專利名稱：一種啟動(dòng)子BgIosP566、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子，特別是一種單子葉植物例如水稻的啟動(dòng)子，以及所述 啟動(dòng)子的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游，是RNA聚合酶 識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正 確結(jié)合，活化RNA聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表 達(dá)的程度。在轉(zhuǎn)基因植物中，啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，選擇高效 率的啟動(dòng)子是高效率表達(dá)外源基因的關(guān)鍵。
根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟 動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所謂組成型啟動(dòng)子是指在組成型啟動(dòng)子調(diào)控下，不同組織器官 和發(fā)育階段的基因表達(dá)沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動(dòng)子。雙子葉植物中最常使 用的組成型啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子。另一種高效的組成型啟動(dòng)子 CsVMV是從木薯葉脈花葉病毒(cassava vein mosaic virus)中分離的。
人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動(dòng)子。例如肌動(dòng)蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的啟動(dòng)子已被克隆。用這些啟動(dòng)子代替CaMV 35S啟動(dòng)子，可以更有 效地在單子葉植物中驅(qū)動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶β亞基 基因和植物光敏色素基因中克隆了相應(yīng)啟動(dòng)子，用其代替CaMV 35S啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因 煙草中也取得了很好的表達(dá)效果(Plantbiotechnology，2002, 19(1) I9-26)。
單子葉植物基因中常見的啟動(dòng)子有Ubi啟動(dòng)子(Plant ubiquitin promoter) > Actin 啟動(dòng)子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-I 啟動(dòng)子(Maize alcohol dehydrogenase 1 promoter)。
Ubi啟動(dòng)子以其啟動(dòng)效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞。 目前，已經(jīng)從很多泛素基因中分離得到啟動(dòng)子序列，包括玉米基因組中的Ubi-I啟動(dòng) 子、水稻泛素RUBQ2啟動(dòng)子、擬南芥泛素啟動(dòng)子、向日葵泛素UbBl啟動(dòng)子、煙草泛素 Ubi.U4啟動(dòng)子、馬鈴薯泛素Ubi7啟動(dòng)子、番茄泛素Ubil-I啟動(dòng)子，大麥泛素Mubl啟動(dòng) 子。玉米泛素Ubi-I啟動(dòng)子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻 泛素RUBQ2啟動(dòng)子在水稻和甘蔗中也有較多的應(yīng)用。
Actin啟動(dòng)子1990年由康奈爾大學(xué)的McElroy等首次在水稻中發(fā)現(xiàn)，屬于強(qiáng)組成 型啟動(dòng)子。Actin啟動(dòng)子在單子葉禾本科中作用顯著，但是鄰近科屬的植物中的基因調(diào)控 功能卻十分不理想。因此，許多相關(guān)研究通過其他單子葉植物尋找Actin啟動(dòng)子，并成功 在香蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。Actin啟動(dòng)子由于對基因表達(dá)的強(qiáng)調(diào)控作用， 在單子葉植物優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因中已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用。
Adh-I啟動(dòng)子調(diào)控ADH(alcohol dehydrogena se)基因，對植物在缺氧環(huán)境下乙醇脫氫酶的表達(dá)至關(guān)重要。Adh-I啟動(dòng)子對單子葉植物特別是谷類植物如水稻、燕麥和大麥，和少部分雙子葉植物如煙草，基因的調(diào)控功能比CaMV(花椰菜花葉病毒CaMV) 35S 啟動(dòng)子提高10-50倍。Adh-I啟動(dòng)子主要應(yīng)用于單子葉植物，對絕大部分雙子葉植物基 因表達(dá)的調(diào)控效果都很有限。
單子葉植物是被子植物的主要類群，單子葉植物中的禾本科、百合科、棕櫚科 和天南星等，是非常重要的農(nóng)業(yè)作物。單子葉植物基因的強(qiáng)效啟動(dòng)子，能夠調(diào)控植物高 效率表達(dá)具有特殊性狀的外源基因，對優(yōu)良作物的分子育種研究意義重大。
在強(qiáng)效啟動(dòng)子相關(guān)研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了許多單子葉植物的啟動(dòng)子。此外， 雙子葉植物中的一些強(qiáng)效啟動(dòng)子如CsVMV(Cassava Vdn MosaicVirus)啟動(dòng)子、番茄E8啟 動(dòng)子、白藜蘆醇合酶基因Vstl啟動(dòng)子等高效啟動(dòng)子，在單子葉植物中也有很強(qiáng)的基因調(diào) 控作用。
盡管已經(jīng)有上述已知的單子葉植物的啟動(dòng)子，本發(fā)明人通過對水稻基因組的深 入研究，提供了一種新的單子葉植物啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子能夠用于調(diào)控單子葉植物中目 的基因表達(dá)，同時(shí)為研究單子葉植物中目的基因表達(dá)提供了一種新的工具和選擇。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種具有SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的單子葉 植物啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，所述啟動(dòng)子的具體堿基序列長度為四06個(gè)堿基，如SEQ ID NO 1所示
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在本發(fā)明中，將SEQ ID NO: 1所示的啟動(dòng)子序列稱為啟動(dòng)子BgIosP566，或簡 稱為P566啟動(dòng)子。
該啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，帶有該啟動(dòng)子和GUS的水稻愈傷組織經(jīng)GUS染色實(shí) 驗(yàn)后，所述水稻愈傷組織變?yōu)樗{(lán)色。
本發(fā)明的又一方面，涉及具有與SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列互補(bǔ)的序列的啟動(dòng)子。
本發(fā)明的又一方面，還涉及SEQ ID NO: 1所示單子葉植物啟動(dòng)子的具有啟動(dòng)子 功能的選自如下的變體
1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，
2)對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添 加修飾的核苷酸序列，和
3)與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序 列。
典型地，“雜交條件”根據(jù)測量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來分類。嚴(yán) 緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán) 緊性”典型地發(fā)生在約Tm_5°C (低于探針Tm 5°C )； “高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約 5-100C ； “中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20°C ； “低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以 下約20-25°C。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/ 或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6XSSC=極低嚴(yán)緊性；3XSSC=低至中等嚴(yán) 緊性；IXSSC=中等嚴(yán)緊性；0.5XSSC =高等嚴(yán)緊性。從功能上說，可以采用最大嚴(yán) 緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確 定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。
對于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對嚴(yán)緊的條件來形成雜交體，例 如，選擇相對低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等Mambrook，J.等(1989)分子克 隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，Cold Spring Harbor R~ess，Plainview, N.Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。
為便于說明，用于檢測本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán) 緊條件包括用5XSSC、0.5% SDS、l.OmM EDTA(pH8.0)溶液預(yù)洗；在50-65°C下在 5XSSC中雜交過夜；隨后用含0.1% SDS的2X、0.5X和0.2XSSC在65°C下各洗滌兩 次20分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含 鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述 條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。
在本發(fā)明中，所述在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列雜交的 核苷酸序列，其具有與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。
在本發(fā)明中，所述對SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的 取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5’端和/或 3’端，和/或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過2-45個(gè)，或者不超過2-30個(gè)，或者不超過3-20 個(gè)，或者不超過4-15個(gè)，或者不超過5-10個(gè)，或者不超過6-8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù) 表示的堿基的取代、缺失、添加修飾。
在本發(fā)明中，所述對SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列進(jìn)行如上述一個(gè)或多個(gè)堿 基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列相同或 相似的啟動(dòng)子活性。
通過一種多核苷酸進(jìn)行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQ ID NO 1的 參考核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ ID NO: 1的參考核苷酸序列之 每100個(gè)核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)5個(gè)核苷酸的不同外，該多 核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序 列至少95%相同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替 代；或可將一些核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列之總核苷酸的5%;或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序 列之總核苷酸的5%。參考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5或3末端位置， 或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè) 或多個(gè)鄰近的組存在于參考序列中。
在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如BLAST 和 BLAST 2.0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl.Acid.Res.25 3389-3402 和 Altschul等(1990) J.Mol.Biol.215 403-410。采用例如文獻(xiàn)中所述或者默認(rèn)參數(shù)，BLAST 和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟 件可以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。
在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同 一性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO: 1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采 用本文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含 有至少 90%序列同一性、優(yōu)選至少 91%、92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 或99%或更高的序列同一性的那些序列。
在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同 一性的核苷酸序列具有與SEQIDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。
本發(fā)明中，所述的啟動(dòng)子來源于單子葉植物，具體的，所述單子葉植物為水 禾酉，例如所述水禾酉為日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Nipponbare)。
本發(fā)明的又一方面，還涉及一種含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子的重組載 體。所述重組載體可以通過將上述啟動(dòng)子插入到克隆載體或表達(dá)載體而得到。
適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pUC18、 pUC19、pUC118、pUC119、pMD19_T、pMD20_T、pMD18_T Simple Vecter、pMD19_T Simple Vecter 等。
適于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達(dá)載體包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、 pGEM 等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組載體為p8+P566重組載體。
本發(fā)明的又一方面，還涉及含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子的所述重組載體 的重組細(xì)胞。所述重組細(xì)胞可以通過將含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子的所述重組載 體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞而得到。
適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞包括但不限于，例如根癌農(nóng)桿菌細(xì) 胞 LBA4404、EHA105、GV3101 等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞為重組根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105-P566。
本發(fā)明的又一方面，還涉及一種單子葉植物愈傷組織，所述愈傷組織轉(zhuǎn)化有本 發(fā)明所述的啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物為水稻。所述水稻包 括但不限于，日本晴、中花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號、云稻2號、汕 優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu) 527、川農(nóng)1號、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖 稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101等(上述水稻品種均可購自安徽徽商農(nóng)家福有限 公司)。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，所述水稻為日本晴。
本發(fā)明的又一方面，還涉及一種制備本發(fā)明所述啟動(dòng)子的方法，包括如下步 驟
1)根據(jù)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對，
2)以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用步驟1)中所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物對 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，可以根據(jù)待擴(kuò)增的目的核苷酸序列按照堿基互補(bǔ)原則設(shè) 計(jì)相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物對。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述PCR擴(kuò)增引物對如SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示。
本發(fā)明的又一方面，還涉及一種調(diào)控單子葉植物中目的基因表達(dá)的方法，所述 方法包括用本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化單子葉植物的愈傷組織的步驟。在本發(fā)明 的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化利用了含有本發(fā)明所述單子葉植物 啟動(dòng)子的重組細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述單子葉植物的愈傷組織為水 稻愈傷組織，具體地，所述水稻為日本晴。
在本發(fā)明中，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因插入到植物基因組中，包括 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。本 領(lǐng)域周知，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其 它轉(zhuǎn)化技術(shù)也可用于本發(fā)明所述單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化。當(dāng)然，適于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化單子 葉植物的另一種方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎 開發(fā)。另外，還可以采用的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化?；蜣D(zhuǎn)化后，采用 通用的方法來篩選和再生整合有表達(dá)單元的植株。
本發(fā)明中，可利用所述單子葉植物啟動(dòng)子調(diào)控目的基因表達(dá)的所述單子葉植物 包括但不限于，例如水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等。
本發(fā)明的又一方面，還涉及本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子在單子葉植物中調(diào)控 目的基因表達(dá)的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用本發(fā)明所述啟動(dòng)子調(diào)控的目的 基因是GUS。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物為水稻，具體的所述水稻為 日本晴。
為實(shí)現(xiàn)上述調(diào)控目的基因表達(dá)的目的，本發(fā)明所述啟動(dòng)子可以以單拷貝和/或 多拷貝的形式應(yīng)用，也可以與現(xiàn)有技術(shù)中已知的啟動(dòng)子聯(lián)用。
本發(fā)明的又一方面，涉及本發(fā)明所述啟動(dòng)子在水稻育種中的用途。所述水稻 為日本晴、中花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號、云稻2號、汕優(yōu)63、汕優(yōu) 608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1 號、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖 稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻 205、皖稻207，以及津原101。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述水稻為日本晴。
本發(fā)明的啟動(dòng)子可成為一種新的啟動(dòng)子作為單子葉植物、尤其是水稻轉(zhuǎn)基因的 工具啟動(dòng)子，為開展低表達(dá)基因轉(zhuǎn)化苗篩選、植物花器官敗育等分子育種研究提供便 利，從而極大的縮短優(yōu)良品種的選育時(shí)間。本發(fā)明的啟動(dòng)子可廣泛用于培育水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等單子葉植物。
發(fā)明的有益效果
為了尋找新的單子葉植物啟動(dòng)子，用于調(diào)控單子葉植物目的基因表達(dá)，同時(shí)為 研究單子葉植物基因表達(dá)提供新的工具和選擇，本發(fā)明人通過生物信息學(xué)研究獲得，并 采用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了所述啟動(dòng)子BgIosP566的功能。具體地，所述啟動(dòng)子能夠在水稻 中調(diào)控GUS基因表達(dá)。


圖1是啟動(dòng)子BgIosP566的PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果，其中，泳道1 Ikb DNA LadderMarker,泳道 2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道 3 IOObp DNA Ladder Marker,其左側(cè)的數(shù) 字2000和3000表示所指向的Ladder Marker的條帶的大小，單位都是bp。
圖2是用于構(gòu)建p8質(zhì)粒的pCAMBIA-1301質(zhì)粒示意圖。
圖3是p8質(zhì)粒示意圖中多克隆位點(diǎn)和GUS序列部分的示意圖。
圖4是p8質(zhì)粒示意圖。
圖5是經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的GUS染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述啟動(dòng) 子P566序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8+P566轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(左)經(jīng)GUS染色后呈現(xiàn)藍(lán) 色；不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8質(zhì)粒的水稻愈傷組織(對照，右)經(jīng) GUS染色后顏色未發(fā)生變化。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將 會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注 明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明 書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1P566啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增和pMD18_T+P566重組載體的構(gòu)建
PCR 擴(kuò)增
使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑 盒，目錄號DP320-02)提取水稻日本晴種子(2009年12月18日保藏于湖北省武漢 市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為 CCTCC NO P200910)的基因組DNA，根據(jù)該啟動(dòng)子在水稻日本晴gDNA中的序列，分 別在首尾設(shè)計(jì)一對PCR特異性擴(kuò)增引物(上游引物F1，加限制性酶切位點(diǎn)Kpn I和保護(hù) 堿基，下游引物R1，加限制性酶切位點(diǎn)SbfI和保護(hù)堿基)。以上述提取的水稻日本晴的 gDNA為模板，高保真:Ex Taq (TaKaRa，DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如表1所示。
表1基因啟動(dòng)子擴(kuò)增的PCR體系
權(quán)利要求
1.一種具有SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的核苷酸序列的啟動(dòng)子，或其 具有啟動(dòng)子功能的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQID NO: 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對SEQID NO: 1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修 飾的核苷酸序列，和3)與SEQID NO: 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。
2.—種重組載體，其特征在于，所述重組載體含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，優(yōu)選 地，所述重組載體為p8+P566重組載體。
3.一種含有權(quán)利要求2所述重組載體的重組細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3所述的重組細(xì)胞，其為重組農(nóng)桿菌EHA105-P566。
5.—種單子葉植物愈傷組織，其特征在于，所述愈傷組織轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求1所述的啟 動(dòng)子，優(yōu)選地，所述愈傷組織為水稻愈傷組織，更優(yōu)選地，所述水稻為日本晴、中花9、 中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號、云稻2號、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu) 88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號、雜0152、皖稻 88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖 稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及 津原101，特別優(yōu)選地，所述水稻為日本晴。
6.一種制備權(quán)利要求1中所述的啟動(dòng)子的方法，包括如下步驟1)根據(jù)SEQID NO: 1所示的核苷酸序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對，具體地，所述 PCR 擴(kuò)增引物對為 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 ；2)以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用步驟1)中所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物對進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。
7.—種調(diào)控單子葉植物中基因表達(dá)的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)化單子葉植物的愈傷組織的步驟，優(yōu)選地，所述愈傷組織為水稻愈傷組織，特別優(yōu)選 地，所述水稻為日本晴。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化過程中利用了權(quán) 利要求4所述的重組農(nóng)桿菌EHA105-P566。
9.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子在調(diào)控單子葉植物中目的基因表達(dá)的用途，其中所述目的 基因?yàn)镚US，所述單子葉植物為水稻，優(yōu)選地，所述水稻為日本晴。
10.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子在水稻育種中的用途，優(yōu)選地，所述水稻為日本晴、中 花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號、云稻2號、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22， 黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號、雜0152、皖 稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、 皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以 及津原101，特別優(yōu)選地，所述水稻為日本晴。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種啟動(dòng)子BgIosP566、其制備方法及用途。本發(fā)明所述啟動(dòng)子具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其具有啟動(dòng)子功能的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對SEQ ID NO1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及所述啟動(dòng)子的制備方法以及所述啟動(dòng)子在調(diào)控單子葉植物中目的基因表達(dá)中的用途。
文檔編號A01H5/00GK102021168SQ200910238988
公開日2011年4月20日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者夏秋菊, 孫紅正, 張豐豐, 彭曉華, 黃三文 申請人:深圳華大基因科技有限公司