專利名稱：用于豬胚胎移植的器械的制作方法
技術(shù)領域：
本實用新型涉及一種用于豬胚胎移植的器械，屬于胚胎移植領域。
背景技術(shù)：
豬胚胎移植試驗成功最早于1951年由Kvashickii報道。到20世紀60年代，已 經(jīng)基本建立了外科手術(shù)方法采集和移植胚胎的技術(shù)。到70年代以后，北美和歐洲開始將胚 胎移植技術(shù)應用于向閉鎖豬群引進外血和國際間的引種。80年代轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的出現(xiàn)， 促進了胚胎移植技術(shù)的應用和發(fā)展。1985年Hammer等人，首先將人生長激素基因應用顯微 注射技術(shù)注入豬的受精卵，然后應用胚胎移植技術(shù)將其移入受體母豬的輸卵管，得到轉(zhuǎn)基 因豬。這之后，國際上各種轉(zhuǎn)基因的胚胎，包括用顯微注射法、精子介導法、體細胞核移植法 和其它方法獲得的轉(zhuǎn)基因胚胎，通過胚胎移植技術(shù)生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因豬；各種胚胎工程獲得的 胚胎，如體外受精的胚胎、胚胎細胞核移植和體細胞核移植的重構(gòu)胚胎，通過胚胎移植技術(shù) 獲得"試管豬"和"克隆豬"。 我國最早建立豬胚胎移植技術(shù)的是湖北省農(nóng)科院魏慶信等人，1989年他們將豬的 囊胚期胚胎移入受體母豬的子宮角，得到胚胎移植的后代；1992年，將體外受精的胚胎，移 植到母豬的輸卵管，得到"試管豬"；1997年，將胚胎細胞核移植的重構(gòu)胚胎，移植到母豬的 輸卵管，得到"克隆豬";先后將七種外源基因?qū)胴i的受精卵，通過胚胎移植技術(shù)得到了相 應整合并表達的轉(zhuǎn)基因豬。中國農(nóng)科院畜牧研究所馮書堂等人，于1990年建立了豬的胚胎 移植技術(shù)，并得到胚胎移植的仔豬。進入21世紀以來，中國農(nóng)業(yè)大學、東北農(nóng)業(yè)大學、上海 農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所等單位，先后應用胚胎移植技術(shù)，將克隆胚胎或轉(zhuǎn)基因的胚胎移入 母豬的生殖道，獲得克隆豬或轉(zhuǎn)基因豬。 國內(nèi)外豬胚胎移植已有技術(shù)的特征是進行輸卵管移植時，用移卵管直接從輸卵 管傘部插入輸卵管；進行子宮角移植時，用移卵管直接插入子宮角。該技術(shù)的缺陷有三點 1、移卵管難以插入較深的部位，尤其是進行輸卵管移植時，很難插入輸卵管的壺 腹部，至使胚胎不能移到最合適的部位，從而影響胚胎移植的成功率。 2、移卵管直接從輸卵管傘部插入輸卵管，或直接插入子宮角，在插入的過程中，由 于輸卵管內(nèi)膜或子宮角內(nèi)膜上粘液的吸附作用，很容易造成胚胎的丟失，從而影響胚胎移 植的效率。 3、移卵管直接從輸卵管傘部插入輸卵管，或直接插入子宮角，在操作的過程中稍 有不慎，或受體母豬稍有騷動，由于移卵管為玻璃質(zhì)地，很容易折斷或破碎，從而造成移植 失敗，嚴重的還會造成受體母豬生殖道的損傷。 專利CN200520103507. 6涉及的是人的胚胎移植，CN200510105236. 2涉及的是牛 的胚胎移植，但是它們均為非手術(shù)移植，其中的外套管只是用來保護其內(nèi)芯。同時由于各種 動物生殖道的形態(tài)結(jié)構(gòu)不相同，胚胎移植所用的器械和方法也不相同，如果應用以上兩篇 專利的技術(shù)方案不能進行豬的胚胎移植，也就不能克服已有豬胚胎移植技術(shù)的三點缺陷。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的在于提供一種用于豬胚胎移植的器械，采用手術(shù)移植，有效地 克服了已有豬胚胎移植技術(shù)的三點缺陷，大大提高了胚胎移植的成功率，操作方便。 用于豬胚胎移植的器械，包括移卵管，其特征在于還包括輸卵管移植用外套管或 子宮角移植用外套管，移卵管在各外套管內(nèi)部；輸卵管移植用外套管是長65-70mm、管腔直 徑3-4mm、管壁厚0. 1_0. 2mm的硬質(zhì)、有彈性的塑料細管，兩端磨平滑；子宮角移植用外套管 是長65-70mm、管腔直徑3-4mm、管壁厚0. 1_0. 2mm的硬質(zhì)、有彈性的塑料細管，其一端剪成 15° -20°斜面，另一端磨平滑。 本實用新型的有益效果是本實用新型用于l-4細胞期胚胎的移植時，首先將輸 卵管移植用外套管插入受體母豬輸卵管的壺腹部；用于4細胞期以上胚胎的移植時，首先 將子宮角移植用外套管插入受體母豬子宮角的合適部位；然后將吸有胚胎的移卵管，通過 外套管插入到受體母豬輸卵管的壺腹部或子宮角的合適部位，再實施移植。本實用新型有 效地克服了已有豬胚胎移植技術(shù)的三點缺陷 (1)由于外套管為塑料質(zhì)地，可以將其捋進輸卵管很深的部位，使胚胎能移到最合 適的部位，從而大大提高胚胎移植的成功率。 (2)由于移卵管是通過外套管插入移植部位，移卵管在插入的過程中不與輸卵管 內(nèi)膜或子宮角內(nèi)膜接觸，從而克服了輸卵管內(nèi)膜或子宮角內(nèi)膜上的粘液對移卵管內(nèi)胚胎的 吸附作用，不會造成胚胎的丟失，有效提高了胚胎移植的效率。 (3)由于外套管為塑料質(zhì)地，在插入輸卵管或子宮角的過程中，即使操作者有些許 不慎、或受體母豬有騷動，也不會造成外套管的折斷或破碎，不會因此造成的移植失敗或受 體母豬生殖道的損傷。

圖1為本實用新型實施例輸卵管移植用外套管示意圖。 圖2為本實用新型實施例子宮角移植用外套管示意圖。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖和實施例對本實用新型做進一步的說明。 用于豬胚胎移植的器械包括移卵管、輸卵管移植用外套管或子宮角移植用外套 管，移卵管在各外套管內(nèi)部；輸卵管移植用外套管是長65-70mm、管腔直徑3-4mm、管壁厚 0. 1-0. 2mm的硬質(zhì)、有彈性的塑料細管，兩端磨平滑；子宮角移植用外套管是長65-70mm、 管腔直徑3-4mm、管壁厚0. 1-0. 2mm的硬質(zhì)、有彈性的塑料細管，在其一端用剪刀剪成 15° -20°斜面，另一端磨平滑。外套管沖洗干凈后自然干燥，用前在紫外燈下滅菌。 用于l-4細胞期胚胎的移植時，首先將本實用新型實施例的輸卵管移植用外套管 插入受體母豬輸卵管的壺腹部；用于4細胞期以上胚胎的移植時，首先將本實用新型實施 例的子宮角移植用外套管插入受體母豬子宮角的合適部位；然后將吸有胚胎的移卵管，通 過外套管插入到受體母豬輸卵管的壺腹部或子宮角的合適部位，再實施移植。 具體步驟如下 (1)輸卵管移植方法受體母豬麻醉保定后手術(shù)切口，將輸卵管和卵巢引出切口之外；先將輸卵管移植用外套管從輸卵管傘口插入輸卵管，用手將輸卵管沿外套管向前捋， 直至壺腹部；然后將吸有胚胎的移卵管插入外套管，直至用手能感覺到移卵管已穿過外套 管，再將外套管退出1-2公分；最后將移卵管內(nèi)的胚胎和培養(yǎng)液移入輸卵管內(nèi)；移植完畢， 小心將移卵管和外套管退出，復原輸卵管傘，按常規(guī)縫合創(chuàng)口 ； (2)子宮角移植方法受體母豬麻醉保定后手術(shù)切口，將子宮角引出切口之外；先 將子宮角移植用外套管15° -20°斜面端從子宮角的合適部位避開血管插入子宮角內(nèi)腔， 外套管進入子宮角內(nèi)腔的深度4-5公分，用手感確認外套管在子宮腔內(nèi)；然后將吸有胚胎 的移卵管插入外套管，直至用手能感覺到移卵管已穿過外套管0. 5-1公分；最后將移卵管 內(nèi)的胚胎和培養(yǎng)液移入子宮角內(nèi)；移植完畢，小心將移卵管和外套管退出，復原子宮角，按 常規(guī)縫合創(chuàng)口。 所述的胚胎，包括豬的體內(nèi)受精的胚胎、體外受精的胚胎、胚胎細胞核移植或體細
胞核移植所形成的重構(gòu)胚胎、轉(zhuǎn)基因的胚胎或囊胚注射所形成的嵌合胚胎。 實施例1優(yōu)良種豬的胚胎移植 以優(yōu)良純種母豬做供體，以不能做種用的雜交母豬做受體，將供體母豬的胚胎移 植給雜交母豬受體，目的在于用雜交母豬生產(chǎn)優(yōu)良純種豬。其操作步驟如下 1、供體母豬的超數(shù)排卵和配種 在供體母豬發(fā)情周期的第15-18天，肌肉注射孕馬血清促性腺激素PMSG 1000IU， 72小時后注射絨毛膜促性腺激素HCG 800IU，做超數(shù)排卵處理。發(fā)情后用本品種公豬配種。 2、受體母豬的同期發(fā)情 在受體母豬發(fā)情周期的第15-18天，在供體母豬超數(shù)排卵處理的同時，肌肉注射 PMSG 800IU，72小時后注射HCG 600IU。 或者在大群內(nèi)選擇與供體母豬同一天發(fā)情的母豬做受體。 3、供體母豬胚胎的采集 在供體母豬配種后的第3-6天，采集胚胎。
(1)供體豬的麻醉和保定 供體豬上腭牽拉，限制活動，按20-30mg/kg (每公斤體重毫克)戊巴比妥鈉 (2. 5% )耳靜脈注射，進行全身麻醉。 麻醉到位后仰放在手術(shù)保定架上，四肢固定。為防止手術(shù)過程中，豬的掙扎、彈動， 要用繩索將四肢和頭部捆綁牢靠。為使腹腔內(nèi)臟向前傾斜，方便手術(shù)，手術(shù)臺要前低(頭 低)后高(尾高)。手術(shù)過程根據(jù)需要肌肉或靜脈滴注適量的鹽酸氯胺酮。
(2)手術(shù)部位及其消毒 用肥皂水和毛刷洗刷腹部和大腿內(nèi)側(cè)部，水洗后用毛巾揩干凈。手術(shù)部位一般選 擇在倒數(shù)第2、3個乳頭之間，先用電剪或毛剪在術(shù)部剪毛，應剪凈毛茬，用清水清洗凈術(shù) 部，然后涂以2_4%的碘酒，待干后再用70% _75%的酒精棉脫碘，消毒程序是碘酊棉球一 酒精棉球，由內(nèi)向外；蓋創(chuàng)巾于術(shù)部，使預定的切口暴露在創(chuàng)巾開口的中部。 (3)手術(shù)方法 沿腹中線，盡量避開血管，切開皮膚5-8cm左右，沿著切口左右鈍性分離脂肪和肌 肉層，使腹膜露出后，用鈍頭剪刀剪開腹膜。切開腹膜應避免損傷腹內(nèi)臟器，先用鑷子提起 腹膜，在提起部位作一切口，然后用另一只手的食指深入腹膜引導手術(shù)刀(向外切口 )或用
5外科剪把腹膜切開或剪開。術(shù)者將食指及中指由切口伸人腹腔，在與骨盆腔交界的前后位 置觸摸子宮或子宮角，摸到后用二指夾持，牽引至創(chuàng)口的表面。
(4)采集胚胎 根據(jù)沖卵時間的不同，或近或遠，在距子宮-輸卵管接合部30-70cm的子宮角背面 沒有血管的部位用眼科剪剪個小孔，插入子宮角沖卵管，開口向?qū)m管結(jié)合部方向，另一端開 口接表面皿或平皿。用注射器從宮管結(jié)合部向子宮角注入30-50ml沖卵液。沖卵液流經(jīng)子 宮角，將胚胎帶入接卵的表面皿或平皿。 再將另一側(cè)子宮角引出切口之外，用同樣的方法沖取胚胎。 4、胚胎的收集及質(zhì)量檢查 將接卵的表面皿置于實體顯微鏡下，用低倍鏡的大視野在沖卵液中找到胚胎。豬 胚胎直徑為150iim左右，肉眼觀察只有針尖大小，為一球形體，在鏡下呈圓形，其外層是透 明帶，它在沖卵液內(nèi)的折光性比其他不規(guī)則組織碎片折光性強，色調(diào)為灰色。揀卵管先吸入 少許磷酸緩沖液PBS再吸人卵，在表面皿的不同位置沖洗卵3-5次。依次在第二個表面皿 內(nèi)重復沖洗，然后把全部卵集中到一個表面皿，一只供體的卵放在一個皿內(nèi)。操作室溫為 20-25 。C。 將體視鏡的放大倍數(shù)調(diào)至80-100倍，觀察胚胎的形態(tài)、卵裂球大小與均勻度、色 澤、細胞密度、與透明帶間隙以及細胞變性等情況。正常發(fā)育的胚胎，其卵裂球一般外形整 齊清晰，大小一致，分布均勻而緊密，發(fā)育速度與胚胎日齡相一致。對發(fā)育正常的胚胎供移 植，淘汰未受精卵及發(fā)育異常的胚胎。 沖卵的方法分為手術(shù)法和非手術(shù)法兩種。非手術(shù)法目前只應用于牛，且在胚胎進 入子宮角后收集。而豬、羊等中小家畜和小鼠、大鼠、兔等實驗動物仍然使用手術(shù)法。 5、胚胎移植 按照與供體母豬同樣的方法，對同步發(fā)情的受體母豬進行麻醉、保定、實施手術(shù)， 并將子宮角引出創(chuàng)口之外。先將用于子宮角移植的外套管斜面端，從子宮角的合適部位避 開血管插入子宮角內(nèi)腔，外套管進入子宮角內(nèi)腔的深度4公分，用手感確認外套管在子宮 腔內(nèi)；然后將吸有胚胎的移卵管插入外套管，直至用手能感覺到移卵管已穿過外套管1公 分；最后將移卵管內(nèi)的胚胎和培養(yǎng)液移入子宮角內(nèi)。移植完畢，小心將移卵管和外套管退 出，復原子宮角，按常規(guī)縫合創(chuàng)口 。子宮角移植用外套管是長65mm、管腔直徑3mm、管壁厚 0. lmm的硬質(zhì)、有彈性的聚氯乙烯塑料細管，其一端剪成15°斜面，另一端磨平滑。 6、受體母豬的管理 移植后的受體母豬，最初幾天，要注意每天兩次注射抗菌素，防止創(chuàng)口感染。同時， 要單欄飼養(yǎng)，以防止豬只之間打架，弄破傷口或流產(chǎn)。受體母豬的營養(yǎng)水平，按育種場懷孕 母豬的日糧配合即可。懷孕中后期，注意補充青飼料，做好觀察，待產(chǎn)。 實施例2轉(zhuǎn)"-3脂肪酸基因豬胚胎的移植 1、 "-3脂肪酸基因的準備 將構(gòu)建好的"-3脂肪酸基因質(zhì)粒酶切成線性，用TE稀釋液稀釋為5yg/ml的基
因溶液備用。 2、胚胎的采集 用實施例1同樣的方法，對母豬進行超數(shù)排卵處理，發(fā)情后配種；在最后一次配種之后的24小時，進行手術(shù)，麻醉、保定、腹部開口，其過程同實施例1。術(shù)者將食指及中指由 切口伸人腹腔，在與骨盆腔交界的前后位置觸摸子宮或子宮角，摸到后用二指夾持，牽引至 創(chuàng)口的表面，循一側(cè)子宮角導出輸卵管，在輸卵管末端轉(zhuǎn)彎處找到該側(cè)卵巢。不可用力牽拉 卵巢，不能直接用手捏卵巢，更不能觸摸排卵點和充血的卵泡。觀察卵巢表面排卵點和卵泡 發(fā)育，詳細記錄。 將沖卵管一端由輸卵管傘部的喇叭口插入，約l-2cm深，用大拇指和食指握成環(huán)
行固定，另一端接集卵皿。用注射器吸取37t:的沖卵液15-20ml，在子宮角靠近輸卵管的部
位，將針頭朝輸卵管方向剌入，一只手的手指在針頭后方捏緊子宮角.另一只手推注射器，
沖卵液由宮管結(jié)合部流入輸卵管，經(jīng)輸卵管流至集卵皿。再將另一側(cè)輸卵管引出切口之外，
用同樣的方法采集胚胎。 3、胚胎的收集及質(zhì)量檢查 方法同實施例l。收集l細胞期的原核胚。 4、基因的顯微注射 原核胚以10000-15000r/min離心3-5min，能清楚地辨認原核。離心后的原核胚和 準備好的o-3脂肪酸基因溶液置于顯微操作儀下，將吸有基因的注射針快速剌入原核中， 注射2pl基因溶液，迅速退出注射針。每次注射15-20枚卵，培養(yǎng)，待移植。 5、注射基因胚胎的移植 采用自體移植的方式，即從哪一頭母豬采集的胚胎，經(jīng)基因注射后又移回該母豬 的輸卵管內(nèi)。 該頭母豬采集胚胎之后，仍置于手術(shù)臺上，耳靜脈點滴戊巴比妥鈉(2. 5% )或鹽 酸氯氨酮維持其麻醉狀態(tài)。 移植時，將輸卵管和卵巢引出切口之外。先將外套管從輸卵管傘口插入輸卵管，用
手將輸卵管沿外套管向前捋，直至壺腹部；然后將吸有胚胎的移卵管插入外套管，直至用手
能感覺到移卵管已穿過外套管，再將外套管退出1公分；最后將移卵管內(nèi)的胚胎和培養(yǎng)液
移入輸卵管內(nèi)。移植完畢，小心將移卵管和外套管退出，復原輸卵管傘，按常規(guī)縫合創(chuàng)口 。輸
卵管移植用外套管是長70mm、管腔直徑4mm、管壁厚0. 2mm的硬質(zhì)、有彈性的聚氯乙烯塑料
細管，兩端磨平滑。 6、移植后母豬的管理 移植后的母豬，最初幾天，要注意每天兩次注射抗菌素，防止創(chuàng)口感染。同時，要單 欄飼養(yǎng)，以防止豬只之間打架，弄破傷口或流產(chǎn)。受體母豬的營養(yǎng)水平，按育種場懷孕母豬 的日糧配合即可。懷孕中后期，注意補充青飼料，做好觀察，待產(chǎn)。 7、轉(zhuǎn)基因豬的整合檢測 新生仔豬剪耳號取樣，用酚氯仿法提取DNA， PCR檢測，三次有與陽性對照一致大 小的帶者，初步確定為轉(zhuǎn)基因仔豬。
權(quán)利要求用于豬胚胎移植的器械，包括移卵管，其特征在于還包括輸卵管移植用外套管或子宮角移植用外套管，移卵管在各外套管內(nèi)部；輸卵管移植用外套管是長65-70mm、管腔直徑3-4mm、管壁厚0.1-0.2mm的硬質(zhì)、有彈性的塑料細管，兩端磨平滑；子宮角移植用外套管是長65-70mm、管腔直徑3-4mm、管壁厚0.1-0.2mm的硬質(zhì)、有彈性的塑料細管，其一端剪成15°-20°斜面，另一端磨平滑。
專利摘要本實用新型涉及一種用于豬胚胎移植的器械，包括移卵管、輸卵管移植用外套管或子宮角移植用外套管，移卵管在各外套管內(nèi)部；各外套管均是長65-70mm、管腔直徑3-4mm、管壁厚0.1-0.2mm的硬質(zhì)、有彈性的塑料細管；輸卵管移植用外套管兩端磨平滑；子宮角移植用外套管一端剪成15°-20°斜面，另一端磨平滑。進行胚胎移植時，首先將外套管插入受體母豬輸卵管的壺腹部，或插入受體母豬子宮角的合適部位；然后將吸有胚胎的移卵管，通過外套管插入受體母豬輸卵管的壺腹部或子宮角的合適部位，再實施移植。本實用新型克服了已有技術(shù)將移卵管直接插入輸卵管或子宮角的缺陷，顯著提高了豬胚胎移植的成功率和效率。
文檔編號A61D19/04GK201492540SQ2009202277
公開日2010年6月2日 申請日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者李莉, 王亞剛, 肖紅衛(wèi), 鄭新民, 魏慶信 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所