專利名稱：植物抗病原體系統(tǒng)的制作方法
植物抗病原體系統(tǒng)提交數(shù)據(jù)本申請涉及且要求于2008年8月5日提交的美國專利申請?zhí)?1/086，444的優(yōu)先 權(quán)，所述專利的完整內(nèi)容通過弓I用合并入本文。領(lǐng)域總的來說，本發(fā)明涉及植物不受植物病原體且特別是不受真菌病原體的保護。本發(fā)明特別提供了抑制植物中的病原體感染且改善對敏感植物的損害的多價方法。背景在本說明書中由作者參考的出版物的書目細(xì)節(jié)在說明書結(jié)束時按字母順序收集。在本說明書中提及任何現(xiàn)有技術(shù)并非且不應(yīng)視為承認(rèn)或以任何形式暗示這個現(xiàn) 有技術(shù)構(gòu)成任何國家中的共有一般知識的部分。由于通過植物病原體例如真菌病原體的感染的農(nóng)作物損失是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主 要問題，并且每年在殺真菌劑應(yīng)用上花費數(shù)百萬美元以制止這些損失(Oerke和Dehne， 2004)。需要鑒定用于處理通過病原體例如真菌感染的新抗微生物劑和策略?？紤]到病原 體發(fā)展抗性的傾向，這是特別重要的。已進化出抗微生物肽以保護生物體不受病原體。它們的特異性在很大程度上依賴 于它們源于其的生物體，可能是由于由各種病原體置于這些生物體的進化壓力。像這樣，與 真菌病原體相比較，從哺乳動物物種中分離出的肽一般顯示出針對細(xì)菌病原體更高程度的 活性，推測是由于來自細(xì)菌感染的更高風(fēng)險。相比之下，由于由植物面對的真菌感染的更高 風(fēng)險，植物抗微生物肽一般顯示出更高的抗真菌活性。植物防御素代表一類抗微生物肽(由Lay和Anderson，2005綜述)。存在具有不 同空間和時間表達模式和活性譜的廣泛多樣的防御素。這些肽的特異性的潛在機制仍是未知的，盡管推測涉及與質(zhì)膜組分的相互作用。 因為膜透化是許多抗微生物肽的共同活性，并且各種細(xì)胞類型的膜組成是高度可變的，所 以特異性脂質(zhì)的存在推測在某些情況下負(fù)責(zé)抗微生物肽的功效。特別地，細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)膜 在外層中包含帶負(fù)電荷的磷脂，而哺乳動物細(xì)胞則不是(Matsuzaki，1999)。這些帶負(fù)電 荷的脂質(zhì)可以與帶正電荷的抗微生物肽相互作用。為支持這個假設(shè)，體外研究已證實帶負(fù) 電荷的脂質(zhì)的存在對于許多抗微生物肽的膜透化活性是重要的(Matsuzaki等人，1995 ； Matsuzaki，1999 ；Epand 等人，2006)。膜透化已暗示為關(guān)于某些植物防御素的作用機制，盡管透化機制仍未得到研究。 在植物防御素RsAFP2和DmAMPl的情況下，提出透化涉及在細(xì)胞表面上的特定受體。在質(zhì)膜 中特異性鞘脂的存在也是這些防御素的活性所需的，可能作為結(jié)合位點(Thevissen等人， 2000 ；Thevissen 等人，2004 ；Thevissen 等人，2005 ；Ramamoorthy 等人，2007)。植物病原體誘導(dǎo)顯著的植物產(chǎn)量損失，并且目前用于病原體控制的策略是昂貴的 且對環(huán)境潛在性損害的?？紤]到改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟的需要，需要新策略用于保護農(nóng)業(yè)和觀 賞上重要的植物不受一系列疾病，特別是真菌病。概述
本文公開的是用于減少經(jīng)由病原體例如真菌因子引起的對農(nóng)作物和觀賞植物的 損害的系統(tǒng)。傳統(tǒng)控制方法涉及化學(xué)殺真菌劑的應(yīng)用。這增加了農(nóng)作物和花生產(chǎn)的成本。 依照本發(fā)明，鑒定了在植物防御素和蛋白酶抑制劑之間令人驚訝的協(xié)同作用，導(dǎo)致預(yù)防和 改善植物中的疾病狀況的功效增加。 因此，本發(fā)明提供了用于保護植物不受與經(jīng)由病原體感染相關(guān)的疾病的系統(tǒng)，該 系統(tǒng)包括給植物的細(xì)胞提供植物防御素和蛋白酶抑制劑或任一或兩者的前體或功能同系 物、類似物、衍生物或其變體。在一個特定實施方案中，植物病原體是真菌。提及“植物”在 一個方面包括植物及其后代。因此，本發(fā)明尤其提供了用于保護植物不受經(jīng)由真菌病原體感染和/或用于減少 真菌病原體相關(guān)疾病的嚴(yán)重度發(fā)生率的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括使用至少一種防御素和一種蛋白 酶抑制劑的組合的多價方法。出乎意料地，給定防御素和給定蛋白酶抑制劑對給定真菌病 原體的組合作用是協(xié)同的，即當(dāng)它們在植物環(huán)境中組合時(至少)2種組分的抗病原體活性 大于蛋白酶抑制劑或防御素單獨作用的抑制效應(yīng)的總和。因此，本發(fā)明進一步提供了用于保護植物不受與經(jīng)由病原體感染相關(guān)的疾病的系 統(tǒng)，該系統(tǒng)包括以協(xié)同有效量給植物的細(xì)胞提供植物防御素和蛋白酶抑制劑或任一或兩者 的前體或功能同系物、類似物、衍生物或其變體，以減少經(jīng)由病原體的感染。提及“系統(tǒng)”包括植物管理系統(tǒng)、方案和方法。如上所述，在一個特定實施方案中， 病原體是真菌病原體。提及“提供植物的細(xì)胞”包括從外源來源提供防御素和蛋白酶抑制劑，或從細(xì)胞內(nèi) 提供兩者或一種外源提供和一種細(xì)胞內(nèi)提供。本發(fā)明進一步考慮了植物防御素和蛋白酶抑制劑或任一或兩者的前體形式在制 造遺傳修飾植物中的用途，所述遺傳修飾植物對真菌感染較不敏感或顯示出更少的真菌感 染相關(guān)損害。在一個實施方案中，存在用于保護農(nóng)作物或觀賞植物不受真菌病的系統(tǒng)，其包括 給植物提供植物防御素和蛋白酶抑制劑或其功能同系物、類似物或變體或等價物。在這個 實施方案中，與每種組分單獨的組合分開效應(yīng)相比較，由2種組分的真菌抑制程度被視為 協(xié)同的。在一個實施方案中，存在通過至少一種植物防御素例如NaDl或其抗真菌變體和 各種蛋白酶抑制劑中的至少一種的組合對鐮刀菌屬(Fusarium)物種的協(xié)同抑制，所述蛋 白酶抑制劑包括但不限于來自植物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑或絲氨酸蛋白酶抑制劑例如 StPinlA(如美國專利號7，462，695中所述以前稱為PotlA的馬鈴薯I型抑制劑)或牛胰蛋 白酶抑制劑I-P。對通過系統(tǒng)組分各自抑制分別敏感的任何真菌通過使用組合比單獨使用 任一組分可以更有效地得到控制。本發(fā)明進一步提供了用于保護植物不受與經(jīng)由真菌病原體感染相關(guān)的疾病的系 統(tǒng)。該系統(tǒng)包括給植物的細(xì)胞提供植物防御素和蛋白酶抑制劑或任一或兩者的前體或功能 同系物、類似物、衍生物或其變體。本發(fā)明的多價方法包括包括協(xié)同作用的植物防御素和蛋白酶抑制劑。這些組分可 以通過重組方法在植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生且任選從植物細(xì)胞輸出或輸入到植物細(xì)胞內(nèi)。備選地， 組分可以局部地提供給植物細(xì)胞，例如以噴霧劑、氣溶膠、粉劑的形式或作為肥料或植物食 物的部分。如上所述，在另外一個備選方案中，防御素或蛋白酶抑制劑之一通過重組方法提供，并且這些組分的另一種外源提供。本發(fā)明的另一個方面考慮了用于抑制真菌生長、復(fù)制、感染和/或維持的方法，該方法包括使真菌暴露于植物防御素和蛋白酶抑制劑的組合。再次，與由任一組分以用于組合暴露的相同劑量與真菌單獨接觸提供的抑制總和 相比較，在防御素和蛋白酶抑制劑的存在下的真菌抑制程度是協(xié)同的。如果可以顯示每種組分單獨地發(fā)揮針對真菌的抑制活性，或組合中的組分發(fā)揮協(xié) 同的組合抑制效應(yīng)，那么真菌對經(jīng)由系統(tǒng)的個體組分各自“的抑制是敏感的”。本發(fā)明延伸至系統(tǒng)組分對真菌細(xì)胞透性的作用的測量。采用可以鑒定其定位的物 質(zhì)，無論是在真菌細(xì)胞內(nèi)部還是外部。該物質(zhì)在本文中特別被稱為“透性指示劑化合物”。 透性指示劑化合物是其在細(xì)胞內(nèi)部或外部的存在可以依靠具有可檢測性質(zhì)進行可檢測測 量的化合物，所述可檢測性質(zhì)例如熒光、放射性標(biāo)記、免疫學(xué)特征等。此外，透性指示劑化合 物是這樣的化合物，其在正常條件下保持在細(xì)胞外，并且除非細(xì)胞透性已從細(xì)胞的正常生 理條件改變，否則將無法在細(xì)胞內(nèi)檢測出。原則上，透性的指示劑還可以是正常保留在細(xì)胞 內(nèi)，僅在異常條件下滲漏出去的化合物，但前面一種類型的指示劑更常見?？梢杂糜诒O(jiān)控從 細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的移動的透性指示劑化合物的例子包括與核酸結(jié)合的熒光染料例如 SYT0X Green，或碘化丙啶。其他例子包括FITC標(biāo)記的右旋糖酐或免疫金標(biāo)記的抗體，其 定位可以通過顯微鏡檢查進行檢測。熒光標(biāo)記的防御素其自身也可以用作透性指示劑化合 物。從細(xì)胞內(nèi)環(huán)境釋放到細(xì)胞外環(huán)境的ATP的測量(如通過引用合并入本文的美國專利申 請?zhí)朥S12/362，657中公開的)也可以用作透性的指示劑。術(shù)語“可檢測的量”意欲傳達透 性指示劑化合物的量方面的差異可以半定量地進行評估，足以用于比較目的。為了比較植 物防御素對真菌細(xì)胞透性的可能作用的目的，使用植物防御素NaDl作為用于比較的基礎(chǔ)。本發(fā)明的實施方案包括其中防御素是具有針對至少一種致病性真菌的殺真菌和/ 或抑制真菌活性的任何防御素的那些。此類抗真菌防御素的例子包括但不限于來自蘿卜的 NaDU PhDlA, PhD2、Tomdef2, RsAFP2、RsAFPU RsAFP3 和 RsAFP4，來自大麗花(dahlia)的 DmAMPl，來自七葉樹(Aesculus hippocatanum)的 MsDefl、MtDef2、CtAMP 1、PsDl、HsAFP 1、 VaD 1、VrD2、ZmESR6、AhAMPl 和 AhAMP4，來自苜蓿(alfalfa)的 AflAFP，來自豌豆的 NaD2、 AXl、AX2、BSDl、EGADl、HvAMPl、JI-2、PgDl、SD2、SoD2、WT1、pl39 和 pl230。嵌合防御素分 子和/或保留抗真菌活性的防御素變體也可以用于本發(fā)明的系統(tǒng)中以用于植物保護。嵌合防御素分子和/或保留抗真菌活性的防御素變體也可以用于本發(fā)明的系統(tǒng) 中以用于植物保護。本發(fā)明進一步考慮了植物防御素和蛋白酶抑制劑或任一或兩者的功能同系物、類 似物、衍生物或其變體在制造用于保護植物或其后代不受真菌病原體的系統(tǒng)中的用途。在另一個方面，本發(fā)明提供了植物防御素和蛋白酶抑制劑或任一或兩者的功能同 系物、類似物、衍生物或其變體在制造保護不受真菌病原體的植物或其后代中的用途。表 1用于在抗病原體系統(tǒng)中使用的植物防御素的例子_來源_登記號_參考文獻__
NaDl 花煙草(Nicotiana alata)Q8GTM0Lay 等人，2003
PhDlA 媒牽牛(Petunia hybrids)Q8H6Q1Lay 等人，2003
PhD2 矮牽牛Q8H6Q0Lay 等人，2003
RsAFP2 蘿卜(Raphanus sativus)P30230Terras 等人，1992
RsAFPl 蘿卜P69241Terras 等人，1992
RsAFPS 蘿 卜024332Terras 等人，1992
RsAFP4 蘿卜024331Terras 等人，1992
矮生大麗花(Dahlia
DmAMPl merckii)AAB34972Osborn 壽人,1995
紫花苜蓿(Medicago
MsDefl satIva)AAV85437Hanks 等人,2005
蒺藜苜贛 (Medicago
MtDef2 truncatula)AY313169Hanks 等人，2005
CtAMP 蝶主(Clitoria terna teaAAB34971Osborn 等人，1995
PsDl 婉豆(Piswn sativum)P81929Almeida 等人,2000
紅花礬根 (Heuchera
HsAFPl sanguinea)AAB34974Osborn 等人，1995
VaDl 紅豆(Vigna angular is)n/aChen 等人，2005
VrD2 綠豆(Vigna radiata)2GL1-ALin 等人，2007
ZmESR6 玉蜀黍(Zea mays)CAH61275Balandin 等人，2005
AhAMPl 七葉樹AAB34970Osborn 等人，1995
AXl 甜菜[Beta vulgaris)P81493Kragh 等人，1995
AX2 甜菜P82010Kragh 等人，1995
ff ^ ^ ( Brassica
BSDl campestTis)L47901Park 等人，2002
EGADl ( Elaeis guineensis)AF322914Tregear et al 2002
紫蔓豆(Hardenbergia
HvAMPl violacea)n/aHarrison 等人’ 1997
JI-2 ( Capsicum annuum)X95730Meyer 等人’ 1996
PgDl 白云杉、Picea glauca)AY494051Pcrvicux 等人，2004
向日葵(Helianthus
SD2 annuus)AF178634Urdangarin 等人，2000
SoD2 菠菜(Spinacia οIeracea)Ρ81571Segura 等人’ 1998
WTl 山秦、Wasabi japonica、BAB19054Saitoh 等人，2001在本發(fā)明的實施方案中有用的蛋白酶抑制劑包括但不限于來自下述類別的蛋白 酶抑制劑絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金屬蛋白酶抑制劑和羧肽酶。可以通過本發(fā)明的系統(tǒng)保護不受真菌感染的植物包括對真菌敏感或包括防御素 和蛋白酶抑制劑的組合物可以應(yīng)用于其的那些，所述真菌對蛋白酶抑制劑和植物防御素敏感，所述蛋白酶抑制劑和植物防御素可以作為轉(zhuǎn)基因在那種植物中表達。本文還考慮了組 合轉(zhuǎn)基因和局部應(yīng)用方法。蛋白酶抑制劑一般是蛋白質(zhì)或肽或其化學(xué)類似物。植物可以 是單子葉植物，特別是來自禾本科(P0aceae)的植物，以及谷類，例如玉蜀黍、大麥、小麥、 稻等，或雙子葉植物，特別是來自茄科(Solmaceae)、十字花科(Brassicaceae)、錦葵科 (Malvaceae)禾口豆科(Fabaceae)的植物。來自許多真菌性病原體特別是其為絲狀真菌的那些的感染和損害，可使用本 發(fā)明的系統(tǒng)在許多植物物種中得到控制?？煽刂频恼婢吐丫V病原體的例子包括 但不限于，鐮刀菌屬(Fusarium)、輪枝孢屬(Verticillium)、腐霉菌屬(Pythium)、絲 核菌屬(Rhizoctonia)、核盤菌屬(Sclerotinia)、小球腔菌屬(Leptosphaeria)、疫霉 屬(Phytophthora)、毛盤孢屬(Colletotrichum)、尾孢屬(Cercospora)和鏈格孢屬 (Alternaria)物種，和銹菌。重要的應(yīng)用包括但不限于蛋白酶抑制劑和抗真菌防御素協(xié) 同組合用于例如保護植物不受禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢鐮刀菌萎蔫 ?；?Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum) (Fov)、禾生剌盤抱(Colletotrichum graminicola)、十字花禾斗小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、甘藍(lán)鏈格抱(Alternaria brassicicola)、鏈格抱(Alternaria alternata)、構(gòu)巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)、 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、舌甘菜生尾孢(Cercospora beticola)、玉米尾孢 (Cercospora zeae maydis)、異方寵抱腔菌(Cochliobolus heterostrophus)、大斑凸贓螺 抱(Exserohilum turcicum)、大刀德刀菌(Fusarium culmorum)、尖抱德刀菌(Fusarium oxysporum)、尖孢鐮刀菌石竹專化型(Fusarium oxysporum f. sp. dianthi)、尖鐮孢菌番 前專化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)、前腐德刀菌(Fusarium solani)、 Fusarium pseudograminearum、輪枝樣,廉刀菌(Fusarium verticilloides)、禾丁頁囊殼 小麥變禾中(Gaeumannomyces graminis var. tritici)、蕓笞豐艮月中菌(Plasmodiophora brassicae)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Stenocarpella(Diplodia)maydis、煙 草根串珠霉(Thielaviopsis basicola)、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)、玉米瘤 漂粉菌(Ustilago zeae)、高梁柄誘菌(Puccinia sorghi)、Macrophomina phaseolina、 Phialophora gregata、Diaporthe phaseolorum、S. M W (Cercospora so jina) Λ
M β (Phytophthora sojae)、t 才古 M t亥胃(Rhizoctonia solani)、Phakopsora pachyrhizi、大抱鏈格抱(Alternaria macrospora)、棉尾抱(Cercospora gossypina)、 短 小 蓮 點 毒(Phoma exigua)、Puccinia schedonnardii、Puccinia cacabata、 Phymatotrichopsis omnivora、燕麥德刀菌(Fusarium avenaceum)、蕓苔鏈格抱 (Alternaria brassicae)、蘿卜鏈格抱(Alternaria raphani)、禾白粉菌(Erysiphe graminis)(布氏白粉菌(Blumeria graminis))、小麥殼針孢(Septoria tritici)、狗 牙根殼針抱(Septoria nodorum)、Mycosphaerella zeae、禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)、Ustilago tritici、禾柄誘菌(Puccinia graminis)、小麥葉誘菌(Puccinia triticina)、印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、網(wǎng)腥黑粉菌(Tilletia caries)和矮腥黑 粉菌(Tilletia controversa)。本文還考慮了包括植物防御素和蛋白酶抑制劑(或其前體)或其抗真菌同系物、 類似物、變體和功能等價物的農(nóng)學(xué)組合物。本文進一步考慮了用于管理植物的植物病原體感染的方案，其包括操縱植物環(huán)境以提供以抑制病原體量的植物防御素和蛋白酶抑制劑。在一個特定實施方案中，提及“植物病原體”包括真菌和其他相關(guān)生物體。一般地， 當(dāng)該系統(tǒng)包括表達防御素和蛋白酶抑制劑的遺傳修飾植物時，術(shù)語“植物”包括其后代。當(dāng) 該系統(tǒng)包括局部應(yīng)用防御素和蛋白酶抑制劑的組合時，該效應(yīng)一般局限于特定植物。本文使用的序列標(biāo)識符的概括在表2中提供。表2序列標(biāo)識符的概括
SEQ ID N0S.
NaCysl核酸序列
~~2NaCysl氨基酸序列
NaCys2核酸序列
NaCys2氨基酸序列
~NaCys3核酸序列
~~6NaCys3氨基酸序列
~NaCys4核酸序列
~~8NaCys4氨基酸序列
~~9StPinlA核酸序歹Ij
~ θStPinlA氨基酸序列
"TlfeDl核酸序列
feDl氨基酸序列
~13Hv-CPI6核酸序歹Il
~~14HV-CPI6氨基酸序列
~~15CC6核酸序列
"TeCC6氨基酸序列
~17NaPinlA核酸序歹Il
~ 8NaPinlA氨基酸序列
權(quán)利要求
1.用于保護植物不受與經(jīng)由病原體感染相關(guān)的疾病的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括給所述植物 的細(xì)胞提供植物防御素和蛋白酶抑制劑或其任一或兩者的前體或功能同系物、類似物、衍 生物或變體。
2.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中與由任一組分以用于組合接觸的相同劑量與所述病原體單 獨接觸提供的抑制相比較，由第一種和第二種組分組合提供的病原體抑制程度是協(xié)同的。
3.權(quán)利要求1或2的系統(tǒng)，其中所述防御素和所述蛋白酶抑制劑或其前體形式由遺傳 修飾的植物細(xì)胞生產(chǎn)，并且其中無一由未經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞生產(chǎn)。
4.權(quán)利要求1或2的系統(tǒng)，其中所述防御素和所述蛋白酶抑制劑或其前體形式局部或 經(jīng)由所述植物的根系應(yīng)用于所述植物。
5.權(quán)利要求1或2的系統(tǒng)，其中所述防御素或所述蛋白酶抑制劑或其前體形式之一由 所述細(xì)胞生產(chǎn)，并且所述防御素或所述蛋白酶抑制劑或其前體形式中的另一種局部或經(jīng)由 所述植物的根系應(yīng)用于所述植物。
6.權(quán)利要求1或2的系統(tǒng)，其中所述防御素選自NaDl、WiDlA、WiD2、Tomdef2、RsAFP2、 RsAFPU RsAFP3、RsAFP4、DmAMPU MsDefU MtDef2、CtAMPU PsDU HsAFPU VaDU VrD2、 ZmESR6、AhAMP 1、AhAMP4、AflAFP, NaD2、AXl、AX2、BSDl、EGADl、HvAMPl、JI_2、PgDl、SD2、 SoD2、WTl、pl39 和 pl230。
7.權(quán)利要求1或2或6的系統(tǒng)，其中所述蛋白酶抑制劑選自絲氨酸蛋白酶抑制劑、半 胱氨酸蛋白酶抑制劑、植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑和來自煙草屬 (Nicotiana)物種的蛋白酶抑制劑例如NaPI。
8.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述病原體是真菌。
9.權(quán)利要求8的系統(tǒng)，其中所述真菌是絲狀真菌。
10.權(quán)利要求9的系統(tǒng)，其中所述絲狀真菌選自鐮刀菌屬(Fusarium)、核盤菌屬 (Sclerotinia)、腐霉菌屬(Pythium)、輪枝孢屬(Verticillium)和疫霉屬(Phytopthera)。
11.權(quán)利要求10的系統(tǒng)，其中所述真菌選自禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、 尖孢鐮刀菌萎蔫?；?Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum) (Fov)、禾生朿Ij 盤 抱(Colletotrichum graminicola)、十字花禾斗小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、M Iil H- (Alternaria brassicicola) > Ijl H- (Alternaria alternata)、 巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、舌甘菜生尾 抱(Cercospora beticola)、玉米尾抱(Cercospora zeae maydis)、異方寵抱腔菌 (Cochliobolus heterostrophus)、大斑凸贓螺抱(Exserohilum turcicum)、大刀鍵刀 菌(Fusarium culmorum)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、尖孢鐮刀菌石竹?；?(Fusarium oxysporum f. sp. dianthi)、尖鍵抱菌番?；?Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)、爺腐鍵刀菌(Fusarium solani)、Fusarium pseudograminearum、輪枝樣 鍵刀菌(Fusarium verticilloides)、禾頂囊殼小麥變禾中(Gaeumannomyces graminis var. tritici)、蕓笞根月中菌(Plasmodiophora brassicae)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum) > Stenocarpella(Diplodia)maydis> 煙草 t艮串 3 β (Thielaviopsis basicola)、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)、玉米瘤黑粉菌 ^stilago zeae)、高粱柄 Misf (Puccinia sorghi) > Macrophomina phaseolina> Phialophora gregata> Diaporthe phaseolorum、大豆 1(Cercospora sojina)、大豆^ (Phytophthora sojae) > AL^M M (Rhizoctonia solani) > Phakopsora pachyrhizi> Ijl H- (Alternaria macrospora) > ^1 (Cercospora gossypina) > fe. 7Jn^ ^ ^ (Phoma exigua) > Puccinia schedonnardii> Puccinia cacabata> Phymatotrichopsis omnivora> ？^ 胃■ TJ 胃 (Fusarium avenaceum)、蕓苔鏈格抱(A lternari a brassicae)、蘿卜鏈格抱(A lternari a raphani)、禾白粉菌(Erysiphe graminis)(布氏白粉菌(Blumeria graminis))、小麥殼 針抱(Septoria tritici)、狗牙根殼針抱(Septoria nodorum)、Mycosphaerella zeae、禾 谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)、Ustilago tritici、禾柄繡菌(Puccinia graminis)、 小麥葉銹菌(Puccinia triticina)、印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、網(wǎng)腥黑粉菌 (Tilletia caries)和矮腥黑粉菌(Tilletia controversa)
12.權(quán)利要求1-11中任一項的系統(tǒng)，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。
13.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中所述植物選自棉花、苜蓿、擬南芥屬(Arabidopsis)、香 蕉、大麥、卡諾拉油菜、蓖麻、菊花、三葉草、可可、咖啡、棉籽、玉米(玉蜀黍)、海甘藍(lán)、越桔、 黃瓜、石斛、薯蕷、桉樹、羊茅草、亞麻、唐菖蒲、百合、亞麻籽、粟、甜瓜、芥菜、燕麥、油棕、油 料種子油菜、番木瓜、花生、菠蘿、觀賞植物、菜豆屬(Wiaseolus)、馬鈴薯、油菜籽、稻、黑麥、 黑麥草、紅花、芝麻、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、煙草、番茄、草坪草、小麥和蔬菜 作物，例如萵苣、芹菜、椰菜、花椰菜、葫蘆、洋蔥(包括大蒜、分蔥、韭和細(xì)香蔥)；水果樹和 堅果樹，例如蘋果、梨、桃、橙、葡萄柚、檸檬、酸橙、杏樹、山核桃、胡桃、榛子；藤本植物，例如 葡萄、獼猴桃、蛇麻草；果實灌木和荊棘，例如覆盆子、黑莓、醋栗；森林樹，例如岑樹、松樹、 冷杉、楓樹、橡樹、栗樹、白楊；其中優(yōu)選苜蓿、卡諾拉油菜、蓖麻、玉米、棉花、海甘藍(lán)、亞麻、 亞麻籽、芥菜、油棕、油料種子油菜、花生、馬鈴薯、稻、紅花、芝麻、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、 煙草、番茄和小麥。
14.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中所述植物選自農(nóng)作物植物、飼料作物、油料種子作物、谷 類作物、水果作物、蔬菜作物、纖維作物、香料作物、堅果作物、草皮作物、糖料作物、飲料作 物和森林作物。
15.權(quán)利要求14的系統(tǒng)，其中所述農(nóng)作物植物是大豆、小麥、玉米、棉花、苜蓿、甜菜、 稻、馬鈴薯、番茄、洋蔥、豆類或豌豆植物。
16.權(quán)利要求15的系統(tǒng)，其中所述植物是棉花。
17.權(quán)利要求1-16中任一項的系統(tǒng)，其中所述防御素是NaDl，并且所述蛋白酶抑制劑 是半胱氨酸或絲氨酸蛋白酶抑制劑。
18.植物防御素和蛋白酶抑制劑或任一或兩者的前體形式在制造遺傳修飾植物中的用 途，所述遺傳修飾植物對病原體感染相關(guān)損害較不敏感。
19.植物防御素和蛋白酶抑制劑或任一或兩者的前體形式在制造保護植物不受病原體 感染相關(guān)損害的組合物中的用途。
20.權(quán)利要求18或19的用途，其中所述病原體是真菌。
21.對病原體感染有抵抗力的遺傳修飾植物或其后代，所述植物包括經(jīng)遺傳改造為產(chǎn) 生植物防御素和蛋白酶抑制劑或其同系物或衍生物或變體或前體形式的細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的遺傳修飾植物，其中所述防御素選自NaDl、PhDlA,PhD2、Tomdef2, RsAFP2、RsAFPl、RsAFP3、RsAFP4、DmAMPl、MsDefl、MtDef2, CtAMPl、PsDl、HsAFPl、VaDl、 VrD2、ZmESR6、AhAMP 1、AhAMP4、AflAFP, NaD2、AX1、AX2、BSDl、EGADl、HvAMPl、JI_2、PgDl、SD2、SoD2、WTl、pl39 和 pl230。
23.權(quán)利要求21或22的遺傳修飾植物，其中所述蛋白酶抑制劑選自絲氨酸蛋白酶抑制 劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑(phytocystatin)、半胱氨酸蛋白 酶抑制劑(cystatin)和來自煙草屬物種的蛋白酶抑制劑例如NaPI。
24.權(quán)利要求21或22或23的遺傳修飾植物，其中所述病原體是真菌。
25.權(quán)利要求對的遺傳修飾植物，其中所述真菌選自禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌萎蔫 ?；?Fov)、禾生刺盤孢、十字花科小球腔菌、甘藍(lán)鏈格孢、鏈格孢、構(gòu)巢曲霉菌、灰葡萄 孢菌、甜菜生尾孢、玉米尾孢、異旋孢腔菌、大斑凸臍蠕孢、大刀鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、尖孢 鐮刀菌石竹專化型、尖鐮孢菌番茄?；?、茄腐鐮刀菌、Fusarium pseudograminearum、輪 枝樣鐮刀菌、禾頂囊殼小麥變種、蕓苔根腫菌、核盤菌、Stenocarpella(Diplodia)maydis, 煙草根串珠霉、大麗輪枝菌、玉米瘤黑粉菌、高粱柄銹菌、Macrophomina phaseolina, Phialophora gregata> Diaporthe phaseolorum> ^vii 1^ ^viiJAttlif> Phakopsora pachyrhizi、^; ! " 、豐帛HJ包、失豆Puccinia schedonnardii> Puccinia cacabata> Phymatotrichopsis omnivora>|1 > 11 -!]! - ^ W 卜 IIH" 孢、禾白粉菌(布氏白粉菌)、小麥殼針孢、狗牙根殼針孢、Myosphaerella zeae、禾谷絲核 菌、Ustilago tritici、禾柄銹菌、小麥葉銹菌、印度腥黑粉菌、網(wǎng)腥黑粉菌和矮腥黑粉菌。
26.權(quán)利要求21-25中任一項的遺傳修飾植物，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉 植物。
27.權(quán)利要求沈的系統(tǒng)，其中所述植物選自棉花、苜蓿、擬南芥屬、香蕉、大麥、卡諾拉 油菜、蓖麻、菊花、三葉草、可可、咖啡、棉籽、玉米(玉蜀黍)、海甘藍(lán)、越桔、黃瓜、石斛、薯 蕷、桉樹、羊茅草、亞麻、唐菖蒲、百合、亞麻籽、粟、甜瓜、芥菜、燕麥、油棕、油料種子油菜、番 木瓜、花生、菠蘿、觀賞植物、菜豆屬、馬鈴薯、油菜籽、稻、黑麥、黑麥草、紅花、芝麻、高粱、大 豆、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、煙草、番茄、草坪草、小麥和蔬菜作物，例如萵苣、芹菜、椰菜、 花椰菜、葫蘆、洋蔥(包括大蒜、分蔥、韭和細(xì)香蔥)；水果樹和堅果樹，例如蘋果、梨、桃、 橙、葡萄柚、檸檬、酸橙、杏樹、山核桃、胡桃、榛子；藤本植物，例如葡萄、獼猴桃、蛇麻草；果 實灌木和荊棘，例如覆盆子、黑莓、醋栗；森林樹，例如岑樹、松樹、冷杉、楓樹、橡樹、栗樹、白 楊；其中優(yōu)選苜蓿、卡諾拉油菜、蓖麻、玉米、棉花、海甘藍(lán)、亞麻、亞麻籽、芥菜、油棕、油料種 子油菜、花生、馬鈴薯、稻、紅花、芝麻、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、煙草、番茄和小麥。
28.權(quán)利要求沈的系統(tǒng)，其中所述植物選自農(nóng)作物植物、飼料作物、油料種子作物、谷 類作物、水果作物、蔬菜作物、纖維作物、香料作物、堅果作物、草皮作物、糖料作物、飲料作 物和森林作物。
29.權(quán)利要求觀的系統(tǒng)，其中所述農(nóng)作物植物是大豆、小麥、玉米、棉花、苜蓿、甜菜、 稻、馬鈴薯、番茄、洋蔥、豆類或豌豆植物。
30.用于鑒定增強蛋白酶抑制劑的抗病原體真菌活性的防御素的方法，其包括步驟在測試防御素的存在下和分開地在不存在測試防御素的情況下，使病原體與透性指示劑化合物相組合；比較在所述測試防御素的存在和不存在下，所述病原體中透性指示劑化合物的任何可 檢測的細(xì)胞內(nèi)的量，由此與在不存在所述測試防御素的情況下檢測出的指示劑化合物的細(xì)胞內(nèi)的量相比較，其的存在增加細(xì)胞內(nèi)透性指示劑化合物的量的測試防御素，被鑒定為增強蛋白酶抑制 劑的抗真菌活性的防御素。
31.權(quán)利要求30的方法，其中透性指示劑化合物是SYT0X 綠。
32.防御素，其通過權(quán)利要求30或31的方法鑒定。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所述病原體是真菌。
全文摘要
總的來說，本發(fā)明涉及保護植物不受植物病原體且特別是不受真菌病原體。本發(fā)明特別提供了抑制植物中的病原體感染且改善對敏感植物的損害的多價方法。
文檔編號A01N65/00GK102131393SQ200980132913
公開日2011年7月20日 申請日期2009年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日
發(fā)明者J·A·麥肯納, M·A·安德森, N·L·范德威爾登, R·L·希斯, S·珀恩 申請人:赫?，斢邢薰?br>