專利名稱：：北五味子組織培養(yǎng)育苗生根方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物繁殖技術(shù)，即北五味子組織培養(yǎng)育苗生根方法。
背景技術(shù)：
：在已有技術(shù)中，北五味子(Schisandrachinensis(Turcz)Baill)別名五味子，山花椒，是木蘭科五味子屬的多年生落葉木質(zhì)藤本，果實(shí)及種子為著名中藥，入藥可以用來治療神經(jīng)衰弱、乏力、盜汗等；莖皮可做調(diào)料，香料，果汁可制作飲料、果酒等。北五味子長可達(dá)10m以上，莖皮灰褐色，皮明顯，小枝褐色，稍有棱，單葉互生，質(zhì)薄，稍帶膜質(zhì)，柄細(xì)長，葉片卵圓形，長5-llcm，寬3-5cm，先端急尖或漸尖，基部楔形，邊緣疏生小尖齒，上面深綠色，有光澤，無毛，下面脈上嫩時(shí)有短柔毛，全株芳香，花單性。分布于我國東北，華北等地；朝鮮，蘇聯(lián)遠(yuǎn)東地區(qū)亦有。五味子作為果、藥兼用資源，開發(fā)前景十分廣闊。在《國家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》中，五味子被列為三級保護(hù)物種。北五味子是地道的北藥，但在生產(chǎn)中主要存在種源性狀繁多，產(chǎn)量及有效成分含量不穩(wěn)定，質(zhì)量難以控制等問題，產(chǎn)品只能定為野生統(tǒng)貨、栽培統(tǒng)貨。播種繁殖變異率很高，難以得到性狀一致的種苗，因而不能用于規(guī)范化生產(chǎn)；而分株繁殖則存在繁殖慢，易退化和傳播病害，也不適于現(xiàn)代的大規(guī)模生產(chǎn)。北五味子繁育方式包括種子育苗、扦插繁殖和組織培養(yǎng)，采用組織培養(yǎng)的方法來生產(chǎn)五味子種苗是實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)的基礎(chǔ)，但至今在生產(chǎn)中沒有得到實(shí)現(xiàn)。吳秀菊等于1999年報(bào)道了藥用植物北五味子的組織培養(yǎng)，以帶腋芽的嫩莖作外植體，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在附加6-BA2.o+ZTo.lrag/L，誘導(dǎo)芽效果佳；在附加6-BA2.0+NAA0.2+ZT0.lrag/L，芽的增殖率最好；力0.2mg/LNAA時(shí)生根效果最佳，但參照相關(guān)資料提供數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)沒有重現(xiàn)結(jié)果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)解決方案是北五味子組織培養(yǎng)育苗生根方法是利用組織培養(yǎng)技術(shù)獲得叢生苗，并截取其莖段在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)處理，之后在基質(zhì)中生根。所述的生根培養(yǎng)基為l/8MS+IAA0.8mg/L+KT0.50mg/L，預(yù)處理培養(yǎng)條件溫度20—24。C，暗處理48h。所述的基質(zhì)為泥炭土、細(xì)河砂、腐殖質(zhì)、珍珠巖或蛭石中的任一種或組合。優(yōu)選為泥炭土和細(xì)河砂(泥炭土細(xì)河砂=4:1)?；|(zhì)選擇不限于此，還可以是植物繁殖用的常規(guī)基質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明的組織培養(yǎng)的方法來繁殖五味子，繁殖快，繁殖系數(shù)大，管理方便，生產(chǎn)成本低。2、能夠得到性狀穩(wěn)定、整齊、一致、無病蟲害的五味子種苗，具有遺傳穩(wěn)定性較好，速度快，成苗率高，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，可操作性強(qiáng)，簡捷易掌握等特點(diǎn)。3、培養(yǎng)周期短，可周年生產(chǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制。下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。具體實(shí)施例方式北五味子組織培養(yǎng)育苗生根方法一、利用常規(guī)組織培養(yǎng)技術(shù)(如腋芽叢生分化或愈傷組織分化)獲得五味子叢生苗，截取其莖段。二、叢生苗預(yù)處理和生根培養(yǎng)1/8MS培養(yǎng)基中不同濃度植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的交叉配比對北五味子預(yù)處理后莖段生根的影響1材料與方法1.1芽苗生根預(yù)處理培養(yǎng)基的篩選以1/8MS為培養(yǎng)基，附加不同濃度的IAA、IBA和KT。蔗糖IOg/L，瓊脂8.0g/L，pH6.5，篩選最合適的生根預(yù)處理培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件溫度(22士2)。C，暗處理48h。1.2砂培生根將經(jīng)過48h暗處理的嫩莖段從培養(yǎng)瓶中取出，在含有l(wèi).OOmg/L殺毒礬溶液中洗去莖段基部殘留的瓊脂，然后植入經(jīng)15倍殺毒礬溶液消毒過的細(xì)河砂中，用透光好的塑料薄膜覆蓋以保濕保溫，濕度保持在80%，溫度控制在(18士2)°C，每天中午通風(fēng)換氣IOmin，10d后揭去薄膜，每天早晚噴灑清水各l次，30d(天)后統(tǒng)計(jì)生根率。1.3方法采用1/8MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)IAA、IBA和KT，生長素IAA、IBA濃度均控制在O.IO—I.OOmg/L之間，KT濃度控制在O.IO—O.50mg/L之間。由預(yù)試驗(yàn)可知，生長素濃度超過l.OOmg/L幼苗基部膨脹并產(chǎn)生愈傷瘤，繼續(xù)培養(yǎng)根從愈傷瘤上發(fā)出，這樣的苗在移栽時(shí)，根隨愈傷瘤從苗基部脫落，移栽成活率幾乎為零，可能是根與苗莖的纖維疏導(dǎo)組織連接不完整所致，在培養(yǎng)基中附加適量的KT較未附加的生根快而多，可能是適當(dāng)濃度的KT有利于根原基迅速形成和形成的數(shù)量較多。為了提高北五味子的生根速度和生4根率的試驗(yàn)效率，采用均勻設(shè)計(jì)法，每個(gè)處理接種苗數(shù)為30，選用1]1()(108)均勻表(見表1)。表lUK)(10,因素及水平設(shè)計(jì)水平因素Factors/mg/LLevelsXiX2x310.100.100.1020.200.200.2030.300.300.3040.400.400.4050.500.500.5060.600.600.1070.700.700.2080.800.800.3090.900.900.40101.001.000.502數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析與處理采用均勻設(shè)計(jì)(UniformDesign)軟件?？疾霫AA、IBA和KT濃度交叉配比對生根率的影響(在表和方程中，Xi為IAA濃度，X2為IBA濃度，X3為KT濃度，Y為預(yù)處理48h后砂培30d的生根率，結(jié)果見表2)。表2111()(103)均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果處理號因素Factors/mg/LY+TreatmentcodeXix2x3/%10.100.500.2044.020.201.000.3051.530.300.400.5061.540.400.900.1055.050.500.300.2062.060.600.800.4072.070.700.200.5079.580.800.700.1073.0590.900.100.3083.0101.000.600.4090.5數(shù)據(jù)經(jīng)均勻設(shè)計(jì)軟件處理，得回歸方程丫=33.5+46.6X^0.635X2+24.7X3，樣本容量N二10，顯著性水平a二0.01，復(fù)相關(guān)系數(shù)R二O.9989，檢驗(yàn)值Ft二876.3，臨界值F(o.(u，3，6)=9.780，F(xiàn)t〉F(o.(u，3，6)，回歸方程顯著。對各方程項(xiàng)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)可知檢驗(yàn)值F(2)二0.3447，臨界值F(o.(nj，6)二13.75，F(xiàn)(2)《F(o.01，1;6)，此方程項(xiàng)不顯著，需要剔除，剔除不顯著方程項(xiàng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)均勻設(shè)計(jì)軟件處理得回歸方程Y=34.1+46.4X!+24.3X3，復(fù)相關(guān)系數(shù)R二O.9988，檢驗(yàn)值Ft二1450，臨界值F(o.01，2，7)=9.547，F(xiàn)t〉F(o.(u，2，7)，回歸方程顯著。同理，對各方程項(xiàng)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)可知各方程項(xiàng)均顯著。根據(jù)回歸方程求出Y的最優(yōu)組合為Xfl.OO，X3=0.50，在此組合基礎(chǔ)上求得最優(yōu)解y=92.7，按公式Y(jié)二y士Ua.S計(jì)算出優(yōu)化值區(qū)間估計(jì)為Y二92.7(±2.93)，g卩89.77-95.63%。以最優(yōu)組合再次做驗(yàn)證試驗(yàn)，將嫩芽基部直接再生的芽苗切割成一葉一段接種到附加1.00mg/LIAA和O.50mg/LKT的l/8MS培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)處理48h后從培養(yǎng)瓶中取出，按l.2方法進(jìn)行砂培生根，30d(天)后將莖段苗從砂中輕輕挖出，統(tǒng)計(jì)生根率，由生根結(jié)果表明，93%以上的莖段產(chǎn)生了根，有的產(chǎn)生了側(cè)根且根發(fā)育均正常。通過觀察發(fā)現(xiàn)，根發(fā)生的部位有三種情況第一種情況是60%的莖段的根直接從莖段切面發(fā)出，根數(shù)達(dá)45條以上，根長在0.502.50cm之間不等；第二種情況是30%的莖段根從苗干近基部處發(fā)出，根數(shù)大多為2條，根長為l.OOcm左右，但根粗壯且側(cè)根較多；第三種情況是5%的苗根從莖段基部產(chǎn)生的愈傷瘤中發(fā)出，根數(shù)大多為45條，根長為2.00cm左右。第三種情況發(fā)生的根在移栽時(shí)，根隨愈傷瘤從苗基部脫落，移栽成活率幾乎為零，不宜選用于移栽，這可能是生長素濃度過高產(chǎn)生的。因此，將實(shí)驗(yàn)得到的優(yōu)化值進(jìn)行改良，即以濃度O.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00mg/L的IAA，附加O.50mg/LKT進(jìn)行10個(gè)組合再次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，組合IAAO.80mg/L+KT0.50mg/L預(yù)處理的苗根均從莖段切面或苗干近基部處發(fā)出，是生長素濃度過高所致，生根率達(dá)95%以上。在估計(jì)區(qū)間范圍內(nèi)，且比所有實(shí)驗(yàn)Y值都大。可見，北五味子最適宜的生根預(yù)處理培養(yǎng)基為1/8MS+IAAO.8mg/L+KT0.50mg/L。3.結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基ER+反式ZT2.20mg/L對北五味子嫩芽基部直接再生芽苗的誘導(dǎo)效果較好，反式ZT在1.502.20mg/L濃度范圍內(nèi)，芽苗誘導(dǎo)率隨著反式ZT濃度的增加而升高。北五味子植株再生采取嫩芽基部直接再生芽苗的莖段在1/8MS+IAA0.8mg/L+KT0.50mg/L的6培養(yǎng)基中進(jìn)行48h的預(yù)處理后進(jìn)行常規(guī)方法進(jìn)行生根，具有遺傳穩(wěn)定性較好，速度快，成苗率高，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，可操作性強(qiáng)，簡捷易掌握等優(yōu)點(diǎn)，達(dá)到了高效快繁的預(yù)期目標(biāo)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)處理、分析數(shù)據(jù)和再試驗(yàn)大大縮短了培養(yǎng)基的摸索周期，研究結(jié)果可為北五味子優(yōu)質(zhì)品種的工廠化育苗提供依據(jù)。三、五味子試管苗形成成品苗的管理技術(shù)及成品苗生長的生物學(xué)特性研究由于試管苗長期生長在培養(yǎng)容器中，與外界環(huán)境隔離，形成了一個(gè)獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)，這個(gè)生態(tài)系統(tǒng)與外界環(huán)境條件相比具有高溫、高濕、弱光、無菌四大差異。只要有效的使試管苗適應(yīng)這種差異，才能使之移栽成活。為提高試管苗的適應(yīng)性，促其健壯，最終達(dá)到提高試管苗移栽成活率。我們從溫、光、濕度及有無雜菌等環(huán)境因素考慮進(jìn)行煉苗。馴化開始數(shù)天內(nèi)，與培養(yǎng)環(huán)境條件相似；后期與預(yù)計(jì)栽培條件相似，逐步適應(yīng)。1.材料與方法1.l實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)上法進(jìn)行預(yù)處理48h進(jìn)行砂培生根的株苗為觀察材料。1.2方法從試管取出預(yù)處理的小芽苗，用自來水洗掉根部粘著的培養(yǎng)基，要全部除去，以防殘留培養(yǎng)基滋生雜菌。栽入盛有基質(zhì)(選用砂子和具一定的肥力的草炭土或腐殖土，事先澆透水)的育苗盤中，栽植時(shí)用一個(gè)筷子粗的木棍在基質(zhì)中插一小孔，然后將小苗插入，注意幼苗較嫩，防止弄傷，栽后把苗周圍基質(zhì)壓實(shí)，栽后輕澆薄水，扣塑料拱棚保證空氣濕度達(dá)90%以上。在育苗盤中培養(yǎng)30d后，將莖段苗從砂中輕輕挖出，結(jié)合向營養(yǎng)缽中定植，統(tǒng)計(jì)生根率。將凡在芽苗基部和芽苗莖部直接生根的植株定植于20X15cm的營養(yǎng)缽中，缽中基質(zhì)為經(jīng)400倍50%多菌靈可濕粉劑消毒過的泥炭土和細(xì)河砂(4:1)，用遮光度為50%的黑色遮陽網(wǎng)遮光，定期澆灌。待苗趨于明顯生長時(shí)揭去遮陽網(wǎng)，隨機(jī)標(biāo)記5株，每1015d進(jìn)行一次測量，包括株高、莖基直徑、標(biāo)記葉片長和寬等，取平均值。移栽場所日光溫室、塑料大棚、培養(yǎng)室。2、結(jié)果見表3表3每百株芽苗生根情況調(diào)査表培養(yǎng)切口膨大切口直接莖基部成苗率條件生根數(shù)(個(gè))生根數(shù)(個(gè))生根數(shù)(個(gè))(%)日光溫室5801297塑料大棚3524190培養(yǎng)室74838937將嫩芽基部直接再生的芽苗切割成一葉一段，接種到附加l.OOmg/LIAA和O.50mg/LKT的1/8MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48h后再進(jìn)行砂培，成苗率高達(dá)90%以上。由于供試材料數(shù)量較少，易于管理，三個(gè)聲所沒有顯著差異。以日光溫室為最佳。表4成苗生長情況調(diào)査表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>植株在營養(yǎng)缽中生長一個(gè)生長季節(jié)可達(dá)商品苗標(biāo)準(zhǔn)，根系完全發(fā)達(dá)，株高15-25cm，莖基直徑0.2-0.3cm，可用于五味子建園。但7月上旬生根培養(yǎng)后繁育的半成品苗，由于環(huán)境溫度的下降，則出現(xiàn)根系雖能繼續(xù)生長，但不成熟，以水根為主，難以越冬，另一方面，腋芽萌發(fā)后生長速度慢，新梢短縮，枝條幼嫩。權(quán)利要求權(quán)利要求1北五味子組織培養(yǎng)育苗生根方法，其特征在于利用組織培養(yǎng)技術(shù)獲得叢生苗，并截取其莖段在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)處理，之后在基質(zhì)中生根。2.按照權(quán)利要求l所述的北五味子組織培養(yǎng)育苗生根方法，其特征在于所述的生根培養(yǎng)基為1/8MS+IAA0.8mg/L+KT0.50mg/L。3.按照權(quán)利要求1或2所述的北五味子組織培養(yǎng)育苗生根方法，其特征在于所述的預(yù)處理培養(yǎng)條件溫度20—24。C，暗處理48h。4.按照權(quán)利要求1或2所述的北五味子組織培養(yǎng)育苗生根方法，其特征在于所述的基質(zhì)為泥炭土、細(xì)河砂、腐殖質(zhì)、珍珠巖或蛭石中的任一種或組合。5.按照權(quán)利要求4所述的北五味子組織培養(yǎng)育苗生根方法，其特征在于所述的基質(zhì)為泥炭土和細(xì)河砂。6.按照權(quán)利要求5所述的北五味子組織培養(yǎng)育苗生根方法，其特征在于所述的基質(zhì)為泥炭土細(xì)河砂=4:1。全文摘要本發(fā)明涉及一種植物繁殖技術(shù)，即北五味子組織培養(yǎng)育苗生根方法。它是利用組織培養(yǎng)技術(shù)獲得叢生苗，并截取其莖段在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)處理，之后在基質(zhì)中生根。具有繁殖快，繁殖系數(shù)大，管理方便，生產(chǎn)成本低，成苗率高，培養(yǎng)周期短，可周年生產(chǎn)和有利于實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)的特點(diǎn)。文檔編號A01H4/00GK101485293SQ200910300749公開日2009年7月22日申請日期2009年3月8日優(yōu)先權(quán)日2009年3月8日發(fā)明者夏廣清,朱俊義,秦佳梅,顧地周申請人:朱俊義