1860attectgacacttccattttatecgttctecttgctgatctetg朋3cat3gate3gcat1920gcaggcattcatcategttttctttetctgg皿3朋catt3皿tetg皿3g皿gcacttt1980atteatecagtttegatgtgttttgccatctttteatttctteag朋atecteagctgat2040gC3g3gtg皿gagtgtgtgaaaagcagtggtgcagcttggcttgaactcgttctccagct2100tgggatccacagctccagatggc皿3C3tecgc皿gggatttegtcaaacaactttttgg2160atgattttgt朋tggggtegg皿cc皿tga皿tgcgaggt皿gtetggtt2220aatgatctecagttettggtte皿g朋gtetettegagcgagtctttctgc3C3C3gatc2280acctttcctetc皿ccccactagcctctggaatcccgcggccatggcggccgggagcatg2340cgacgtcgggcccgcggccgcgaattcatetgtctagatta^gtgatte2400acagcgcattagagctgctt朋tg郷tcgg皿tcg皿ggttteacaacccgteaactcg2460cccagaagcttggtgt卿gcagcctacactgtettggca皿gcgggctt2520tgctcgacgccttegccattg卿tgttegtectcacttttgccctttea2580朋gggg咖gctggc朋gattttttecgcaateacgcteatgtgctttac2640teagtcatcgC朋tgg3gC3朋agtecattcagateracggcctecag皿皿3cagtetg2700aaactctcgaaaatcttagcctttttetgcc皿c皿ggtttttcactegag朋cgcgt2760tetetgcactcagcgctgtggggcattttecttteggttgcgtettgg皿gatengage2820atcaagtcgc3ggg3朋C3Cctectactgategtatgccgccattettec2880gac朋gctetcgaattatttgatcacc^ggtgcagagccagccttcttattcggccttg2940aattgatcatatgcggatte皿gtgggtccgcgtacagcc3000gcgcgcgtectacgggtcteccatcgagggcctgctcgatctcccggacg3060acgacgcccccga卿ggcggggctggcggctccgcgcctgtcctttctccccgcgggac31203C3CgCgC3gactgtcgacggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccact3180tegacggcgaggacgtggcgatggcgratgccgacgcgctagacgatttcgatctggaca3240tgttggggg3cggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctecg3300gcgctctggatatggccgacttcgagtttgteccgatgcccttggaattg3360acgagtecggtgggtegggggcgcg郷atteagatecattgatgagttt3420gg3C3朋CC3gcagtg皿皿aaatgctttetttgtgaaatttgtgatgct3480attgctttetttgteaccattateagctgccaattgeatt3540cattttetgtttcaggttcaggggg郷tgtgggaggtttgteaaacctc3600teca朋tgtggtetggctgattetgatcctgcaagcctcgtcgtctggccggaccacgct3660atctgtgcaaggtccccggacgcgcgctcccgcccgccgccgaggc皿ga3720ctcgggcggcgccctgcccgtcccaccaggtc皿caggcggteaccggcctettcategg3780gaatgcgcgcgaccttcagcatcgccggcatgtcccctggcggacggg朋gtetcagctc3840gaccaagcttggcg卿ttttcaggagcteagg皿gctea3900gatataccaccgttgatetetcccaatggcatcgte皿g3acattttgaggcatttcagt3960cagttgctcaatgtecctet朋CC3g3CCgttcagctgcatteatgaatcggcc皿cgcg4020cgggg卿ggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgc4080gctcggtcgttcggctgcggcgagcggtetcagctcactca皿ggcggteateeggttat4140ccacagaatcgC3gg朋3g3皿皿ggCC3gc皿朋ggcca4200gg朋ccgtea朋aggccgcgttgctggcgtttttccateggctccgcccccctgacgagc4260tcgacgctca賜tc卿ggtggcg朋acccgacaggactete皿gatecc4320aggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgctteccg4380gatecctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgte4440ggtetctcagttcggtgteggtcgttcgctcc皿gctgggctgtgtgcacgaaccccccg4500ttcagcccgaccgctgcgccttetccggteactetcgtcttgagtccaacceggteagae4560acgacttatcgccactggcagcagccactggteacaggattegcagagcg郷tetgteg4620gcggtgctecagagttcttg朋gtggtggccteactecggctecactega3gg3cagtet468012ttggtetctgcgctctgctg朋gccagtteccttcggaaaa卿gttggtagctcttgat4740CCggC3朋C3aaccaccgctggtegcggtggtttttttgtttgc皿gcagcagattecgc4800gcag皿朋皿3ggatctc皿gaagatcctttgatcttttctecggggtctgacgctcagt4860gg皿cg朋皿ctcacgtteagggattttggtcatgagattatcttcacct4920agatcctttttgaagttttegagte皿ctt4980ggtctg織gtteccaatgctteatcagtgaggcacctetctcagcgatctgtctetttc5040gttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtegateactecgatecggg郷gcttec5100catctggccccagtgctgcaatgateccgcg3g3CCC3Cgctcaccggctccagatttet5160cagc皿te皿ccagccagccgg皿gggccg3gCgC3g皿gtggtcctgcaactttetccg5220cctccatccagtctetteattgttgccggg皿gctegagt皿gtegttcgccagtteate5280gtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggta5340tggcttcattcagctccggttcccaacgatc皿ggcgagttecatgatcccccatgttgt5400gc皿皿朋gcggttegctccttcggtcctccgatcgttgtcag朋gteagttggccgcag5460tgttetcactcatggttetggcagcactgcateattctcttectgtcatgccatccgtea5520gatgcttttctgtgactggtgagtectc皿ccaagtcattctgag皿tegtgtetgcggc5580g紅gagttgctcttgcccggcgtcaatecgggateateccgcgccacat5640catcattggaaaacgttcttcggggcg腿actctcaaggatctteccgc5700tgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatctttta5760ctttcaccagcgtttctgggC3gg朋ggC33皿tgCCgC3a皿朋ggg朋5820t朋gggcgactgaatectcatectcttcctttttcaatettettg皿gca5880tttetcagggttettgtctcacatetttgaatgtattteg5940咖teggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcteag皿3ccatte6000ttatcatgacatteacctet朋a皿teggcgtetcacgaggccctttcgtcttcactcga6060ggtcg郷gatccagacatgateagatecattgatgagtttgg3C皿3CCac皿cteg朋6120aaaatgcttttttgtgatgctettgctttatttgteacca6180ttateagctggtteac皿c3acaattgcattcattttetgtttcaggttc6240gtggg郷tttttteaagca3gte朋acctctecaaatgtggtetggctg6300attetgatctctegtc皿ggcactetacatcaaatattccttetteacccctttacaaat6360朋ggtecac3atttttgagc3tegc3gac3ctctatgcct6420gtgtgg賜tegtetgttetgattetaactgttetgcctec6480tecag皿tetttttccateattttcttgtetegcagtgc3gctttttcctttgtggtgte6540皿tegc朋agc皿gc朋gagttctettect6600ttctg皿ggaaagtccttggggtcttctecctttctcttcttttttggaggagt卿atg6660gcagtegcctcatcatcacttcttctgagc6720ttcctcatteaaggcattccaccactgctcccattcatcagttccataggttggaatcte6780tcagtegtttattttetett6840teccttegagcttteaatctctgteggtegtttgtccaattetgtcacaccac3g皿gte6900aggttccttcggg3CC皿3gcggccatcgtgcctccccactcctgcagtt6960cgggggratggatgcgcggatagccgctgctggtttcctggatgccgacggatttgcact7020gccggtegaactccgcgaggtcgtccagcctC3ggC3gC3gctg皿cc皿etcgegaggg7080gategageccggggtgggcg朋g皿ctccagcatgagatccccgcgctggaggatcatcc7140agccggcgtcccgg朋朋cgattccgaagcccaacctttcateg皿ggcggcggtggaat7200cgaaatctcgtgatggcaggttgggcgtcgcttggtcggtcatttcgaaccccagagtcc7260cgctcag朋gaactegtcaag皿ggcgateg皿ggcgatgcgctgcgaatCgggElgCggC7320gatecegtea3gC3Cg3gg33gCggtC3gCccattcgccgccaagctcttcagcaatetc7380aegggtegeeaacgetatgtectgatageggtccgccacacccagccggccacagtcgat7440g朋tccag朋朋gcggccattttccaccatgatettcggc皿gC3ggC3tcgccatgggt7500C3Cg3Cg3g3tcctcgccgtegggcatgegcgccttgagcctggcg皿cagttcggctgg7560cgcgagcccctgatgetettcgtccagatcatcctgatcg3C皿g3CCggcttccatccg7620agtecgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcg皿tgggc郷tegceggate7680朋gcgtetgcagccgccgcattgeatcagecatgatggatactttcteggC3gg3gC朋g7740gtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaat3gC3gCC3gtcccttcccgc7800ttcagtgaca3CgtCg3gC3cagctgcgcaagg皿cgcccgtcgtggccagecacgateg7860ccgcgctgcctcgtcctgcagttcattcagggcaccggacaggteggtet7920aaccgggcgcccctgcgctg3C3gCCgg皿C3CggCggC3tC3g3gC3gCcgattgtctg7980ttgtgcccagteatagcegaategcctctccacccaagcggccggag皿cctgcgtgcaa8040tccatcttgtteaatcatgeg^acgatcctcatcctgtctcttgatcagatcttgatcc8100cctgcgccatcagatccttggcggc朋g皿agccatccagtttectttgcagggcttccc8160aacctteccagagggcgccccagctggc皿ttccggttcgcttgctgtccat朋朋ccgc8220ccagtctagctatcgecatgtaagcccactgcaagctecctgctttctctttgcgcttgc8280gttttcccttgtccagategcccagtagctgacattcatceggggtcageaccgtttctg8340eggactggetttctecgtgttccgcttcctttegcagcccttgcgccctgagtgcttgcg8400gcagcgtgttgctegctttttgc皿朋gccteggcctccaa皿朋gcctcctcactectt8460ctgg朋tegcteagaggecgaggcggcctcggcctctgca3朋ttegtca8520gecatggggegg卿Eltgggcgg雄tgggeggagtteggggCgggEltgggcggagtteg8580gggCggg3Ctatggttgctgacteattgagatgeatgetttgcatecttctgcctgctgg8640ggElgCCtggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgeatgetttgeatect8700tctgcctgctggggElgCCtggggactttcc3cacccteactgacacacattccacagctg8760cctcgcgcgtttcggtgatgcctctgacacatgcagctcccgg卿cggt8820cacagcttgtctgteagcgg3tgCCggg3gC3g3C皿gCCcgtcagggcgcgtcagcggg8880tgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagegategeggagtgtetec8940tggctteactatgeggcategtectgagagtgcacra89871權(quán)利要求肝組織特異性表達rtTA的載體，其核苷酸序列包括依次串連的小鼠血清白蛋白增強子序列、小鼠血清白蛋白啟動子序列和rtTA基因序列；所述小鼠血清白蛋白增強子的核苷酸序列為自GENBANK號為AC140220.4的5′端第104540-106528位核苷酸序列；所述小鼠血清白蛋白啟動子的核苷酸序列為自GENBANK號為AC140220.4的5′端第115631-115832位核苷酸序列；所述rtTA基因的核苷酸序列為自GENBANK號為U89930.1的5′端第774-1781位核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于所述肝組織特異性表達rtTA的載體的出發(fā)質(zhì)粒為pTet-on質(zhì)粒。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述肝組織特異性表達rtTA的載體的核苷酸序列為序列表中序列1。4.權(quán)利要求1-3中任意一項所述的肝組織特異性表達rtTA的載體在構(gòu)建肝組織特異性表達rtTA的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述培育肝組織特異性表達rtTA的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法，是將權(quán)利要求l-3中任意一項所述的肝組織特異性表達rtTA的載體酶切線性化后，顯微注射到小鼠受精卵內(nèi)，將注射后的小鼠受精卵移植到假孕母鼠輸卵管中，對出生的小鼠篩選是否轉(zhuǎn)入所述肝組織特異性表達rtTA的載體，篩選結(jié)果陽性的即為肝組織特異性表達rtTA的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述酶切線性化所用的內(nèi)切酶為Xhol。全文摘要本發(fā)明公開了一種肝組織特異性表達rtTA的載體及其應(yīng)用。該載體，其核苷酸序列包括包括依次串連的小鼠血清白蛋白增強子、小鼠血清白蛋白啟動子和rtTA基因。該載體創(chuàng)建肝組織特異性表達rtTA的轉(zhuǎn)基因小鼠(AlbuminrtTA小鼠)模型的效率高(陽性率高)，并且其雜交一代也具有較高的陽性率，創(chuàng)建的小鼠模型均能穩(wěn)定肝組織特異性高效表達rtTA。本發(fā)明通過上述載體創(chuàng)建AlbuminrtTA小鼠模型，為進一步構(gòu)建肝組織特異可調(diào)控表達的轉(zhuǎn)基因動物模型，用于特定基因在肝組織中功能研究以及實現(xiàn)肝組織特異的基因治療奠定了堅實基礎(chǔ)。文檔編號A01K67/027GK101717787SQ20091023741公開日2010年6月2日申請日期2009年11月6日優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日發(fā)明者周小軍,周育森,孫世惠申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所