專(zhuān)利名稱(chēng)：香石竹直接體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的植株再生方法及專(zhuān)用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，與園林植物快速繁殖有關(guān)，具體涉及 一種以香石竹的花苞為外植體，通過(guò)直接的體細(xì)胞發(fā)生途徑再生完整香石竹植株的方法， 本發(fā)明還包括陪同使用的專(zhuān)用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
香石竹(Dianthus caryophyllus L.)又名康乃馨，屬于石竹科 (Caryophyllaceae)石竹屬(Dianthus L.)。原產(chǎn)于南歐，多年生宿根花卉，是世界四大切 花之一。同時(shí)也可供盆栽觀賞、布置花壇，是重大節(jié)日、重大禮儀場(chǎng)合不可缺少的花卉。香石竹的組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)研究開(kāi)展較早，取得了不少研究成果。然而，盡 管香石竹獲得再生植株比較容易，但其再生苗比較纖弱、易發(fā)生玻璃化，使得組織培養(yǎng)苗增 殖率和移栽成活率均較低，直接培養(yǎng)生產(chǎn)用苗困難。目前，生產(chǎn)用苗主要通過(guò)組織培養(yǎng)和脫 毒技術(shù)，培養(yǎng)優(yōu)良無(wú)病母株后，然后通過(guò)扦插途徑大量繁殖而獲得。另外在以香石竹葉片為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，在侵染后的選擇培養(yǎng)過(guò) 程中，易分化出一些不正常的苗，包括僅具葉片而無(wú)生長(zhǎng)點(diǎn)、葉片畸形(花瓣?duì)?、針狀、絲 狀)，還有一些轉(zhuǎn)化苗節(jié)間極短的苗，莖變得很扁，難以分成單株，而在對(duì)照培養(yǎng)中較少出現(xiàn) 這些不正常的分化苗，可能是由于培養(yǎng)基中潮霉素和頭孢霉素的選擇壓力及農(nóng)桿菌浸染的 共同作用，使細(xì)胞的內(nèi)在發(fā)育改變正常的途徑所致(余義勛等，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ACC氧化 酶基因轉(zhuǎn)化香石竹的研究，博士畢業(yè)論文，2003)。因此通過(guò)建立香石竹直接的體胚再生途 徑，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的研究，則有可能使上述情況有所改觀，也可 以達(dá)到進(jìn)一步提高香石竹遺傳轉(zhuǎn)化效率的目的?，F(xiàn)有技術(shù)中，還未有關(guān)于直接體胚再生的報(bào)道，只有通過(guò)愈傷組織途徑植株再生 的報(bào)道。通過(guò)愈傷組織途徑植株再生方法通常是這樣的，將香石竹幼嫩的莖段接種在誘導(dǎo) 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，對(duì)誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，再將能穩(wěn)定繼代的愈傷組織 轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)中誘導(dǎo)不定芽的形成，當(dāng)不定芽長(zhǎng)到2-3cm時(shí)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生 根。葛欣等(2000)發(fā)表的研究論文中詳細(xì)報(bào)道了利用香石竹的莖段誘導(dǎo)出的愈傷再生出 完整的香石竹植株的方法，所采用的愈傷組織誘導(dǎo)和愈傷組織繼代、分化以及生根培養(yǎng)基 均以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加BA、2，4-D、IBA、NAA和AC，但是在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 有三種，其成分為(1)以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基(2,4-D 0. 2mg/L+BA 0. 5mg/L)，(2)以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基(2，4-D 0. lmg/L+BAO. 5mg/L) ； (3)以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基(2，4_D 0. lmg/L+BA 0.2mg/L)。據(jù)報(bào)道通過(guò)該方法離體培養(yǎng)中從香石竹莖段誘導(dǎo)愈傷組織在第二 種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織的誘導(dǎo)率為80%以上，因此選擇第二種培養(yǎng)基為愈傷組織誘 導(dǎo)培養(yǎng)基。由于不同的基因型其分化率也有差異，其分化培養(yǎng)基也有三種，最終選擇分化率 較高的MS基本培養(yǎng)基(BA 0. 5mg/L+NAA 0. 2mg/L)，分化率達(dá)60%以上。上述成果采用的外植體雖然不受季節(jié)限制，但是獲取愈傷的途徑比較繁瑣，工作量大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，涉及一種以香石竹的花苞為外植體，通 過(guò)直接的體細(xì)胞發(fā)生途徑再生完整香石竹植株的方法，本發(fā)明還包括陪同使用的專(zhuān)用培養(yǎng) 基。本發(fā)明為大量獲得香石竹組織培養(yǎng)試管苗提供了一種快繁新方法，提高香石竹外植體 胚性愈傷組織誘導(dǎo)、增殖和體胚的分化效率，利用香石竹的花苞(溫室內(nèi)材料的獲取不受 季節(jié)的限制)，通過(guò)胚性愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、體胚的分化進(jìn)而再生大量香石竹植株。同時(shí)本 發(fā)明方法所獲得的胚性愈傷組織能夠長(zhǎng)期繼代并保持其分化能力，可作為香石竹植物遺傳 轉(zhuǎn)化的材料。本發(fā)明的另一個(gè)目的是研制一種能夠使香石竹胚性愈傷組織長(zhǎng)期繼代地并保 持體胚分化的培養(yǎng)基。本發(fā)明的技術(shù)方案如下1、一種香石竹直接體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的植株再生方法，包括下列步驟a)將滅菌后的香石竹的花苞接種到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組 織；b)將步驟a)中得到的發(fā)育狀態(tài)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基 上使其增殖；c)挑選步驟b)得到的發(fā)育狀態(tài)良好的愈傷組織接種到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo) 體胚分化得到成熟體胚；d)將步驟c)得到的成熟體胚接種到體胚成苗培養(yǎng)基上使其再生出完整植株；上述步驟b)的方法還包括將其中的黃色胚性愈傷組織接種到胚性愈傷組織繼代 培養(yǎng)基上，使其長(zhǎng)期繼代并保持分化能力；其中所述的胚性愈傷組織誘導(dǎo)采用的誘導(dǎo)劑選自2. Omg/L的2，4_D和0. 2mg/L的 6-BA ；體胚誘導(dǎo)所采用的誘導(dǎo)劑選自0. 2mg/L的2，4_D ；上述步驟a)至d)的培養(yǎng)基的組分及配比為胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基；2. Omg/L 2,4-D ；0. 2mg/L 6-BA ； 90. Og/L蔗糖，7. 5g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5. 8 6. 0 ；胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基；蔗糖90. Og/L ；瓊脂7. 5g/L ；加水至 1L,滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5. 8 6. 0 ；胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基；蔗糖90. Og/L ；瓊脂7. 5g/L ；加水至 1L,滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5. 8 6. 0 ；體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基，2,4-DO. 2mg/，蔗糖30. 0g/L,瓊脂7. 5g/L，加水 至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5. 8 6. 0體胚成苗培養(yǎng)基1/2MS基本培養(yǎng)基，蔗糖30. 0g/L,瓊脂7. 5g/L，加水至1L，滅菌 前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5. 8 6. 0。在本發(fā)明中，上述體胚成苗采用的是成熟胚，將該成熟胚中的正常體胚一次性誘 導(dǎo)成苗，再誘導(dǎo)生根。
一種用于將香石竹胚性愈傷組織長(zhǎng)期繼代并保持分化的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有MS 基本培養(yǎng)基，附加2，4- 二氯苯氧乙酸。為了便于對(duì)本發(fā)明的理解，申請(qǐng)人對(duì)上述各個(gè)步驟中所用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)基中所 用到的誘導(dǎo)劑、植物激素和其他附加成分做了如下定義培養(yǎng)基包括胚性愈傷組織誘導(dǎo) 培養(yǎng)基、胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基、胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基、體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基及體胚成 苗培養(yǎng)基。包含大量成分即無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基稱(chēng)為基本培養(yǎng)基。本發(fā)明所使用基本培養(yǎng)基 來(lái)源如下MS 基本培養(yǎng)基(參見(jiàn) Murashige T. and F. Skoog. Physiol. Plant, 1962,15 473-497)；在本發(fā)明中，所述的誘導(dǎo)劑和植物激素定義及簡(jiǎn)稱(chēng)如下誘導(dǎo)劑(又稱(chēng)生長(zhǎng)素)包 括萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2、4-D)、植物激素中的細(xì)胞分裂素包括6-芐基腺嘌呤 (6-BA)，其他附加成分是甘露醇(marmitol)。本申請(qǐng)中申請(qǐng)人僅以一種基因型的香石竹植物的花苞為例進(jìn)行實(shí)施，但本領(lǐng)域的 技術(shù)人員在理解了本申請(qǐng)的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容后很容易對(duì)本發(fā)明的方法作各種改進(jìn)，并實(shí)施于其 他基因型的香石竹植物。本發(fā)明可從花苞高頻誘導(dǎo)愈傷組織，其中的胚性愈傷組織能保持不斷增殖，并能 誘導(dǎo)出體胚和促成成苗的特性。此外，這些誘導(dǎo)產(chǎn)生體胚的胚性愈傷組織，并可將其長(zhǎng)期繼 代保存并保持分化能力。這些胚性愈傷組織為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的香石竹的遺傳轉(zhuǎn)化提供了良好 的受體；同時(shí)，該再生體系也是香石竹遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體并為進(jìn)一步優(yōu)化香石竹的遺傳 轉(zhuǎn)化體系奠定了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。本發(fā)明的積極效果是(1)本發(fā)明所采用的外植體來(lái)源不受季節(jié)限制，可以周年進(jìn)行香石竹植物的組織 和細(xì)胞培養(yǎng)。(2)離體培養(yǎng)下的香石竹體胚可通過(guò)胚性愈傷組織不斷增殖，具有良好的增殖效^ o(3)離體培養(yǎng)下的香石竹胚性愈傷組織可以長(zhǎng)期繼代保存并能保持其進(jìn)一步分化 為小植株的能力。


圖1是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例從香石竹花苞中誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織；圖2是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例不同發(fā)育階段的胚狀體；圖3是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例由正常體胚誘導(dǎo)分化的植株；圖4是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例移栽成活20天的香石竹植株(田間狀態(tài))。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1試驗(yàn)材料選擇、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)與接種培養(yǎng)1、試驗(yàn)材料來(lái)源及其處理本發(fā)明的試驗(yàn)材料選自香石竹的花苞，采自湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉試驗(yàn) 基地，為常規(guī)的商購(gòu)的香石竹品種(本發(fā)明的香石竹的離體培養(yǎng)成株不受品種及其基因型 的限制)。田間采集的香石竹的花苞按常規(guī)方法消毒(參見(jiàn)李明浚編譯，植物組織培養(yǎng)，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1992年版)，將消毒后的香石竹花苞的花瓣和花托在超凈工作臺(tái)上切下， 花瓣和花托分離，將帶有花瓣基部的花瓣切成長(zhǎng)4mm的小塊。這些小塊接種在胚性愈傷的 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。這些帶有花瓣基部的小塊即作為外植體。2、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)表1，列出了本發(fā)明的各種培養(yǎng)的成分及其用量。表1本發(fā)明設(shè)計(jì)的香石竹花苞的離體培養(yǎng)基 說(shuō)明MS基本培養(yǎng)基配制參見(jiàn)李明浚編譯，植物組織培養(yǎng)，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 1992年版表1中的胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基，既作為一般增殖培養(yǎng)基，也是本發(fā)明所指的 愈傷組織長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)基。培養(yǎng)基種各組分的代號(hào)如下2，4-D(2，4_二氯苯氧乙酸)、6-BA(6_芐基腺嘌呤)、 甘露醇(marmitol)均可以從商業(yè)上購(gòu)買(mǎi)。3、培養(yǎng)條件培養(yǎng)室的培養(yǎng)溫度24士2°C，光照強(qiáng)度1000-15001x，每天光照14h;暗培養(yǎng)條 件溫度24士2°C的暗培養(yǎng)箱中，24h ；弱光培養(yǎng)溫度24士2°C，每天弱光照14h，光照強(qiáng)度 100-5001x。4、接種與培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)或無(wú)菌接種箱條件下將消毒后的花苞片的基部切成0. 4mm的小塊， 接種于胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基如表1所示)上，每一培養(yǎng)皿中接種20個(gè)外植體， 25°C暗培養(yǎng)。光培養(yǎng)約1周后，可見(jiàn)花苞片開(kāi)始膨大并且顏色很明顯的開(kāi)始發(fā)生變化，花苞 片的基部開(kāi)始膨大，2周以后基部開(kāi)始有少量的愈傷組織產(chǎn)生，一個(gè)月以后有的開(kāi)始變成顆 粒狀的黃色且緊實(shí)的愈傷組織，同時(shí)有少量的不定根產(chǎn)生(如圖1所示)，而有的外植體則 變褐死亡，未能誘導(dǎo)出愈傷組織。將胚性愈傷組織接種到胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基(見(jiàn)表1所示)上，在光培養(yǎng)條 件下經(jīng)過(guò)1個(gè)月培養(yǎng)后，選取大小一致，色澤新鮮，淡黃色，質(zhì)地緊密，表面具不同皺褶或呈 顆粒狀的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到初生體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(見(jiàn)表1所示)上。每一培養(yǎng)皿約培養(yǎng) 15塊胚性愈傷組織，2周后，少量愈傷組織表面出現(xiàn)不同狀態(tài)的體胚(見(jiàn)圖2)，一個(gè)月以后 這些體胚可在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)快速成熟并萌發(fā)。如果愈傷組織狀態(tài)不好，則很 難誘導(dǎo)體胚的發(fā)生。將胚性愈傷組織接種到胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基(見(jiàn)表1所示)上，可長(zhǎng)期保存，在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上可不斷分化。胚性愈傷增殖一般選取未萌發(fā)或剛萌發(fā)的愈傷組織進(jìn)行增殖，否則增殖的胚性愈 傷組織發(fā)育成熟就會(huì)轉(zhuǎn)換成苗。30天后將正常的體胚接種到體胚成苗培養(yǎng)基(見(jiàn)表1所示)上進(jìn)行體胚成苗誘 導(dǎo)，正常的體胚由于具有根芽雙極性結(jié)構(gòu)可直接成苗(見(jiàn)圖3)。一個(gè)月后，將根系發(fā)育良好的再生植株移到有散射光的自然條件下，煉苗一周，取 出生根小植株，洗凈根部瓊脂，然后移栽到裝有腐殖土 珍珠巖(體積比3 1)的盆中(最 好在4、5月份移栽)，弱光下放3-4天，使其長(zhǎng)出新根，再在強(qiáng)光下生長(zhǎng)，注意保濕，使其健康 生長(zhǎng)(見(jiàn)圖4)。實(shí)施例2花苞的大小對(duì)香石竹愈傷組織誘導(dǎo)率的影響香石竹花苞的大小對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率有很重要的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)以不同大小 的香石竹花苞片為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。香石竹花苞片的大小分為0. 5 1. 0cm, 1. 0 1. 5cm, 1. 5 2. 0cm。不同大小的花苞片對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有很重要的影響。結(jié)果 表明，大小為1. 0 1. 5cm, 1. 5 2. 0cm的花苞之間愈傷組織的誘導(dǎo)率并沒(méi)有顯著性差異， 但以花苞片大小為1. 0 1. 5cm時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)率最高。所以選擇大小為1. 0 1. 5cm 的花苞用來(lái)誘導(dǎo)愈傷組織。表2不同大小的花苞對(duì)香石竹愈傷組織體胚誘導(dǎo)的影響 實(shí)施例3不同濃度的2，4-D與BA對(duì)香石竹花苞片愈傷組織誘導(dǎo)的影響在植物組織培養(yǎng)中，2，4_D是一種應(yīng)用得比較廣泛的生長(zhǎng)素類(lèi)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，它被公 認(rèn)是一種最有效的啟動(dòng)細(xì)胞脫分化，形成愈傷組織或器官發(fā)生的生長(zhǎng)素。細(xì)胞分裂素BA最 顯著的生理作用就是能促進(jìn)細(xì)胞分裂。生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素BA混合使用對(duì)愈傷組織的分化能起調(diào)控作用香石竹的花苞片培養(yǎng)約1周后可見(jiàn)切口膨大處有少量黃白色的愈傷組織產(chǎn)生，1 個(gè)月左右，可觀察到兩種類(lèi)型的愈傷組織，一種是白色半透明，較緊實(shí)，表面有光澤，這種愈 傷組織在隨后的繼代中大多可以產(chǎn)生體胚。另一種是綠色、松散生長(zhǎng)旺盛或水漬狀或褐化， 這種愈傷組織的狀態(tài)很難調(diào)整，在分化中未能產(chǎn)生體胚，一般會(huì)直接的分化成芽。在本發(fā)明 方法中，供試的香石竹的花苞片在的不同濃度的2，4-D和BA的組合下的培養(yǎng)基上有的能產(chǎn) 生愈傷組織，有的能再生出芽，而有的是既能再生出芽又能誘導(dǎo)出愈傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出， 組合7，9的花苞片幾乎沒(méi)有愈傷或芽點(diǎn)出現(xiàn)，組合3大部分再生出芽，而且長(zhǎng)勢(shì)較快，組合 3的芽和愈傷都很少，并且長(zhǎng)勢(shì)較慢，以組合5，8誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率最高且愈傷組織的 狀態(tài)最好，但組合5的長(zhǎng)勢(shì)較好，愈傷組織致密，為淡黃色。因此，組合5是胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳激素濃度。表3不同激素的不同濃度的組合 表4不同濃度的2，4-D和BA對(duì)香石竹花苞愈傷組織體胚誘導(dǎo)的影響 注實(shí)驗(yàn)采用MS基本培養(yǎng)(參見(jiàn)李明浚編譯，植物組織培養(yǎng)，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 1992年版)，所添加蔗糖、瓊脂、水和PH如表1所示。
權(quán)利要求
一種香石竹直接體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的植株再生方法，包括下列步驟a)將滅菌后的香石竹的花苞接種到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織；b)將步驟a)中得到的發(fā)育狀態(tài)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上使其增殖；c)挑選步驟b)得到的發(fā)育狀態(tài)良好的愈傷組織接種到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚分化得到成熟體胚；d)將步驟c)得到的成熟體胚接種到體胚成苗培養(yǎng)基上使其再生出完整植株；上述步驟b)的方法還包括將其中的黃色胚性愈傷組織接種到胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，使其長(zhǎng)期繼代并保持分化能力；其中所述的胚性愈傷組織誘導(dǎo)采用的誘導(dǎo)劑選自2.0mg/L的2，4-D和0.2mg/L的6-BA；體胚誘導(dǎo)所采用的誘導(dǎo)劑選自0.2mg/L的2，4-D；上述步驟a)至d)的培養(yǎng)基的組分及配比為胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基；2.0mg/L 2，4-D；0.2mg/L 6-BA；90.0g/L蔗糖，7.5g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8～6.0；胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基；蔗糖90.0g/L；瓊脂7.5g/L；加水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8～6.0；胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基；蔗糖90.0g/L；瓊脂7.5g/L；加水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8～6.0；體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基，2，4-D0.2mg/，蔗糖30.0g/L，瓊脂7.5g/L，加水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8～6.0；體胚成苗培養(yǎng)基1/2MS基本培養(yǎng)基，蔗糖30.0g/L，瓊脂7.5g/L，加水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5.8～6.0。
2.權(quán)利要求1所述方法的專(zhuān)用培養(yǎng)基，按照mg/L計(jì)組分及配比如下胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS基本培養(yǎng)基；2. 0mg/L 2，4-D ；0. 2mg/L 6-BA ；90. 0g/L 蔗糖，7. 5g/L瓊脂，加水至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5. 8 6. 0 ；胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基；蔗糖90. 0g/L ；瓊脂7. 5g/L ；加水至1L，滅 菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5. 8 6. 0 ；胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基；蔗糖90. 0g/L ；瓊脂7. 5g/L ；加水至1L，滅 菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5. 8 6. 0 ；體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基，2，4-D0. 2mg/，蔗糖30. 0g/L，瓊脂7. 5g/L，加水至1L， 滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5. 8 6. 0 ；體胚成苗培養(yǎng)基1/2MS基本培養(yǎng)基，蔗糖30. 0g/L,瓊脂7. 5g/L，加水至1L，滅菌前調(diào) 培養(yǎng)基的pH至5. 8 6.0。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域。涉及花卉植物香石竹的離體繁殖再生完整植株方法。步驟如下a)將滅菌后的香石竹的花苞接種到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；b)將步驟a)的發(fā)育良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上使其增殖；c)將步驟b)的愈傷組織接種到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)體胚分化，得到成熟體胚；d)得到的成熟體胚轉(zhuǎn)移至體胚成苗培養(yǎng)基上使其再生出完整植株。本發(fā)明所采用的外植體不受季節(jié)限制，可周年進(jìn)行組織和細(xì)胞培養(yǎng)；離體下的香石竹體胚可以通過(guò)胚性愈傷組織不斷分化得到，具有良好的分化效果；所述香石竹胚性愈傷組織可長(zhǎng)期繼代保存并能保持其進(jìn)一步分化為小植株的能力。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101874471SQ20091027269
公開(kāi)日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者傅小鵬, 劉國(guó)鋒, 包滿(mǎn)珠, 寧國(guó)貴, 張俊衛(wèi), 王文恩, 程曉巖 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)