專利名稱：一種沉香誘導(dǎo)劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種沉香誘導(dǎo)劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
白木香Aquilaria sinensis (Lour. )Gilg，又稱土沉香，屬瑞香科沉香屬植物，為 我國特有的熱帶及亞熱帶常綠喬木，是我國生產(chǎn)名貴芳香類藥材沉香的唯一植物來源，現(xiàn) 已被列為國家二級瀕危保護植物。沉香是我國、日本、印度以及其他東南亞國家的傳統(tǒng)名貴 藥材和名貴的天然香料，其性辛、苦，微溫，能行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘(中華人民共 和國藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005， 128.)。
在沉香中存在兩種主要的成分倍半萜類化合物和色酮類化合物(楊峻山.沉香化學(xué)成分的 研究概況[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1998， 10(1) :99-103.戚樹源，林立東，胡厚才.白木 香中色酮類化合物的形成[J].中草藥，2000，31(9) :658-659.)。商業(yè)上的巨大利潤和非 法貿(mào)易正導(dǎo)致世界各地的沉香越來越少。2000年白木香被世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)列入 IUCN紅色名錄。2004年白木香列入了《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(ITES，即華盛頓 公約)附錄，同時產(chǎn)于東南亞等各國生產(chǎn)沉香的沉香屬所有植物均列入了該公約名錄。
健康的白木香樹體不能產(chǎn)生沉香類物質(zhì)，樹體必須受到各種傷害及真菌侵染后 才能夠產(chǎn)生。自上世紀30年代，國外就開展了大量接菌結(jié)香研究。從沉香屬植物樹體的 結(jié)香部位分離報道的真菌主要有色二孢菌(Diplodia sp.)、可球二孢菌(Botryodiplodia theobromae)、嫌刀菌(Fusarium sp.)、石專紅嫌抱(Fusariumlaseritum)、曲霉(Aspergillus sp.)、毛霉(Mucor sp.)、青霉(Penicillium sp.)、木霉(Trichoderma sp.)、裂褶菌 (Schizophyllum sp.) 等 (Bose S R. The Nature of agarformation[J]. Sci Cult， 1934,4(2) :89-91. Bose S R. Enzymes of wood-rottingfungi[J]. Ergeb Enzymforsch， 1939，8 :267-276. Subeham， Junya U， Fujino H， et al. A field survey of agarwood in Indonesia[J]. J Trad Medicines,2005，22 (4) :244-251. Gibson I A S.The role of fungi in the origin of oleoresin deposits(Agaru)in the wood of Aquillaria agallocha (Roxb. )[J]. Bano Biggyn Patrika，1977，6(1) : 16-26. Nobuchi T， Somkid S. Preliminary observation of Aquliaria crassna woodassociated with the formation of aloeswood bult[J]. Kyoto Univ Forests, 1991，63 :226-235. Ng L T，Chang Y S，Azizol L K. A review on agar(gaharu)producingAquilaria species[J].J Trop For Products, 1997， 2 (2) :272-285.)。研究認為沉香的形成可能是由于樹干損傷后被上述一種 或數(shù)種真菌侵入寄生，在真菌體內(nèi)酶的作用下，使木薄壁細胞貯存的淀粉發(fā)生一系列變化， 形成香月旨，經(jīng)多年沉積而得(Ng L T， Chang Y S， Azizol L K. A review on agar (gaharu) producingAquilaria species[J]. J Trop For Products,1997，2(2) :272-285. Tamuli P， Boruah P， Samanta R. Biochemical changes in agarwood tree (Aquilariamalaccensis L咖k.) during pathogenesis [J]. J Spices and Aromat Crops, 2004， 13 :87-91.)。 國內(nèi) 的真菌侵染研究主要集中在黃綠墨耳菌(Menanotus flavolives)對白木香的侵染。1976
3年廣東植物研究所對鑿洞后1、6、12、18、24個月的五批白木香樣品進行了組織化學(xué)和解 剖學(xué)研究。組織化學(xué)研究結(jié)果顯示，木材薄壁細胞內(nèi)的淀粉依次經(jīng)過中間產(chǎn)物非淀粉的 多糖、醛類或酮類及酚類化合物轉(zhuǎn)化成了沉香。解剖學(xué)研究結(jié)果顯示在白木香成香過程 中伴隨著真菌的生長，推斷在沒有菌絲存在的情況下不能結(jié)香，但是令人疑惑的是在菌絲 分布最密集的區(qū)域_砍傷面下幾厘米的一段木材中(腐爛區(qū))，卻很少或沒有香脂的形成 [11]。這似乎否定了真菌侵染能夠誘導(dǎo)白木香結(jié)香的推測，但是該研究小組后來成功地分 離了黃綠墨耳菌(Menanotus flavolives)并證實該菌可大大加速結(jié)香的進程(戚樹源， 林立東，胡厚才.白木香中色酮類化合物的形成[J].中草藥，2000，31(9) :658-659.廣東 省植物研究所.初步揭開沉香結(jié)香的秘密[J].植物學(xué)報，1976，18(4) :287-291.戚樹源， 陸碧瑤，朱亮鋒，等.白木香中白木香醛形成的研究(簡報)[J].植物生理學(xué)通訊，1992， 28(5) :336-339. RahmanM A，Basak A C. Agar production in agar trees by artificial inoculation andwounding[J]. Bano Bigan Patrika， 1980， 9 (1/2) :97-93.)。戚樹源等(戚 樹源，林立東，胡厚才.白木香中色酮類化合物的形成[J].中草藥，2000，31(9) :658-659. 戚樹源，陸碧瑤，朱亮鋒，等.白木香中白木香醛形成的研究(簡報)[J].植物生理學(xué)通訊， 1992,28(5) :336-339.)對黃綠墨耳菌促進白木香產(chǎn)生沉香主要成分_白木香醛和色酮類 化合的機理進行了研究。他們(戚樹源，陸碧瑤，朱亮鋒，等.白木香中白木香醛形成的研究 (簡報)[J].植物生理學(xué)通訊，1992，28(5) :336-339.)采用GC/MS/DS和掃描電鏡對接種黃 綠墨耳菌的白木香進行研究，研究結(jié)果表明感染真菌1個月的木材組織中，未能檢出白木 香醛及其它沉香倍半萜化合物；1個月后掃描電鏡中觀察到感染真菌產(chǎn)生棕紅色反應(yīng)帶的 白木香木材組織中的細胞開始崩解死亡，同時產(chǎn)生3種細胞逆境代謝產(chǎn)物；在感染真菌2個 月的木材組織中開始檢出白木香醛，其白木香醛的含量隨感染真菌的時間而增加。他們推 論白木香木材組織細胞不能直接合成白木香醛等沉香倍半萜化合物，這些倍半萜類化合物 的形成可能是感染的真菌對其細胞逆境代謝產(chǎn)物進一步代謝的結(jié)果。他們采用HPLC法檢 測白木香受黃綠墨耳菌感染后，色酮類化合物的形成規(guī)律。結(jié)果顯示白木香在真菌感染后， 開始形成色酮類化合物，并隨時間不斷增加。從第3個月后含量增加顯著。在此過程中，沉 香中色酮類化合物的相對含量也呈增加趨勢，但不明顯。由于黃綠墨耳菌為擔子菌類真菌 是一種無致病性、專營腐生生活的木材腐朽菌，白木香并非其天然寄主，菌株在白木香樹干 生長非常緩慢，導(dǎo)致結(jié)香效率不高且不穩(wěn)定。 為建立高效、穩(wěn)定的白木香結(jié)香技術(shù)體系，亟需尋找新的強誘導(dǎo)結(jié)香的菌株，這對 我國的沉香生產(chǎn)也有著十分重要的意義。而且迄今為止，沉香的開發(fā)和利用都是依靠野生 白木香樹的采集，不僅價格昂貴，而且供應(yīng)量也無法保證。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述中存在的問題與缺陷，本發(fā)明提供了一種沉香誘導(dǎo)劑及其制備方法。
所述技術(shù)方案如下 —種沉香誘導(dǎo)劑，包括 百木香樹活體莖、PDA培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基與白木香基質(zhì)。
—種沉香誘導(dǎo)劑的制備方法，該方法包括 對活體莖干進行采樣和分離培養(yǎng)，得到沉香誘導(dǎo)真菌；
將沉香誘導(dǎo)真菌接種于培養(yǎng)基上，以得到所需接種體； 將得到的接種體加入到基質(zhì)中進行培養(yǎng)，形成沉香誘導(dǎo)劑。 對沉香誘導(dǎo)真菌接種于PDA平板培養(yǎng)基上，并置于黑暗條件25t:培養(yǎng)5 7天后， 進行沉香誘導(dǎo)真菌的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定。 將白木香樹活體莖上正在形成沉香的部位割下，并經(jīng)乙醇、升汞消毒后，置于PDA 培養(yǎng)、分離、純化進行保存。 將沉香誘導(dǎo)菌原始菌株接種在PDA活化形成一級接種體，然后接種于馬鈴薯蔗糖 液體培養(yǎng)基發(fā)酵得到二級接種體。 將活化的二級接種體加入白木香基質(zhì)中培養(yǎng)，并在3(TC恒溫、黑暗、通氣條件下培
養(yǎng)3 5天后，形成活性的沉香誘導(dǎo)劑。 本發(fā)明提供的技術(shù)方案的有益效果是 通過本發(fā)明，能夠顯著地縮短沉香的形成時間，提高白木香樹的栽培效益，保證沉 香規(guī)?；a(chǎn)的原料供應(yīng)，而且在幫助山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的同時也保護了生態(tài)環(huán)境。其方 法簡便、成本低廉，具有良好的市場應(yīng)用前景。


圖1是沉香誘導(dǎo)劑的制備方法的流程圖； 圖2為白木香樹正在形成沉香的莖干組織和侵染的真菌樣品； 圖3為白木香樹內(nèi)侵染菌的分離培養(yǎng)情況； 圖4為沉香誘導(dǎo)菌株BWL(L. theobromae)樣品； 圖5為通用引物ITS1/ITS4對誘導(dǎo)菌株BWL(L. theobromae)的PCR擴增結(jié)果； 圖6為誘導(dǎo)菌株BWL (L. theobromae)的ITS序列。
具體實施例方式
為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方 式作進一步地詳細描述
實施例1 本實施例提供了一種沉香誘導(dǎo)劑，包括百木香樹活體莖、PDA培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖 培養(yǎng)基與白木香基質(zhì)。 白木香基質(zhì)是由一下百分比組分的材料構(gòu)成73%白木香樹粉末、25%麩皮、1% 蔗糖、0. 5%碳酸!丐、0. 2% (NH4)2HP04、0. 2% K2HP04、0. 1% MgS04 7H20。
實施例2 本實施例提供了一種沉香誘導(dǎo)劑的制備方法，該方法包括以下步驟
步驟101沉香誘導(dǎo)真菌的采樣和分離培養(yǎng)； 將白木香樹活體莖干上正在形成沉香的部位割下(見圖2)，剪成3X3mm小塊。 75X乙醇消毒2min，0. 1%升汞消毒lmin，再在無菌水中洗滌4次，用滅菌濾紙吸干，置于 PDA培養(yǎng)基平板上25t:黑暗培養(yǎng)，待長出菌落后，通過挑取菌絲尖端方法對分離的真菌進 行純化。純化后的真菌，保存在含液體石蠟的PDA斜面試管中。
步驟102沉香誘導(dǎo)真菌的鑒定；
5
直徑10cm培養(yǎng)皿，加20ml PDA成平板，接種直徑為7mm的菌落邊緣菌絲塊，觀察 不同天數(shù)可可毛色二孢菌的菌落特征。結(jié)果顯示在3(TC的條件下，可可毛色二孢在PDA平 板生長極快，菌落直徑擴展速率可達5厘米/天，初期菌落為白色，第5天產(chǎn)生草綠色素，以 后逐漸加深而成為黑色(見圖3、圖4)。 將沉香誘導(dǎo)菌株移植于PDA平板培養(yǎng)基上，置黑暗條件25t:培養(yǎng)5 7天后，收集 菌絲體，快速放入液氮中或-7(TC保存?；蚪MDNA提取按照參考文獻Doyle J J， Doyle J LA r即id DNA isolation procedure for small quantities offresh leaftissues[J]. Phytoehemistry Bulletin, 1987， 19 :11-15.的方法進行。采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間 隔區(qū)通用引物ITS 1 :5' -TTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3', ITS4 :5' -TCCTCCGCTTATTGATATG C_3' (White TJ，Bruns T， Lees S， Taylor J. Amplification and direct sequencing on fungal ribosomal genes forphylogenetics. In :Innis MA，Gelfand DH，Sninsky JJ and White TJ(eds)PCRProtocols :A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego， 1990,315-322.)擴增5. 8S rDNA及其兩側(cè)的ITSl和ITS2基因片段。反應(yīng)體系 為總反應(yīng)體系為20 ii L，模板DNA為50ng，引物各為10pmol/L， dNTP為250 y mol/L，MgC12 為2mmol/L，Taq DNA聚合酶為1. 0U。反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3min ;94。C變性lmin， 52。C退 火lmin、72。C延伸lmin，共30個循環(huán);最后一步72"C延伸5min。結(jié)果顯示用ITS1和ITS4引 物，對分離菌株rDNA的ITS區(qū)進行擴增，均產(chǎn)生一個大小約500bp的DNA片段，見圖5。測序 結(jié)果經(jīng)BLAST搜索核酸數(shù)據(jù)庫顯示，序列一致于L. theobromae的ITS1、ITS2和5. 8S rDNA 序列(Isolate :Lasiodiplodia theobromae strain GrSl-2，Accession No. FJ904912. 1)， 進一步證實了分離于沉香誘導(dǎo)菌株是可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae (見圖 6)。 步驟103沉香誘導(dǎo)菌接種體的制備； 沉香誘導(dǎo)菌原始菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，在3(TC恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)5 7 天，形成一級接種體。再將一級接種體接種于pH值5.5的馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中。將 0. 3 0. 5g菌絲體接種于1000ml馬鈴薯蔗糖液體中，30°C 、 120 150r/min下振蕩培養(yǎng) 3 5天后，得到每ml含0. 2 0. 4g菌絲懸浮液體，即二級接種體。
步驟104沉香誘導(dǎo)劑的制作； 將活化的二級接種體加入白木香基質(zhì)中培養(yǎng)，3(TC恒溫、黑暗、通氣條件下培養(yǎng) 3 5天后，即具有活性的沉香誘導(dǎo)劑。沉香誘導(dǎo)劑為活性菌株，需盡快使用，在室溫下可保 持活力15 20天，在4t:下可保持活力3個月。 上述白木香基質(zhì)的制作過程將73%白木香樹粉末、25%麩皮、1%蔗糖、0. 5%碳 ,丐、0. 2% (NH4) 2HP04、0. 2% K2HP04、0. 1% MgS04 7H20進行混合，加水浸泡24 36小 時，然后在121°C、0. llMPa/cm2高溫高壓滅菌1小時，冷卻后制成白木香基質(zhì)培養(yǎng)基，然后 用于接種。 上述馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基制作過程為取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水 1000ml煮沸30min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000ml，家蔗糖20g，瓊脂15g，融化后分 裝，調(diào)pH值至5. 5， 121°C、0. llMPa/cm2高溫高壓滅菌15min。 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式
，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護范圍 為準。
權(quán)利要求
一種沉香誘導(dǎo)劑，其特征在于，所述沉香誘導(dǎo)劑包括百木香樹活體莖、PDA培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基與白木香基質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的沉香誘導(dǎo)劑，其特征在于，所述白木香基質(zhì)是由以下百分比 組分的材料構(gòu)成73%白木香樹粉末、25%麩皮、1%蔗糖、0. 5%碳酸鈣、0. 2% (NH4)2HP04、 0. 2% K2HP04、0. 1% MgS04 7H20。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的沉香誘導(dǎo)劑的制備方法，其特征在于，所述制備步驟包括 A對活體莖干進行采樣和分離培養(yǎng)，得到沉香誘導(dǎo)真菌；B將沉香誘導(dǎo)真菌接種于培養(yǎng)基上，以得到所需接種體；C將得到的接種體加入到基質(zhì)中進行培養(yǎng)，形成沉香誘導(dǎo)劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的沉香誘導(dǎo)劑的制備方法，其特征在于，所述執(zhí)行步驟B之前 還包括將沉香誘導(dǎo)真菌接種于PDA平板培養(yǎng)基上，并置于黑暗條件溫度為25t:培養(yǎng)5 7 天后，進行沉香誘導(dǎo)真菌的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的沉香誘導(dǎo)劑的制備方法，其特征在于，所述步驟A具體包括 將白木香樹活體莖上正在形成沉香的部位割下，并經(jīng)乙醇、升汞消毒后，置于PDA培養(yǎng)、分 離、純化進行保存。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的沉香誘導(dǎo)劑的制備方法，其特征在于，所述步驟B具體包括 將沉香誘導(dǎo)菌原始菌株接種在PDA活化形成一級接種體，然后接種于馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng) 基發(fā)酵得到二級接種體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的沉香誘導(dǎo)劑的制備方法，其特征在于，所述步驟C具體 包括將活化的二級接種體加入白木香基質(zhì)中培養(yǎng)，并在3(TC恒溫、黑暗、通氣條件下培養(yǎng) 3 5天后，形成活性的沉香誘導(dǎo)劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2或7所述的沉香誘導(dǎo)劑的制備方法，其特征在于，所述白木香基質(zhì)的 制作步驟包括將73%白木香樹粉末、25%麩皮、1%蔗糖、0. 5%碳酸鈣、0. 2% (NH4)2HP04、 0. 2% K2HP04、0. 1% MgS04 71120進行混合，加水浸泡24 36小時，在121°C、0. 11MPa/cm2 高溫高壓滅菌1個小時，冷卻后制成白木香基質(zhì)培養(yǎng)基。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的沉香誘導(dǎo)劑的制備方法，其特征在于，所述馬鈴薯蔗糖液體 培養(yǎng)基的制作步驟包括取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml煮沸30min后，濾去馬 鈴薯塊，將濾液補足至1000ml，加蔗糖20g，瓊脂15g，溶化后分裝，并調(diào)pH值至5. 5、溫度為 12rC、高壓為0. 11MPa/cm2下滅菌15min。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的沉香誘導(dǎo)劑的制備方法，其特征在于，所述沉香誘導(dǎo)菌菌株為可可毛色二 包菌Lasiodiplodia theobromae。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種沉香誘導(dǎo)劑及其制備方法，所述沉香誘導(dǎo)劑包括百木香樹活體莖、PDA培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基與白木香基質(zhì)。所述方法包括將白木香樹活體莖干上正在形成沉香的部位割下，經(jīng)消毒、培養(yǎng)、分離和鑒定后得到沉香誘導(dǎo)菌株。菌株經(jīng)PDA培養(yǎng)基活化、馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基發(fā)酵后，接種于白木香基質(zhì)，30℃恒溫、黑暗、通氣條件下培養(yǎng)3～5天后，即得沉香誘導(dǎo)劑。本發(fā)明方法簡便，能夠顯著縮短沉香的形成時間，提高白木香樹的栽培效益，具有良好的市場應(yīng)用前景。
文檔編號A01N63/04GK101731282SQ20091024121
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月2日
發(fā)明者馮錦東, 孟慧, 張爭, 楊云, 陳偉平, 陳懷瓊, 高志暉, 魏建和 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所