專利名稱：Tt1基因在提高植物抗寒性中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TTl基因在提高植物抗寒性中的用途。
背景技術(shù)：
植物對環(huán)境變遷及不良環(huán)境有足夠的適應(yīng)性和抵抗能力，這種抗逆性既受系統(tǒng)發(fā) 育的遺傳基因所控制，又受個體發(fā)育中的生理生態(tài)所制約。溫度作為重要的環(huán)境因子之一， 在植物遺傳背景限制的前提下，對植物某些生長發(fā)育過程起著決定性作用。低溫使植物受 到不同程度的傷害，以至引起死亡。植物抵抗低溫傷害的能力就是植物的抗寒性。植物種類繁多，分布區(qū)域廣泛，常受到低溫的為害。但是不同種類或同一種類不同 品種的植物對低溫的抵抗能力不同。生產(chǎn)上，常用抗寒劑來提高抗寒性，但由于抗寒劑對植 物幼苗生長有一定的影響，同時在土壤和植物體內(nèi)有一定的殘留，長久使用會影響生態(tài)環(huán) 境。因此，研究植物的抗寒性，利用生物技術(shù)手段篩選和培育抗寒品種，不但有利于生態(tài)環(huán) 境的保護，對于培育和栽培那些受低溫限制而分布區(qū)域窄小的，而經(jīng)濟價值又高的植物也 具有重大意義。作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種嚴(yán)重的自然災(zāi)害，低溫寒害涉及面廣，主要包括糧食作物、蔬 菜、果樹及其它許多經(jīng)濟作物，全世界每年受此災(zāi)害造成的損失十分巨大水稻起源于熱帶，屬喜溫作物，是我國的主要糧食作物，種植面積居各種作物之首 位，達5億多畝。適宜的溫度是水稻生長必需的環(huán)境條件，由于水稻分布地區(qū)極廣，寒害現(xiàn) 象也特別突出。據(jù)統(tǒng)計，全國每年因低溫損失的稻谷達30億 50億公斤。早春育秧中的 低溫爛秧問題，幾乎年年都有發(fā)生，不僅造成稻種的巨大損失，延誤農(nóng)時，嚴(yán)重影響水稻的 高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)，而且限制水稻生產(chǎn)面積的擴大。小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物，主要分布在北緯30°以北。根據(jù)生長習(xí)性可分為冬 小麥和春小麥，冬小麥相對春小麥來說營養(yǎng)期長，從營養(yǎng)期到生殖期生長緩慢，其間經(jīng)歷一 個冬天漫長的低溫階段。北方冬麥區(qū)占全國麥田總面積的59%，該麥區(qū)北部冷空氣活動頻 繁，冬季絕對溫度低，氣候嚴(yán)寒減小了冬小麥適宜種植的地理分布區(qū)域，使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)遭受很 大的損失。除此之外，早春低溫冷害是玉米農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要的氣象災(zāi)害之一。北方春玉米區(qū) 時常發(fā)生，災(zāi)害發(fā)生時減產(chǎn)15%以上，玉米質(zhì)量也大受影響。黃瓜、西瓜、番茄等蔬菜作物， 生長前期遭受寒潮襲擊，其綠色組織被破壞，分枝出芽受阻，生長遲緩或停止，甚至植株死亡。近幾十年來，分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，從一定程度上揭示了植物抗寒機理。1、脯氨酸與植物抗寒脯氨酸廣泛存在于植物體內(nèi)。許多植物在低溫、干旱、和高鹽等生物脅迫下，體內(nèi) 游離脯氨酸含量都增加。根據(jù)目前的研究，脯氨酸提高植物抗寒力的作用體現(xiàn)在第一，脯 氨酸作為水溶性最大的氨基酸(溶解度162. 3g，25°C )，是理想的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。植物 在低溫脅迫下通過提高體內(nèi)脯氨酸含量，增加了細胞液的濃度，對細胞起保護作用。第二，由于脯氨酸在水溶液中可以形成親水膠體，產(chǎn)生一個可與蛋白質(zhì)相互作用的疏水骨架，對 蛋白質(zhì)形成保護。第三，脯氨酸可以激發(fā)體內(nèi)過氧化氫酶、超氧化物酶的活性，其自身也可 以鰲合單線態(tài)氧，高效地清除低溫脅迫下產(chǎn)生的羥自由基，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)、DNA和膜。第 四，植物從脅迫條件下恢復(fù)時，脯氨酸還可以作為氮、碳以及還原力的一種快速補償來源。Deirdre Gleeson等人把脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶-Δ 1-吡咯啉-5-羧酸合成 酶(P5CQ基因超量表達轉(zhuǎn)入落葉松，使脯氨酸超量表達，將轉(zhuǎn)基因落葉松和對照同時放在 4°C下，對照生長受到抑制，而轉(zhuǎn)基因植株能較好的生長；Nanjo等人把脯氨酸降解途徑中 的關(guān)鍵酶-脯氨酸脫氫酶的反義基因AtproDH的cDNA轉(zhuǎn)到擬南芥中，很好地抑制了此酶的 產(chǎn)量，從而抑制脯氨酸的降解，提高了胞內(nèi)脯氨酸水平，增強了植株的抗?jié)B透性，結(jié)果顯著 提高轉(zhuǎn)基因植株對低溫的耐受性。低溫脅迫下，植物體內(nèi)游離脯氨酸積累作為一種普遍現(xiàn)象，其積累量已被廣泛應(yīng) 用于抗寒力鑒定。許多學(xué)者都通過測定低溫下植物體內(nèi)脯氨酸含量的方法，鑒定不同品種 的抗寒性的強弱。脯氨酸的積累對植物抗寒的作用也逐漸被揭示，但是關(guān)于低溫對脯氨酸 代謝的調(diào)節(jié)機理了解很少。2、質(zhì)膜透性與植物抗寒細胞膜不僅是分隔細胞質(zhì)和胞外環(huán)境的屏障，而且也是細胞與環(huán)境發(fā)生物質(zhì)交換 的主要通道，又是細胞感受環(huán)境變化刺激的部位。細胞膜的選擇透性是其維持生理功能的 最重要的條件之一。各種逆境傷害都會造成質(zhì)膜選擇透性的改變或喪失，例如低溫、冰凍、 干旱脫水等導(dǎo)致的細胞膜機械損傷以及逆境和衰老過程中的膜脂過氧化作用，都可以增大 細胞膜通透性。因此，細胞質(zhì)膜透性的測定常作為植物抗性研究中的一個重要生理指標(biāo)。當(dāng)質(zhì)膜的選擇透性因逆境傷害而明顯改變或喪失時，細胞內(nèi)的物質(zhì)(尤其是電解 質(zhì))大量外滲，從而引起組織浸泡液的電導(dǎo)率發(fā)生變化，通過測定外滲液電導(dǎo)率的變化，就 可反映出質(zhì)膜的傷害程度和所測材料抗逆性的大小。Dexter首先用電導(dǎo)法測定了植物的抗 寒性，經(jīng)過不斷地改進和完善，目前已得到廣泛應(yīng)用。綜上可知，寒害已成為世界各國共同關(guān)注的問題。對于植物抗寒機制的研究和抗 寒基因工程方面的工作已有表明通過生物技術(shù)手段，將抗寒機制中相關(guān)基因?qū)胫参矬w內(nèi) 得到抗寒轉(zhuǎn)基因植株可能會成為植物抗寒改良的一種新的育種途徑，對于作物的生產(chǎn)和抗 寒種質(zhì)的篩選具有重要的意義。但是，目前本領(lǐng)域很少有可供選用的抗寒基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為提高植物抗寒性的轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域提供一種新的 有效選擇。本發(fā)明解決該技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了 TTl基因在提高植物抗寒性中的用 途。其中，上述TTl基因的核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或⑵在⑴限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。也能提高植物抗寒性。
本發(fā)明同時提供了 TTl基因編碼的多肽在提高植物抗寒性中的用途。上述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在⑴限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。本發(fā)明還提供了一種培育抗寒植物的方法。該方法包括以下步驟(1)將TTl基因可操作地連于載體上的表達調(diào)控序列后，形成所述TTl基因的重組 載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉(zhuǎn)入植物細胞；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化細胞，然后將轉(zhuǎn)化細胞培育成轉(zhuǎn)基因抗寒植株及其后代，所述 后代包括植物種子及植物組織。其中，上述植物可為一般的各種農(nóng)作物，如常見禾本科或十字花科植物。本發(fā)明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示，該 基因來源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥屬(Brassica)的植物油菜 (Brassicanapus)，以油菜中的atp6基因為誘餌蛋白，根據(jù)酵母雙雜交方法，篩選到油菜中 的一個EST序列，再根據(jù)這段篩選到的序列，通過5’RACE的方法獲得序列表中SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。然后根據(jù)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列設(shè)計一對PCR引物，從油菜 cDNA中擴增SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。在本發(fā)明中，“在SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核 苷酸衍生序列”的TTl基因序列一般是指編碼具有SEQ ID NO. 1所編碼的蛋白活性的多肽 的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指所述序列中有一個或多個密碼子被編碼相同 氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. 1同 源性低至約89%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO. 1所述的序列。另外，“在SEQ ID NO. 1 中的核苷酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生序列”的含義還包括能在中度 嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳的在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO. 1核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該 術(shù)語還包括與SEQ IDN0. 1中的核苷酸序列的同源性至少80 %，較佳地至少89 %，更佳地至 少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。在本發(fā)明中的相同功能是指提高植物的抗寒性。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的SEQ ID NO. 1相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1 中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1 90個，較佳地1 60個，更佳地1 20個，最佳地1 10個)核苷酸的缺失、插入和/或 取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為 10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。比如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其編碼的 多肽也能提高植物的抗寒性。本發(fā)明所述重組載體，是將TTl基因插入到載體中獲得，上述載體可選用本領(lǐng)域 已知的各種載體，尤其是真核表達載體(如PBI121或pCAMBIA2301)。本發(fā)明用上述重組載 體轉(zhuǎn)化宿主植物細胞，篩選獲得轉(zhuǎn)化細胞。然后將轉(zhuǎn)化細胞培育成轉(zhuǎn)基因抗寒植株及其后 代，所述后代包括植物種子及植物組織。本發(fā)明中所述的“可操作地連于”表示如下情況即線性DNA序列的某些部分能夠 影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動子控制序 列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位 置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前 導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 TTl基因在提高植物抗寒性方面的用途， 在本發(fā)明的實施例中也通過實驗證明轉(zhuǎn)入了 TTl基因并過表達的植物經(jīng)低溫處理后較野 生型的電導(dǎo)率明顯更低，脯氨酸含量更高，表明其抗寒性有了顯著的提高。本發(fā)明培育出抗 寒植物的方法也簡便而有效，為提高植物抗寒性提供了新的有效選擇，具有好的應(yīng)用前景。


圖1、轉(zhuǎn)基因水稻植株中潮霉素hpt基因的PCR電泳檢測結(jié)果。從左至右依次為分 子量 Maker (Μ,片段從上到下依次為 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)，陽性對 照(+)，野生型陰性對照(_)，待檢測植株1 6號。圖2、轉(zhuǎn)基因水稻植株中TTl基因的PCR電泳檢測結(jié)果。從左至右依次為分子 量 Maker (Μ,片段從上到下依次為 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)，陽性對照 (+)，野生型陰性對照(_)，待檢測植株1 5號)。圖3、轉(zhuǎn)基因水稻植株中TTl基因的RT-PCR電泳檢測結(jié)果。從左至右依次為分子 量Maker (M，片段大小依次為2000bp ； 1000 ；750bp ；500bp ；250bp ；IOObp)，野生型陰性對照 1，待檢測植株2 5。圖4、低溫處理24h后，水稻生長情況。左圖為水稻低溫處理前(左為野生型，右為 轉(zhuǎn)TTl型)；右圖為低溫處理后(左為野生型，右為轉(zhuǎn)TTl型)。圖5、水稻的電導(dǎo)率檢測結(jié)果。圖6、水稻的脯氨酸含量檢測結(jié)果。圖7、轉(zhuǎn)基因油菜植株中TTl基因的PCR電泳檢測結(jié)果。從左至右依次為分子量 Maker (Μ,片段從上到下依次為 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)，待檢測植株
1 4號)。圖8、TT1基因過量表達甘藍型油菜的半定量RT-PCR檢測結(jié)果，Zn-OE為TTl基因 過量表達甘藍型油菜，WT為野生型油菜。圖9、油菜的脯氨酸含量檢測結(jié)果。圖10、油菜的電導(dǎo)率檢測結(jié)果。
具體實施例方式下面通過實施例并結(jié)合附圖，進一步說明而不限定本發(fā)明。下述實施例中，凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的 常規(guī)條件，例如Sambrook，Russell的分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。下述實施 例中，所用農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚堿型菌系的LBA4404菌株；大 腸桿菌(E. coli)采用Dffia菌株，菌株均購自于Qiagen公司。載體pBI 121購自于Clontech 公司。其余化學(xué)實際均為市售分析純。下述實施例中，“SEQ ID N0. 1”單獨出現(xiàn)時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解1其為“SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列”的簡稱。實施例一、使用TTl基因提高水稻抗寒性一、TTl基因的克隆及獲取以油菜中的atp6(genebank gi :89279377)基因為誘餌蛋白，根據(jù)酵母雙雜交方 法(見Clontech公司所公開的資料)，篩選到油菜中的一個EST序列(SEQ ID N0:2所示)， 再根據(jù)這段篩選到的序列，通過5’ RACE(見Takara公司所公開的資料)的方法獲得本發(fā) 明所述提高植物抗寒性的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。根據(jù)SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列設(shè)計引物，上游引物(SEQID NO. 3) :5，-ATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO. 4) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。然后經(jīng)PCR從油菜cDNA中擴增SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。PCR程序如下1.95 °C4min(預(yù)變性)
2.95 °C30s(變性)
3.53 °C30s(復(fù)性)
4.72 °C50s(延伸)
5.2 4步驟循環(huán)30次
6.72 0C5min(終延伸)
7.4 0C保存。對PCR產(chǎn)物純化(見Qiagen公司所公開的PCR產(chǎn)物純化資料)，經(jīng)測序驗證，得到 SEQ IDN0. 1的基因序列。二、過表達TTl基因的水稻植株制備1、采用的水稻材料(Oryza sativa L.)為粳稻日本晴，為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究 所保存。農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚堿型菌系的LBA4404菌株；大腸 桿菌(E. coli)采用Dffia菌株。根據(jù)SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列設(shè)計引物，構(gòu)建目的基因過量表達重組質(zhì)粒上游引物(SEQID N0. 5) :5，-CGC GGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID N0. 6) :5，-CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。經(jīng)PCR，從油菜cDNA中擴增完整的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，PCR程序如 下1.95 0C4min (預(yù)變性)
2.95 0C30s (變性)
3.53 0C30s (復(fù)性)
4.72 0C50s (延伸)
5.2 4步驟循環(huán)30次
6.72 0C5min (終延伸)
7.4 0C保存。 對PCR產(chǎn)物純化(見Qiagen公司所公開的資料)，然后用BamHl與Mcl酶切，膠 回收，與載體PBI121連接(連接位點=BamHl與Sacl)，獲含SEQ ID NO. 1的過量表達重組 質(zhì)粒。在大腸桿菌Dffia中繁殖后，提取質(zhì)粒(見Qiagen公司公開資料)，將含SEQ ID NO. 1的過量表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中。2、外植體培養(yǎng)方法幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代取田間開花后12-15天的水稻未成熟穎果，剝殼后 在75%酒精中浸泡1分鐘，用無菌水沖洗干凈后，0. 升汞滅菌20分鐘，再用無菌水沖洗 干凈。在超凈工作臺上晾干，用鑷子剝?nèi)∮着呓臃N在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NB+2，4-D 2. 5mg/L)上， 于^TC下暗培養(yǎng)。一周后統(tǒng)計愈傷組織的誘導(dǎo)情況并進行繼代，以后每2周繼代一次。成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代選取外觀健康，飽滿，無病斑的成熟種子脫去穎 殼，75%酒精中浸泡1分鐘，用無菌水沖洗干凈后，0. 1 %升汞滅菌20分鐘，再用無菌水沖洗 干凈。在超凈工作臺上晾干，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NB+2，4-D 2. 5mg/L)上，于^TC下暗培養(yǎng)。 2周后統(tǒng)計愈傷組織的誘導(dǎo)情況并進行繼代，以后每2周繼代一次。3、水稻基因轉(zhuǎn)化實驗方法3. 1、工程菌的活化用無菌牙簽在平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，放在IOmlYEP培養(yǎng)液(酵母提取物IOg+ 胰蛋白胨5g+氯化鈉IOg+加水至IL+利福平50 μ g/mL+潮霉素25 μ g/mL)中培養(yǎng)；或著 取保存于-20°C冰箱無菌農(nóng)桿菌菌液50-100 μ 1于2ml的含相應(yīng)抗生素的YEP培養(yǎng)基上， 250r/min, 培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)液300 μ 1于3ml的含相應(yīng)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基 中，在250r/min，28°C的條件下遮光振動培養(yǎng)，至菌液達0D600 = 0. 5左右，即可用于轉(zhuǎn)化。上述含目的基因的菌液在無菌的50ml的離心管中以5000r/min離心5分鐘后回 收菌體，用30ml的NBC0(NB+2，4-D 2. Omg/L+乙酰丁香酮100 μ mol/L)液體培養(yǎng)基重懸含 目的基因的菌體。選擇生長狀態(tài)良好的，顆粒狀胚性愈傷組織用無菌鑷子將其適當(dāng)夾小，創(chuàng) 造傷口，然后放在菌液中浸泡，一般浸染時間為10 30min，之后放入有濾紙的平皿中吸干 多余菌液。3. 2、共培養(yǎng)將吸干菌液的愈傷置于NBC0(NB+2，4-D 2. Omg/L+乙酰丁香酮100 μ mol/L)固體 培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)培養(yǎng)基上放1層濾紙，濾紙上放愈傷組織。22 25°C暗培養(yǎng)2 3天，直 至愈傷組織上出現(xiàn)少量菌斑為止。3. 3、脫菌與篩選共培養(yǎng)的愈傷組織放在廣口瓶中，用無菌水清洗至清澈，再浸泡于含頭孢霉素 500mg/lNBC0液體培養(yǎng)基中，在搖床上中速振蕩30-60min，棄液，將愈傷組織用無菌濾紙吸 干或在超凈工作臺上吹干后接放在一篩培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)三周，再轉(zhuǎn)入二篩培養(yǎng)基上暗培養(yǎng) 三周，溫度控制在25 27°C。3. 4、分化與生根選擇將兩次篩選后新長出的抗性愈傷組織接種到預(yù)分化培養(yǎng)基(NB+KTlmg/ L+NAAO. 25mg/L)上，暗培養(yǎng) 10 天。再轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基(NB+KTlmg/L+NAAO. 25mg/L+6-BAlmg/ L+潮霉素25mg/L)上光照培養(yǎng)，用日光燈每天照明12小時，溫度控制在25 27°C。約1 2個月，可獲得2cm左右高的幼苗。將幼苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，當(dāng)根長到2cm左右高時 取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽于大田。3. 5、轉(zhuǎn)基因水稻的檢測3. 5. 1、取一小片轉(zhuǎn)基因水稻植株新鮮葉片，抽提總DNA(見Qiagen公司所公開的資料)，以提取的DNA做模板，分別進行檢測。轉(zhuǎn)基因水稻植株中潮霉素hpt基因的PCR檢測hpt基因的PCR引物序列為上游引物(SEQID NO. 7) :5，-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3，下游引物(SEQID NO. 8) :5，-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3，
0096]PCR程序如下0097]1.95 °C4min(預(yù)變性)0098]2.95 °C30s(變性)0099]3.53 °C30s(復(fù)性)0100]4.72 °C50s(延伸)0101]5.2 4步驟循環(huán)37次0102]6.72 °C5min(終延伸)0103]7.4 °C保存
0104]以上PCR反應(yīng)完成，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測，目的基因已轉(zhuǎn)入水稻中，見圖1。
0105]轉(zhuǎn)基因水稻植株中TTl基因的PCR檢測
0106]TTl基因的PCR引物序列為
0107]上游引物(SEQID NO. 9) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，
0108]下游引物(SEQID NO. 10) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATATTG-3，
0109]PCR程序如下0110]1.95 0C4min(預(yù)變性)0111]2.95 0C30s(變性)0112]3.53 0C30s(復(fù)性)0113]4.72 0C50s(延伸)0114]5.2 4步驟循環(huán)37次0115]6.72 0C5min(終延伸)0116]7.4 0C保存以上PCR反應(yīng)完成，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測，有目標(biāo)條帶出現(xiàn)，表明目的基因已 轉(zhuǎn)入水稻中，見圖2。3. 5. 2、RT-PCR 檢測提取了經(jīng)PCR檢測為陽性的植株和野生型植株，抽提植株的總RNA(見Qiagen公 司所公開的資料)，進行RT-PCR檢測。檢測轉(zhuǎn)基因植株是否在RNA水平上得到了表達。One 乂印 RT-PCR 的方法在RNase-free 0. 2ml PCR 管中加入(50 μ 1 體系)
0122]IOXOne Step RT-PCR buffer5μ 1
0123]MgC12(25mM)10 μ 1
0124]dNTP Mixture(IOmM)5μ 1
0125]RNase Inhibitor (40U/μ 1)1 μ 1
0126]AMV Rtase XL (5U/μ 1)1 μ 1
0127]AMV-Optimized Taq(5U/yl)1 μ 1
上游特異引物QO μ M)1 μ 1下游特異引物(20 μ Μ)1 μ 1Total RNA ( ^ lug)1 μ 1RNase Free ddH2024 μ 1Total50 μ 1/Sample RT-PCR的反應(yīng)程序為1.50 0C30min
2.94 0C3min
3.94 0C40s
4.58 0C30s
5.72 0C40s
6.3 5步驟循環(huán)40次
7.72 0C5min
8.4 0C保存在陰性對照植株中沒有擴增出特異條帶，而在待檢測植株中擴增出與目的片段大 小一致條帶，證明在顯示條帶的植株中，轉(zhuǎn)入的TTl基因發(fā)生了轉(zhuǎn)錄，在RNA水平上得到了 表達，參見圖3。將檢測確定的轉(zhuǎn)基因植株及未檢測出的陰性對照移至溫室大棚中，使其自交結(jié) 實，以備單株收種。三、過量表達TTl水稻抗寒性實驗1、試驗材料的培養(yǎng)隨機選取健壯飽滿的轉(zhuǎn)基因型和野生型水稻種子，用5%甲醛溶液消毒10分鐘， 洗凈后分別浸入盛有IOOmL滅菌水的燒杯中，在下浸泡40h。將不同種類的種子分別 播于盛有3cm厚泥土的發(fā)芽盒中，每盒播50粒，每組播2盒。置于人工氣候箱中栽培，光強 為40001x，每天光照12h，溫度保持在25士 1°C。當(dāng)水稻苗長至5葉1心期時，將不同組的幼 苗分為2組，一組繼續(xù)在原有條件下培養(yǎng)，作為對照(CK)，一組置于另一人工氣候箱中，將 溫度設(shè)置為3 士 1°C進行低溫脅迫處理Mh，再移回原培養(yǎng)箱恢復(fù)生長Id。然后進行生理指 標(biāo)的檢測。2、秧苗冷害調(diào)查低溫處理后，以卷葉、白尖、倒伏為典型受害癥狀(參見圖4)，調(diào)查經(jīng)低溫處理的 每盒受害株數(shù)，計算受害率。受害率(％)=受害株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)X100%。結(jié)果見表1。表1低溫處理對水稻的影響
權(quán)利要求
1.TTl基因在提高植物抗寒性中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
3.TTl基因編碼的多肽在提高植物抗寒性中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的用途，其特征在于所述的植物為禾本科或十字花科的植物。
6.一種培育抗寒植物的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將TTl基因可操作地連于載體上的表達調(diào)控序列后，形成所述TTl基因的重組載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉(zhuǎn)入植物細胞；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化細胞，然后將轉(zhuǎn)化細胞培育成轉(zhuǎn)基因抗寒植株及其后代，所述后代 包括植物種子及植物組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TT1基因在提高植物抗寒性中的用途。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為提高植物抗寒性的轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域提供一種新的有效選擇。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了TT1基因在提高植物抗寒性方面的用途，經(jīng)實驗證明轉(zhuǎn)入了TT1基因并過表達的植物對寒冷逆境表現(xiàn)出了良好的抗性。本發(fā)明培育出抗寒植物的方法也簡便而有效，為本領(lǐng)域提供了新的有效選擇。
文檔編號A01H5/10GK102115749SQ20091031259
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者楊毅 申請人:四川貝安迪生物基因工程有限公司