專利名稱：：除草劑-抗性的ahas-突變體及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及除草劑-抗性的蕓苔屬植物、和編碼抑制AHAS的除草劑-抗性的蕓苔屬乙酰羥酸合酶大亞基蛋白的新穎的多核苷酸序列、這樣的植物的種子、和使用這樣的植物的方法。
背景技術(shù)：
：乙酰羥酸合酶(AHAS;EC4.1.3.18，也稱作乙酰乳酸合酶或ALQ是催化支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物化學(xué)合成的第一個酶(Singh(1999)"Biosynthesisofvaline,leucineandisoleucine，，，PlantAminoAcid,Singh,B.K.,編，MarcelDekkerInc.NewYork,NewYork,第227-247頁)。AHAS是5個結(jié)構(gòu)上不同的除草劑家族的作用位點，所述除草劑家族包括磺酰脲類(Tan#U(2005)PestManag.Sci.61:246—57;Mallory-Smith禾口Retzinger(2003)WeedTechnology17:620-626；~LaRossa和Falco(1984)TrendsBiotechnol.2:158-161)、咪唑啉酮類(Shaner藥乂(1984)PlantPhysiol.76:545-546)、三唑并嘧啶類(Subramanian和Gerwick(1989)“Inhibitionofacetolactatesynthasebytriazolopyrimidines,，，JALBiocatalysisinAgriculturalBiotechnology,ffhitaker,J.R.禾口Sonnet,P.E..編,ACSSymposiumSeries,AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.,第277-288頁)；Tan^A(2005)PestManag.Sci.61:246-57;Mallory-Smith和Retzinger(2003)WeedTechnology17:620-626)；磺?；被?羰基三唑啉酮類(Tan^A(2005)PestManag.Sci.61:246-57;Mallory-Smith和Retzinger(2003)WeedTechnology17:620-626)；和N-磺?；被驶?。由于它們在非常低的施用率時的有效性和在動物中的相對無毒性，咪唑啉酮和磺酰脲除草劑被廣泛地用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)。通過抑制AHAS活性，這些除草劑家族阻止易感植物(包括許多雜草物種)的進一步生長和發(fā)育。為了使農(nóng)夫?qū)λ麄兪褂玫倪溥蜻突酋ｋ宄輨┑念愋秃皖l率具有更大的靈活性，經(jīng)常需要更強的除草劑耐受性。另外，開發(fā)除草劑耐受品種的植物育種者希望利用提供更大除草劑耐受性的突變，使他們在用于開發(fā)他們的品種的種質(zhì)背景中具有更大的靈活性。為了生產(chǎn)這樣的抑制AHAS的除草劑-抗性的品種，植物育種者需要開發(fā)額外的育種系，優(yōu)選具有增加的抑制AHAS的除草劑抗性。因而，需要農(nóng)作物植物的額外的抑制AHAS的除草劑-抗性的育種系和品種、以及用于生產(chǎn)和使用抑制AHAS的除草劑-抗性的育種系和品種的方法和組合物
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了編碼乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)蛋白的分離的核酸分子，所述蛋白包含在與SEQIDNO:23的位置A122相對應(yīng)的位置處的突變和在與SEQIDNO:23的位置S653相對應(yīng)的位置處的突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了表達載體，其包含編碼蕓苔屬乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)蛋白的分離的核酸分子，所述蛋白包含在與SEQIDNO:23的位置A122相對應(yīng)的位置處的突變和在與SEQIDNO:23的位置S653相對應(yīng)的位置處的突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了蕓苔屬植物，其包含編碼除草劑耐受性的蕓苔屬乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)蛋白的誘變過的核酸分子，所述蛋白包含在與SEQIDNO:23的位置A122相對應(yīng)的位置處的突變和在與SEQIDN0:23的位置S653相對應(yīng)的位置處的突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了能生成蕓苔屬植物的蕓苔屬種子，所述蕓苔屬植物包含編碼蕓苔屬乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)蛋白的誘變過的核酸分子，所述蛋白具有在與SEQIDN0:23的位置A122相對應(yīng)的位置處的突變和在與SEQIDN0:23的位置S653相對應(yīng)的位置處的突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了蕓苔屬種子的容器，其中所述容器包含至少10%的能生成蕓苔屬植物的種子，所述蕓苔屬植物包含編碼蕓苔屬乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)蛋白的突變的核酸分子，所述蛋白具有在與SEQIDN0:23的位置A122相對應(yīng)的位置處的突變和在與SEQIDN0:23的位置S653相對應(yīng)的位置處的突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了控制在蕓苔屬植物附近的雜草的方法，所述方法包括，將有效量的抑制AHAS的除草劑施用給雜草和蕓苔屬植物，其中所述蕓苔屬植物在它的基因組中包含誘變過的乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)的編碼核酸分子的至少一個拷貝，所述核酸分子編碼除草劑-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在與SEQIDN0:23的位置A122相對應(yīng)的位置處的突變和在與SEQIDN0:23的位置S653相對應(yīng)的位置處的突變。本發(fā)明也提供了育種蕓苔屬植物的方法，其中所述方法包括使第一個蕓苔屬系與第二個蕓苔屬系雜交，其中所述第一個蕓苔屬系是通過栽培突變型蕓苔屬系的種子得到的蕓苔屬植物；并得到種子。這樣的突變型蕓苔屬系包括&1CL120C7，所述種子的樣品已經(jīng)在ATCC登記號PTA-9278下保藏；&1CL131A1，所述種子的樣品已經(jīng)在ATCC登記號PTA-9279下保藏；&1CL140B3，所述種子的樣品已經(jīng)在ATCC登記號PTA-9402下保藏；和&1CL140C7，所述種子的樣品已經(jīng)在ATCC登記號PTA-9403下保藏。也提供了命名為下述名稱的突變型蕓苔屬植物系的種子BnCL120C7，所述種子的樣品已經(jīng)在ATCC登記號PTA-9278下保藏；&1CL131A1，所述種子的樣品已經(jīng)在ATCC登記號PTA-9279下保藏；&1CL140B3，所述種子的樣品已經(jīng)在ATCC登記號PTA-9402下保藏；和&1CL140C7，所述種子的樣品已經(jīng)在ATCC登記號PTA-9403下保藏；PM1PM2/&1CL131A1，所述種子的樣品已經(jīng)在ATCC登記號PTA-10321下保藏。本發(fā)明也提供了編碼蕓苔屬乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)蛋白的分離的核酸分子，所述蛋白具有在與SEQIDN0:23的位置122相對應(yīng)的位置處的蘇氨酸。本發(fā)明另外提供了包含突變的核酸分子的蕓苔屬植物，所述核酸分子編碼蕓苔屬乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)蛋白，所述蛋白具有在與SEQIDN0:23的位置122相對應(yīng)的位置處的蘇氨酸。另外，本發(fā)明提供了能生成蕓苔屬植物的蕓苔屬種子，所述蕓苔屬植物包含編碼蕓苔屬乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)蛋白的突變的核酸分子，所述蛋白具有在與SEQIDNO:23的位置122相對應(yīng)的位置處的蘇氨酸。本發(fā)明另外提供了育種蕓苔屬植物的方法，其中所述方法包括使第一個蕓苔屬系與第二個蕓苔屬系雜交，其中所述第一個蕓苔屬系是通過培養(yǎng)突變系&1CL131A1的種子(所述種子的樣品已經(jīng)在ATCC登記號PTA-9279下保藏)得到的蕓苔屬植物；并得到種子。本發(fā)明也提供了非轉(zhuǎn)基因的蕓苔屬植物，其包含編碼AHAS蛋白的誘變過的核酸分子，所述蛋白具有在與SEQIDNO:23的位置A122相對應(yīng)的位置處的突變和在與SEQIDNO:23的位置S653相對應(yīng)的位置處的突變。也提供了用于生產(chǎn)耐受至少一種抑制AHAS的除草劑的非轉(zhuǎn)基因的蕓苔屬植物的方法，所述方法包括(a)向蕓苔屬植物細胞中導(dǎo)入在AHAS基因中具有定向突變的基因修復(fù)寡核堿基(oligonuclecAase)，以生成具有突變型AHAS基因的植物細胞，所述突變型AHAS基因表達在一個或更多個氨基酸位置處被突變的AHAS蛋白，所述位置與選自SEQIDN0:23的A122、R199、T203、S653和G654的位置相對應(yīng)；(b)在有抑制AHAS的除草劑存在下，鑒別與對應(yīng)的野生型植物細胞相比具有基本上正常生長的植物細胞；和(c)從所述植物細胞再生非轉(zhuǎn)基因的除草劑耐受性的具有突變的AHAS基因的蕓苔屬植物。另外提供了用于生產(chǎn)F1雜種蕓苔屬種子的方法，所述方法包括，使第一種蕓苔屬植物與第二種蕓苔屬植物雜交，所述第一種蕓苔屬植物具有編碼除草劑耐受性的蕓苔屬乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)蛋白的誘變過的核酸分子，所述蛋白具有在與SEQIDN0:23的位置A122相對應(yīng)的位置處的突變和在與SEQIDN0:23的位置S653相對應(yīng)的位置處的突變；并得到種子。也提供了植物細胞，其包含編碼AHAS蛋白的誘變過的核酸分子，所述蛋白具有在與SEQIDN0:23的位置A122相對應(yīng)的位置處的突變和在與SEQIDN0:23的位置S653相對應(yīng)的位置處的突變。也提供了用于增加植物的除草劑-抗性的方法，所述方法包括，使第一種蕓苔屬植物與第二種蕓苔屬植物雜交，其中所述第一種蕓苔屬植物在它的基因組中包含誘變過的乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)的編碼核酸分子的至少一個拷貝，所述核酸分子編碼除草劑-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在與SEQIDN0:23的位置A122相對應(yīng)的位置處的突變和在與SEQIDN0:23的位置S653相對應(yīng)的位置處的突變；并得到由雜交產(chǎn)生的種子。另外，提供了包含誘變過的核酸分子和至少一種編碼目標蛋白的其它核酸分子的蕓苔屬植物，所述誘變過的核酸分子編碼除草劑耐受性的蕓苔屬AHASL蛋白，所述除草劑耐受性的蕓苔屬AHASL蛋白包含在與SEQIDN0:23的位置A122相對應(yīng)的位置處的突變和在與SEQIDN0:23的位置S653相對應(yīng)的位置處的突變。另外提供了控制在蕓苔屬植物附近的雜草的方法，所述方法包括，將有效量的至少一種抑制AHAS的除草劑施用給雜草和蕓苔屬植物，其中所述蕓苔屬植物在它的基因組中包含第一種AHASL核酸分子的至少一個拷貝和至少一個第二種AHASL核酸分子，所述第一種AHASL核酸分子編碼除草劑-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在與SEQIDN0:23的A122和S653相對應(yīng)的氨基酸位置處的突變，所述第二種AHASL核酸分子編碼第二種除草劑-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有選自下述的突變A122T、P197S、A205V、W574L、S653N及其組合。圖1提供了蕓苔屬幼苗提取物中的AHAS活性的圖示。圖2提供了野生型蕓苔屬植物和含有本發(fā)明的突變的核酸分子的蕓苔屬植物的一個實例的除草劑噴霧分析的結(jié)果。圖3提供了本發(fā)明的核酸分子(分別是SEQIDNO11_16，按照出現(xiàn)的次序)之間的核酸序列比對。圖4提供了本發(fā)明的AHAS蛋白(分別是SEQIDNO17_21，按照出現(xiàn)的次序)之間的氨基酸序列比對。圖5提供了具有圖5所述氨基酸序列的擬南芥AHASL蛋白的核酸和氨基酸序列。DNA序列公開為SEQIDNO:22，氨基酸序列公開為SEQIDNO:23。具體實施例方式本公開內(nèi)容涉及來自抑制AHAS的除草劑-抗性的植物的編碼突變型乙酰羥酸合酶(AHAQ蛋白的分離的核苷酸和與其有關(guān)的方法。在一個實施方案中，所述分離的核酸分子編碼這樣的AHAS蛋白，其相對于野生型(即未突變的)歐洲油菜AHAS序列具有一個或更多個氨基酸置換。本公開內(nèi)容也提供了包含這樣的核酸分子的重組載體、以及含有這樣的載體和核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物。本公開內(nèi)容也提供了非轉(zhuǎn)基因植物，其包含突變的AHAS編碼序列，例如，誘變過的AHASIII編碼序列，所述序列相對于野生型序列具有2個或更多個氨基酸置換。突變的AHAS編碼序列可以具有在與擬南芥屬AHAS蛋白序列(圖5;SEQIDNO:23)的位置122相對應(yīng)的位置處和與位置653相對應(yīng)的位置處的氨基酸置換。也提供了制備這樣的植物的方法和使用這樣的植物的育種方法。在有些實施方案中，本發(fā)明的植物、種子、方法和組合物使用編碼具有突變的AHAS蛋白的核酸分子，所述突變導(dǎo)致具有在與位置122相對應(yīng)的位置處的丙氨酸-至-蘇氨酸置換和在與位置653相對應(yīng)的位置處的絲氨酸-至-天冬酰胺置換的AHAS蛋白(在本文中有時也稱作CLB-1)的表達。在其它實施方案中，本發(fā)明的植物、種子、方法和組合物使用編碼具有突變的AHAS蛋白的核酸分子，所述突變導(dǎo)致具有在與位置122相對應(yīng)的位置處被置換的選自精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸、甘氨酸、組氨酸、絲氨酸、脯氨酸、谷氨酸、門冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、異亮氨酸和纈氨酸的氨基酸和在與位置653相對應(yīng)的位置處被置換的選自精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸、甘氨酸、組氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、門冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的氨基酸的AHAS蛋白的表達。也提供了控制雜草的方法，其中使用含有本文提供的突變的AHAS序列的轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因植物。另外，本申請?zhí)峁┝嗽诒疚闹蟹Q作BnCL120C7、BnCL131Al、BnCL140B3、BnCL140C7的除草劑-抗性的蕓苔屬系，以及使用下面詳細描述的誘變方法生產(chǎn)的其種子、后代和衍生物。本發(fā)明也提供了增強的除草劑耐受性和用于得到增強的除草劑耐受性的方法，這通過在單個AHAS編碼序列中組合AHAS突變來實現(xiàn)。在一個實施例中，組合與擬南芥屬AHAS蛋白序列(圖5;SEQIDNO:23)的位置A122和S653相對應(yīng)的突變的植物表現(xiàn)出這樣的增強的除草劑耐受性。得到的除草劑耐受性顯著增強，例如，具有協(xié)同效應(yīng)，超過了當將在單獨地含有與位置A122或S653相對應(yīng)的任一個突變的植物中獲得的耐受性水平加到一起時觀察到的耐受性水平。在更詳細地描述本發(fā)明之前，首先定義下面的術(shù)語。定義“除草劑-耐受的”或“除草劑-抗性的”植物是指這樣的植物，其能耐受或抵抗至少一種抑制AHAS的除草劑，所述除草劑的水平通常會殺死或抑制缺少突變的AHAS核酸分子的正常的或野生型植物的生長。“除草劑-抗性的AHAS核酸分子”是指包含一個或更多個突變的核酸分子，所述突變導(dǎo)致相對于未突變的AHAS蛋白的一個或更多個氨基酸置換，其中所述突變導(dǎo)致除草劑-抗性的AHAS蛋白的表達?！俺輨?耐受的AHAS蛋白”或“除草劑-抗性的AHAS蛋白”是指，當存在已知會干擾AHAS活性的至少一種除草劑、且在已知會抑制野生型AHAS蛋白的AHAS活性的除草劑濃度或水平時，與野生型AHAS蛋白的AHAS活性相比，這樣的AHAS蛋白表現(xiàn)出更高的AHAS活性。此外，這樣的除草劑_耐受的或除草劑-抗性的AHAS蛋白的AHAS活性在本文中可以稱作“除草劑_耐受的”或“除草劑_抗性的”AHAS活性。對于本發(fā)明，術(shù)語“除草劑-耐受的”和“除草劑-抗性的”互換使用，且意在具有等效的含義和等效的范圍。類似地，術(shù)語“除草劑耐受性”和“除草劑抗性”互換使用，且意在具有等效的含義和等效的范圍。同樣地，術(shù)語“咪唑啉酮-抗性的”和“咪唑啉酮-抗性”可互換使用，且意在分別具有與術(shù)語“咪唑啉酮-耐受的”和“咪唑啉酮-耐受性”等效的含義和等效的范圍。使用在Singh,等kAnal.Biochem.,(1988)，171:173-179中公開的方法，通過在有諸如甲氧咪草煙(imazamox)等AHAS抑制劑存在下，對比從來自含有誘變過的AHAS序列的植物和來自缺少誘變過的AHAS序列的植物的細胞提取物的AHAS活性，可以測量“除草劑抗性”或“除草劑耐受性”。在一個實施方案中，當使用100μΜ甲氧咪草煙測定時，使用在Singh等人(1988)中公開的方法，抗性的或耐受性的植物表現(xiàn)出大于25%未抑制?！胺蛛x的，，或“純化的，，核酸分子或蛋白或其生物活性部分大體上或基本上不含這樣的組分，所述組分通常與核酸分子或蛋白相伴隨或相互作用(當在它的天然存在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)時)。因此，分離的或純化的核酸分子或蛋白，基本上不含其它細胞材料或培養(yǎng)基(當通過重組技術(shù)生產(chǎn)時)，或基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)(當化學(xué)合成時)。在一個實施方案中，“分離的”核酸基本上不含這樣的序列(優(yōu)選地，蛋白編碼序列)，其在該核酸所來源的生物體的基因組DNA中天然地側(cè)接該核酸(即，位于該核酸的5’和3’末端的序列)。例如，在不同的實施方案中，分離的核酸分子可包含小于約5kb,4kb,3kb,2kbUkb,0.51Λ或0.11Λ的核苷酸序列，所述核苷酸序列在該核酸所來源的細胞的基因組DNA中天然地側(cè)接該核酸分子。在有些實施方案中，分離的核酸分子側(cè)接它的天然基因組序列，它們控制它在細胞中的表達，例如，天然的啟動子或天然的3’非翻譯區(qū)?；旧喜缓毎牧系牡?3白包括具有低于大約30%、20%、10%、5%或1%(按干重計算)的污染性蛋白的蛋白制劑。當重組生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白或其生物活性部分時，優(yōu)選地，培養(yǎng)基具有低于大約30%、20%、10%、5%或1%(按干重計算)的化學(xué)前體或非目標蛋白的化學(xué)物質(zhì)。術(shù)語“野生型”用于表示可以在自然界中發(fā)現(xiàn)的核酸分子或蛋白，其不同于由人類人工地生產(chǎn)的或突變的。在一個實施方案中，“野生型”AHAS核酸序列是指圖3中的BN-02的核酸序列。類似地，野生型蕓苔屬植物是指具有圖3中的BN-02的核酸序列的蕓苔屬植物。該術(shù)語也用于表示含有圖3中的BN-02的AHAS核酸序列的植物。術(shù)語“野生型”的使用無意必然地暗示，該植物、植物組織、植物細胞或其它宿主細胞在它的基因組中缺少重組DNAdP/或不具有不同于本文公開的那些的除草劑-抗性的特征?！巴蛔兊摹狈肿踊颉巴蛔冃头肿印被颉罢T變過的”分子，諸如核酸分子或氨基酸分子，是指與未突變的或野生型分子的等效位置處的核酸或氨基酸相比，具有一個或更多個核酸或氨基酸置換、缺失或顛換的核酸分子或多肽。該術(shù)語表示從它的天然的或野生型形式修飾而成的核酸分子或多肽分子(作為故意人操作的結(jié)果)，且不包括天然序列。本文使用的術(shù)語“協(xié)同”、“協(xié)同的，，和其衍生詞(諸如在“協(xié)同效應(yīng)，，中)表示這樣的情況，其中2個或更多個突變的AHAS多肽的組合和/或單個編碼序列中的突變的組合(諸如編碼具有在與位置A122和S653相對應(yīng)的位置處的突變的AHAS多肽的AHAS核酸分子)的生物活性，比具有單個突變的AHAS多肽的生物活性的總和大至少10%。通過在用諸如甲氧咪草煙等抑制AHAS的除草劑處理之后15天，對比含有本發(fā)明的誘變過的分子的植物的損傷率和含有各個突變的植物的復(fù)合損傷率，可以測量AHAS多肽的生物活性?！暗刃恢谩被颉皩?yīng)位置”表示在與參照氨基酸位置相同的保守區(qū)域中的位置。例如，關(guān)于AHAS蛋白序列，本文公開的氨基酸位置對應(yīng)著在具有圖5所示的氨基酸序列(圖5；SEQIDNO:23)的擬南芥AHASL蛋白中的氨基酸位置。除非本文中另外指出，特定氨基酸位置表示在圖5所示的全長擬南芥AHASL氨基酸序列(SEQIDNO:23)中的該氨基酸的對應(yīng)位置。此外，實際氨基酸位置可以隨是否添加或刪除氨基酸(例如，從氨基酸序列的N-端)而異，但是，通過與諸如圖5(SEQIDNO:23)等參照序列的比對，仍然可以確定等效位置。因而，本發(fā)明包括在所述位置或等效位置(例如，“氨基酸位置653或等效位置”)處的氨基酸置換。“片段”是指編碼AHASL蛋白的核苷酸序列的一部分或本發(fā)明的AHAS蛋白的氨基酸序列的一部分。本發(fā)明的AHASL核苷酸序列的片段可以編碼AHASL蛋白的生物活性部分，或它可以是使用下述方法用作雜交探針或PCR引物的片段。AHAS多肽的片段可以包括AHAS蛋白的生物活性片段。術(shù)語“生物活性片段和變體”是指包含或編碼AHAS活性的例證的核酸分子和多肽的片段和變體。本文使用的術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”是指能調(diào)節(jié)可操作地連接的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核酸。調(diào)節(jié)元件包括、但不限于啟動子、增強子、內(nèi)含子、5’UTR和3’UTR0術(shù)語“可操作地連接的”是指調(diào)節(jié)元件和第二種核酸之間的功能連接，其中所述調(diào)節(jié)元件序列參與控制第二種核酸序列的表達，例如啟動和/或介導(dǎo)與第二個序列相對應(yīng)的DNA序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。通常，可操作地連接的是指，被連接的核酸序列是連續(xù)的，且在必要時，連接鄰近的且在相同讀碼框中的兩個蛋白編碼區(qū)。14本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”是指含有至少一個重組核酸分子的全部或一部分的任意細胞、組織、植物、植物細胞、愈傷組織、植物組織或植物部分。核酸分子在一個方面，本發(fā)明涉及與乙酰羥酸合酶大亞基(AHASL)序列有關(guān)的分離的核酸分子，所述AHASL序列包含相對于它來源的野生型(即天然的)核酸序列具有突變的核酸序列，以及包含這樣的突變的這種序列的片段。這樣的分離的核酸序列包括圖3和4的那些。在另一個方面，本公開內(nèi)容涉及包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列編碼相對于野生型蛋白具有突變的AHASL蛋白，其能提供對抑制AHAS的除草劑的耐受性或增強的抗性水平，還涉及這樣的突變型AHASL蛋白。在一個實施方案中，所述AHASL編碼序列是突變的蕓苔屬AHASL編碼序列，例如相對于野生型序列含有2個突變的歐洲油菜AHASIII編碼序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了編碼除草劑-抗性的蕓苔屬AHASLIII蛋白的核酸分子的分離和其核苷酸序列，其來自通過誘變野生型蕓苔屬植物生產(chǎn)的除草劑-抗性的蕓苔屬植物。所述核酸分子可以源自任意來源，諸如植物或細菌來源。在一個實施方案中，所述核酸分子源自植物來源，諸如蕓苔屬植物。從蕓苔屬植物衍生出的核酸分子可以源自任意蕓苔屬物種，包括歐洲油菜該naPUS)、憲菁(β.rapa)或芥菜(5.Jffi^m)。這樣的核酸分子可以源自任意的AHAS編碼序列，諸如AHASI,AHASII或AHASIII。在一個實施方案中，所述核酸分子在核酸序列中包含突變，所述突變是在與從AHASL編碼序列的ATG起始密碼子算起的氨基酸位置122(例如GCT—ACT)和/或653(例如AGT—AAT)處的密碼子序列相對應(yīng)的位置。但是，在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)，在與氨基酸位置122和653相對應(yīng)的位置處，可以產(chǎn)生任意突變。此外，在AHAS序列的位置122和653處的突變可以導(dǎo)致AHAS蛋白的表達，所述AHAS蛋白具有在與位置122相對應(yīng)的位置處的非丙氨酸的任意氨基酸或在與位置653相對應(yīng)的位置處的非絲氨酸的任意氨基酸。在一個實施方案中，在與位置122和653相對應(yīng)的位置處的突變可以是保守氨基酸置換，而在其它實施方案中，所述置換可以分別是在位置122和653處的蘇氨酸或天冬酰胺的保守置換。在另一個實施方案中，在與位置122相對應(yīng)的位置處的突變導(dǎo)致選自蘇氨酸和纈氨酸的氨基酸在該位置處的表達。在另一個實施方案中，在與位置653相對應(yīng)的位置處的突變導(dǎo)致天冬酰胺氨基酸的表達。在一個實施方案中，由本發(fā)明的核酸分子編碼的AHAS蛋白包含在與AHASL基因的位置653(基于擬南芥編號)相對應(yīng)的位置處的絲氨酸-至-天冬酰胺置換(例如S653N)和在與位置122相對應(yīng)的位置處的丙氨酸-至-蘇氨酸置換(例如A122T)。但是，在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)，可以在這些位置產(chǎn)生任意氨基酸置換，包括保守氨基酸置換。本發(fā)明另外公開了編碼野生型蕓苔屬AHASL蛋白的核酸分子的分離和其核苷酸序列。在有些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼具有突變的AHAS蛋白，所述突變導(dǎo)致具有在與位置122相對應(yīng)的位置處的丙氨酸-至-蘇氨酸置換和在與位置653相對應(yīng)的位置處的絲氨酸-至-天冬酰胺置換的AHAS蛋白的表達。在其它實施方案中，所述核酸分子編碼具有突變的AHAS蛋白，所述突變導(dǎo)致具有在與位置122相對應(yīng)的位置處被置換的選自精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸、甘氨酸、組氨酸、絲氨酸、脯氨酸、谷氨酸、門冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、異亮氨酸和纈氨酸的氨基酸和在與位置653相對應(yīng)的位置處被置換的選自精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸、甘氨酸、組氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、門冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的氨基酸的AHAS蛋白的表達。本發(fā)明的誘變過的AHAS多肽序列可以表現(xiàn)出對任意抑制AHAS的除草劑的抗性或耐受性。這樣的誘變過的AHAS多肽序列可以是對至少一種抑制AHAS的除草劑抗性的或耐受性的。在一個實施方案中，本發(fā)明的誘變過的AHAS多肽序列表現(xiàn)出對選自咪唑啉酮除草劑和磺酰脲除草劑的抑制AHAS的除草劑的抗性或耐受性。在另一個實施方案中，本發(fā)明的誘變過的AHAS多肽序列表現(xiàn)出對咪唑啉酮除草劑的抗性或耐受性。在有些實施方案中，具有在與位置A122和S653相對應(yīng)的位置處的突變的誘變過的AHAS序列會提供協(xié)同的除草劑耐受性水平。在一個實施方案中，與在含有具有各個單個突變的AHAS序列的植物中觀察到的耐受性累加水平相比，在含有本發(fā)明的雙突變型AHAS序列的植物中得到的除草劑耐受性水平高了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多。在具有在與位置A122和S653相對應(yīng)的氨基酸位置處的突變的誘變過的AHAS序列與一個或更多個額外的編碼AHAS-抑制劑耐受性AHAS蛋白的誘變過的或重組的AHAS序列的組合的植物中，也可以得到這樣的協(xié)同的除草劑耐受性水平。還公開了編碼歐洲油菜AHASIII蛋白的突變的核酸分子，所述蛋白具有在與位置122相對應(yīng)的位置處的丙氨酸-至-蘇氨酸置換(A122T)。在一個實施方案中，這樣的核酸分子也在核酸序列中含有第二種突變，例如在編碼在與位置653相對應(yīng)的位置處的絲氨酸-至-天冬酰胺置換(S653N)的核酸分子中。本公開內(nèi)容也提供了具有在圖3和4中所述的BN02-120或BN02-131的核酸序列的分離的核酸分子、及其片段和變體。本公開內(nèi)容也提供了編碼來自蕓苔屬的AHASL蛋白的分離的核酸分子，其具有一個或更多個核酸置換，所述核酸置換導(dǎo)致具有一個或更多個氨基酸置換的AHAS蛋白的表達。例如，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含在圖3和4中所述的BN02-120或BN02-131的核苷酸序列，編碼包含由圖4所述的BN02-102或BN02-131鑒別出的氨基酸序列的AHASL蛋白的核苷酸序列，圖3所述的核苷酸序列，編碼包含由圖4中的BN02-120或BN02-131所述的氨基酸序列的AHASL蛋白的核苷酸序列，和編碼功能性AHASL蛋白的這樣的核苷酸序列的片段和變體。除了與位置122和/或653相對應(yīng)的那些突變以外，本發(fā)明的誘變過的AHAS序列包括具有任意數(shù)目的突變的那些。例如，所述誘變過的AHAS序列可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個額外的突變，它們可以是沉默突變，或提供對相同或其它種類的抑制AHAS的除草劑的抗性或耐受性。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼圖3和4所示的氨基酸序列的核苷酸序列的分離的核酸分子，以及它們的編碼具有AHAS活性的多肽的片段和變體。另外提供了具有由本文所述的核酸分子(例如在圖3和4中所述的核苷酸序列(鑒別為BN02-120或BN02-131))編碼的氨基酸序列的多肽，和它們的編碼包含AHAS活性的多肽的片段和變體。本發(fā)明也提供了AHASL蛋白，其具有在本文公開的蕓苔屬AHASL蛋白的保守區(qū)域內(nèi)的鑒別的氨基酸位置處的氨基酸置換。本發(fā)明包括分離的或基本上純化的核酸或蛋白組合物。本發(fā)明提供了包含突變的AHAS蛋白的分離的多肽。所述分離的多肽包含選自下述的氨基酸序列圖4所述的BN02-120或BN02-131的氨基酸序列，由圖3所述的核苷酸序列BN02-120或BN02-131編碼的氨基酸序列，氨基酸序列，和編碼包含AHAS活性的AHAS多肽的所述氨基酸序列的功能片段和變體。公開的核酸分子可以用于核酸構(gòu)建體中，所述核酸構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化植物，例如，農(nóng)作物植物，諸如蕓苔屬植物。在一個實施方案中，含有本公開內(nèi)容的核酸分子的這種核酸構(gòu)建體可以用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，以提供對除草劑的抗性，所述除草劑例如已知會抑制AHAS活性的除草劑，諸如咪唑啉酮除草劑。所述核酸構(gòu)建體可以用于表達盒、表達載體、轉(zhuǎn)化載體、質(zhì)粒等中。用這樣的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化后得到的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出增加的對抑制AHAS的除草劑(例如，咪唑啉酮和磺酰脲除草劑)的抗性。因而，本發(fā)明包括AHASL核酸分子和其片段和變體。本發(fā)明也包括作為這些核苷酸序列的片段的核酸分子。在一個實施方案中，與來自野生型序列的對應(yīng)序列相比，所述片段包含至少一個突變的序列?？梢匀缦轮苽銩HAS蛋白的生物活性部分分離本發(fā)明的AHAS核苷酸序列之一的一部分，表達編碼的AHAS蛋白的部分(例如，通過在體外重組表達)，并評估編碼的AHAS蛋白的部分的活性。作為AHAS核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少約15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900個核苷酸，或高達在本文公開的全長核苷酸序列中存在的核苷酸的數(shù)目，這取決于預(yù)期用途。編碼本發(fā)明的AHAS蛋白的生物活性部分的AHAS核苷酸序列片段至少編碼約15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225或250個連續(xù)氨基酸，或高達在本發(fā)明的全長AHAS蛋白中存在的氨基酸總數(shù)?？捎米鱌CR引物的雜交探針的AHAS核苷酸序列片段通常不需要編碼AHAS蛋白的生物活性部分。在一個實施方案中，AHAS序列的片段包括一個或更多個本文公開的突變。本發(fā)明還包括作為本文公開的核苷酸序列的變體的核酸分子。本發(fā)明的AHAS核苷酸序列的“變體”包括這樣的序列，其編碼本文公開的AHAS蛋白，但由于遺傳密碼的簡并性而保守地不同。使用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)，例如下面概述的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)，可以鑒定這些天然存在的等位基因變體。變體核苷酸序列還包括合成地衍生出的核苷酸序列，其如下所述已經(jīng)通過例如使用定點誘變而產(chǎn)生，但仍編碼在本發(fā)明中公開的AHAS蛋白。一般地，本發(fā)明的核苷酸序列變體會與本文公開的特定核苷酸序列具有至少約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。變體AHAS核苷酸序列分別編碼具有這樣的氨基酸序列的AHAS蛋白，所述氨基酸序列與本文公開的AHAS蛋白的氨基酸序列具有至少約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。此外，技術(shù)人員還會認識到，可通過突變向本發(fā)明的核苷酸序列中引入變化，從而導(dǎo)致所編碼的AHAS蛋白的氨基酸序列的變化，而不改變AHAS蛋白的生物活性。因此，通過向本文公開的對應(yīng)核苷酸序列中引入一個或更多個核苷酸置換、添加或缺失，從而將一個或更多個氨基酸置換、添加或缺失引入所編碼的蛋白中，可以產(chǎn)生編碼AHAS蛋白的分離的核酸分子，所述核酸分子具有不同于圖3所述的BN02-120或BN02-131的序列的序列。通過標準技術(shù)，例如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變和本文所述的那些，可以導(dǎo)入突變。本發(fā)明還包括這樣的變體核苷酸序列。例如，在一個實施方案中，可在一個或更多個預(yù)測的非必需的氨基酸殘基處進行保守氨基酸置換?！胺潜匦璧摹卑被釟埢强蓮腁HAS蛋白的野生型序列k例如，圖5的序列(SEQIDNO:23))進行改變而不改變生物活性的殘基，而“必需的”氨基酸殘基是生物活性所必需的?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是這樣的置換，其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代。在本領(lǐng)域已定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，門冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如，，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。不對保守氨基酸殘基或存在于保守基序中的氨基酸殘基進行這樣的置換?？梢砸栽S多途徑來改變本發(fā)明的蛋白，包括氨基酸置換、缺失和插入。用于這樣的操作的方法在本領(lǐng)域中是普遍已知的。例如，通過DNA中的突變，可以制備AHAS蛋白的氨基酸序列變體。用于誘變和核苷酸序列改變的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。參見，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488—492;Kunkel^A(1987)MethodsinEnzymo1.154:367-382;美國專利號4，873，192;Walker和Gaastrgi,編(1983)TechniquesinMolecularBiology(MacMillanPublishingCompany,NewYork)和其中引用的參考文獻。關(guān)于不影響目標蛋白的生物活性的合適氨基酸置換的指南，可以參見Dayhoff等人，(1978)AtlasofProteinSequenceandStructure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型，所述參考文獻通過引用并入本文。保守置換，例如將一個氨基酸與另一個具有相似性質(zhì)的氨基酸互換，可以是優(yōu)選的?；蛘?，通過沿著AHAS編碼序列的全部或一部分隨機地引入突變(例如通過飽和誘變)，可以制得變體AHAS核苷酸序列，并可以就AHAS活性對所得的突變體進行篩選，以鑒定保留了AHAS活性(包括除草劑-抗性的AHAS活性)的突變體。誘變后，可重組地表達所編碼的蛋白，并可使用標準測定技術(shù)來確定蛋白的活性。因此，本發(fā)明的核苷酸序列包括本文公開的序列及其片段和變體。本發(fā)明的AHASL核苷酸序列及其片段和變體可用作探針和/或引物。這樣的探針可用于檢測編碼相同或同一蛋白的轉(zhuǎn)錄物或基因組序列。以該方式，可使用諸如PCR、雜交等方法來鑒定具有與本發(fā)明的序列相當大同一性的此類序列。參見，例如，Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:LaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NY),禾口Innis等人，(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NY)。本發(fā)明包括基于其與本文所示的AHAS核苷酸序列或其片段和變體的序列同一性而分離的AHASZ核苷酸序列。在雜交方法中，已知的AHAS核苷酸序列的全部或一部分可以用于篩選cDNA或基因組文庫。用于構(gòu)建這樣的cDNA和基因組文庫的方法在本領(lǐng)域中是普遍已知的，并公開于Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NY)中。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并可以用可檢測的基團(例如或任何其它可檢測的標記物(例如其它放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)進行標記。通過標記基于本文公開的已知AHAS核苷酸序列的合成的寡核苷酸，可以制備用于雜交的探針。另外可以使用簡并引物，所述簡并引物是基于在已知的AHAS核苷酸序列或所編碼的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸殘基而設(shè)計。探針通常包含這樣的核苷酸序列區(qū)域，其在嚴格條件下與本發(fā)明的AHAS核苷酸序列或其片段或變體的至少約12、優(yōu)選約25、更優(yōu)選約50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、600、700、800或900個連續(xù)核苷酸雜交。用于雜交的探針的制備在本領(lǐng)域中是普遍已知的，并公開于Sambrook(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork),該文獻通過弓丨用并入本文。例如，本文公開的完整的突變的AHAS核酸序列或者其一個或更多個部分可用作能夠特異性地與對應(yīng)AHAS序列和信使RNA雜交的探針。雜交技術(shù)包括涂板的DNA文庫的雜交篩選(斑或集落；參見，例如，Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)?？稍趪栏駰l件下進行此類序列的雜交?！皣栏駰l件”或“嚴格雜交條件，，意指這樣的條件，在該條件下，探針與其靶序列的雜交程度將會比與其它序列的雜交程度可檢測地更高(例如，為背景的至少2倍高)。嚴格條件是序列依賴性的，并且在不同的環(huán)境下是不同的。在一個實施方案中，嚴格條件是這樣的，其中，在pH7.O至8.3時，鹽濃度是小于約1.5MNa離子，通常為約0.01至1.0MNa離子濃度(或其它鹽)，并且對于短探針(例如，10至50個核苷酸)，溫度為至少約30°C，且對于長探針(例如，大于50個核苷酸)，溫度為至少約60°C。還可以通過加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來獲得嚴格條件。示例性的低嚴格條件包括，在37°C使用30-35%的甲酰胺、1MNaCl,1%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液進行雜交，和在50-55°C在IX至2XSSC(20XSSC=3.OMNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中進行洗滌。示例性的中等嚴格條件包括，在37°C在40-45%的甲酰胺、1.0MNaCl,1%SDS中進行雜交，和在55-60°C在0.5X至IXSSC中進行洗滌。示例性的高嚴格條件包括，在37°C在50%的甲酰胺、1MNaCl,1%SDS中進行雜交，和在60_65°C在0.1XSSC中進行洗滌。任選地，洗滌緩沖液可包含約0.1%至約1%SDS0雜交的持續(xù)時間通常小于約M小時，通常為約4至約12小時。特異性通常隨雜交后洗滌而變化，關(guān)鍵因素是離子強度和最終洗滌溶液的溫度。對于DNA-DNA雜交物，可根據(jù)Meinkoth和Wahl,(1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式:Tm=81.5°C+16.6(logΜ)+0.41(%GC)—0.61(%form)—500/L，估算出Tm；其中M是一價陽離子的摩爾濃度，%GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，%form是雜交溶液中甲酰胺的百分比，且L是以堿基對表示的雜交物的長度。Tm是這樣的溫度(在確定的離子強度和PH下)，即在該溫度下，50%的互補靶序列與完美匹配的探針雜交。對于每1%的錯配，Tm下降約1°C；因此，可調(diào)整Tm、雜交和/或洗滌條件，以與具有所希望的同一性的序列雜交。例如，如果尋找具有>90%的同一性的序列，那么可將Tm下降10°C。一般地，選擇嚴格條件，以使其比在確定的離子強度和PH下特定序列與其互補序列的熱解鏈點(Tm)低約5°C。然而，非常嚴格條件可在比熱解鏈點(Tm)低1、2、3或4°C下進行雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可在比熱解鏈點(Tm)低6、7、8、9或10°C下進行雜交和/或洗滌；低嚴格條件可在比熱解鏈點(Tm)低11、12、13、14、15或20°C下進行雜交和/或洗滌。使用公式、雜交和洗滌組合物、以及想要的Tm，普通技術(shù)人員將會理解，內(nèi)在地描述了雜交和/或洗滌溶液的嚴格度的變化。如果想要的錯配程度導(dǎo)致低于45°C(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)的Tm，則優(yōu)選地增加SSC濃度，以可以使用更高的溫度。關(guān)于核酸的雜交的詳盡指導(dǎo)，可以參見Tijssen,(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第1部分,第2章(Elsevier,NewYork)；禾口Ausubel等人編(1995)CurrentProtocoIsinMolecularBiology,第2章(GreenePublishingandffiley-Interscience,NewYork)。參見Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)。本發(fā)明的核酸分子和蛋白包括，包含與圖3和4所述的BN02-120或BN02-131的核苷酸序列充分同一的核苷酸或氨基酸序列的核酸分子和蛋白。術(shù)語“充分同一的”在本文中用于表示這樣的第一氨基酸或核苷酸序列，其相對于第二氨基酸或核苷酸序列而言包含足夠或最少數(shù)目的相同的或等同的(例如，具有相似的側(cè)鏈)氨基酸殘基或核苷酸，這樣第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的結(jié)構(gòu)域和/或共同的功能活性。例如，包含具有至少約45%、55%或65%同一性、優(yōu)選75%的同一性、更優(yōu)選85%、95%或98%的同一性的共同結(jié)構(gòu)域的氨基酸或核苷酸序列在本文中被定義為充分同一的。為了確定兩個氨基酸序列或兩個核酸的同一性百分比，以最佳比較目的對序列進行比對。兩個序列之間的同一性百分比隨這些序列共有的相同位置的數(shù)目而變化(即，同一性百分比=相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)(例如，重疊位置)χιοο)。在一個實施方案中，兩個序列長度相同。使用與下面描述的技術(shù)相似的技術(shù)，可以確定兩個序列之間的同一性百分比，其中允許或不允許缺口。在計算同一性百分比時，一般計算準確匹配的數(shù)目?？墒褂脭?shù)學(xué)算法來確定兩個序列之間的同一性百分比。用于兩個序列的比較的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選的非限定性實例是Karlin和Altschul，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264的算法，在Karlin和Altschul,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中改進的算法。將此類算法整合入Altschul等人，(1990)J.Mol.BioL215:403的NBLAST和XBLAST程序中?？墒褂肗BLAST程序，得分=100，字長=12，來進行BLAST核苷酸搜尋，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。可使用XBLAST程序，得分=50，字長=3，來進行BLAST蛋白搜尋，以獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的缺口比對(gappedalignment)，可以如Altschul等人，(1997)NucleicAcidsRes.25:3389中所述使用GappedBLAST?；蛘撸墒褂肞SI-Blast來進行可檢測分子之間遠緣關(guān)系的迭代搜尋。參見Altschul等人，(1997)，同上。當使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序時，可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個優(yōu)選并且非限定性實例是Myers和Miller，(1988)CABIOS4:11-17的算法。將此類算法整合入ALIGN程序(版本2.0)中，該程序是GCG序列比對軟件包的一部分。當使用ALIGN程序來比較氨基酸序列時，可使用PAM120權(quán)重殘基表(PAM120weightresiduetable)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分。也可通過目檢而人工地進行比對。20除非另外指出，本文提供的序列同一性/相似性值是指使用本發(fā)明的全長序列和使用多重比對而獲得的值，所述多重比對使用軟件包VectorNTIAdvance10(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中包含的程序AlignX(使用缺省參數(shù))或其任何等同的程序，通過算法ClustalW(NucleicAcidResearch,22(22):4673-4680,1994)來進行。“等同的程序”意指任何序列比較程序，其對于所研究的任何兩個序列，當與由軟件包VectorNTIAdvance10中的AlignX產(chǎn)生的對應(yīng)比對進行比較時，產(chǎn)生具有相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同的序列同一性百分比的比對。本發(fā)明的突變型AHASL蛋白包括公開的蛋白以及其變異和經(jīng)修飾的形式。這樣的變體將繼續(xù)擁有希望的AHAS突變型活性。在一個實施方案中，在編碼變體蛋白的核酸分子中的這種突變必須不能將序列置于讀碼框之外，且優(yōu)選地將不形成可產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補區(qū)。參見，歐洲專利申請發(fā)明者B·辛赫,C·肖普克,D·卡爾森,G·戈卡爾,J·皮爾斯,J·麥克埃爾弗,K·沃克,P·比薩姆申請人:巴斯夫農(nóng)化產(chǎn)品有限公司