專利名稱：：一種真菌代謝產(chǎn)物及其作為除草劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種玉蜀黍平臍蠕孢(Bipolarismaydis)菌株(PPF-001)，其代謝物或組合物，以及它們防除雜草的用途。
背景技術(shù)：
：馬唐[Digitariasanguinalis(L.)Scop.]是世界上危害最重的18種惡性雜草之一，在熱帶和溫帶地區(qū)危害嚴(yán)重，一年生，為歐洲的土著雜草，在北緯50。到南緯40°之間均有分布，據(jù)報(bào)道危害56個(gè)國家的33種作物，為甘蔗、花生、棉花、玉米、高梁田中的主要雜草，在咖啡、大豆、菠蘿、香蕉、土豆、向日葵、水稻等田中也危害較重。馬唐在我國為秋熟旱作物地惡性雜草，發(fā)生數(shù)量、分布范圍在旱地雜草中均居首位，以作物生長的前中期危害為主，常和毛馬唐混生危害。以秦嶺、淮河一線以北地區(qū)發(fā)生面積最大，長江流域、西南、華南也都有大量發(fā)生和危害。例如夏大豆田中馬唐發(fā)生嚴(yán)重的地塊，每平方尺502株，占雜草總株數(shù)的98.5%，造成減產(chǎn)達(dá)70%以上；而我國黃淮海棉區(qū)馬唐危害面積達(dá)51%。狗尾草也是一年生雜草，產(chǎn)生種子數(shù)量巨大，大量出現(xiàn)在春季作物田中，危害35個(gè)國家的29種作物?；瘜W(xué)除草劑具有作用迅速、使用方便等特點(diǎn)，在雜草治理中發(fā)揮了重要作用，特別是進(jìn)入20世紀(jì)以來，超高效除草劑磺酰脲類化合物的發(fā)現(xiàn)，將除草劑的開發(fā)和應(yīng)用推向一個(gè)新階段。但已有的化學(xué)除草劑的不斷應(yīng)用，也逐漸暴露其弊端，如除草劑的殘留、殘毒等原因引起作物的藥害，耐藥雜草種群的上升，環(huán)境污染日趨嚴(yán)重。進(jìn)入21世紀(jì)，除草劑仍將是同雜草作斗爭的有效武器，并將發(fā)揮更大的作用。隨著環(huán)境保護(hù)呼聲的日益提高，高毒性農(nóng)藥的大量使用對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境造成的負(fù)面影響已引起世界范圍的廣泛關(guān)注。為了保護(hù)人類生存的環(huán)境和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，除草劑的研制與使用將嚴(yán)格受到環(huán)境和生態(tài)的制約。生物源除草劑以其資源豐富、毒性小、不破壞生態(tài)環(huán)境、殘留少、選擇性強(qiáng)、對非靶標(biāo)生物和哺乳動物安全、環(huán)境兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，正逐步引起人們的重視。從若干真菌中分離出了對植物具有毒性的二苯醚類衍生物Cyperine，可作為開發(fā)除草劑的先導(dǎo)化合物。因此，探索微生物來源的除草活性物質(zhì)能夠有效防除雜草，并有利于環(huán)境保護(hù)。
發(fā)明內(nèi)容為獲得即環(huán)保又對禾本科雜草有效的微生物，發(fā)明人從全國各地采集了大量的寄生于禾本科雜草上的真菌標(biāo)本，通過篩選，發(fā)現(xiàn)一種屬于平臍蠕孢屬的菌株P(guān)PF-001，其抑制馬唐種子萌發(fā)的效果非常顯著。因此，本發(fā)明的目的是提供一種平臍蠕孢屬的新菌株P(guān)PF-001。本發(fā)明的新菌株P(guān)PF-001已經(jīng)于2009年4月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.2988，保藏地點(diǎn)為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。該菌株為玉蜀黍平臍蠕孢(Bipolarismaydis(Nisikado&Miyake)Shoemaker)[有性Cochliobolusheterostrophus(Drechsler)Drechsler]，隸屬于方定抱腔菌屬(CochliobolusDrechsler)[無性階段平臍蠕孢屬(BipolarisShoemarker)]，格孢腔菌科(PleosporaceaeNitschke)，格孢腔菌目(PleosporalesUittrellexBarr)，格孢月空菌亞纟岡(Pleosporomycetidae)，座囊菌纟岡(Dothideomycetes)，子囊菌門(Ascomycota)，真菌界(Fungi)。本發(fā)明的新菌株P(guān)PF-001是通過下述途徑獲得的。發(fā)明人對我國北方地區(qū)農(nóng)田、草坪、荒地的禾本科雜草發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查并采集發(fā)病的葉片和莖稈，記錄植株發(fā)病癥狀及有關(guān)信息，回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行鏡檢。1病原真菌的分離從發(fā)病部位的病健交界處切取組織塊2-5mm2，用0.1%升汞溶液進(jìn)行表面消毒3min，無菌水換洗3次，移入PDA培養(yǎng)基或CMA(玉米粉瓊脂)培養(yǎng)基平板上，26。C恒溫箱中培養(yǎng)。待菌落長出后，從組織塊菌落邊緣挑取少量菌絲，再次移入PDA平板上培養(yǎng)。經(jīng)過移植純化，菌落形態(tài)和孢子形態(tài)均一致的菌株分別移入PDA斜面培養(yǎng)、保存?zhèn)溆谩?病原真菌的鑒定2.1菌株的形態(tài)學(xué)鑒定將菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，26t:恒溫培養(yǎng)3天，記錄菌落形態(tài)，取直徑2cm的菌餅放在鋪有兩層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，4天后制做玻片，觀察記錄孢子形態(tài)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，測量孢子(30個(gè))和孢子梗寬度等，進(jìn)行詳細(xì)描述，查閱專著文獻(xiàn)進(jìn)行鑒定。2.2菌株的DNA提取、PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析在PDA平板上鋪玻璃紙，然后把供試菌株P(guān)PF-001接種到玻璃紙上，待菌落接近長滿平板時(shí)從玻璃紙上收獲菌絲體，用SDS法提取基因組DNA(LeeSB&TaylorJW，IsolationofDNAfromfungalmyceliaandsinglespores.In:I皿isMA，GelfandDH，SninskyJJ，WhiteTJed.PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications.AcademicPress,SanDiego，1990，282287.)，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度。以上述提取的基因組DNA為模板，用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')對供試菌株rDNA的ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)液體積50iiL，包括10XPCR緩沖液(100,1/LTris-HCl(pH8.8)，500mmol/LKCl，0.8%NonidetP-40)5iiL，25mmol/LMgCl25iiL，引物ITS4(10iimol/L)和ITS5(10iimol/L)各1iiL，lOmmol/LdNTP2yL，5U/iiLTaqDNA聚合酶0.4iiL，基因組DNAlyL，雙蒸滅菌水34.6iiL。PCR反應(yīng)程序95。C預(yù)變性2min后，95。C變性lmin，53。C復(fù)性lmin，72。C延伸2min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min，4t:保存。PCR產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠中電泳分離后，于溴化乙錠溶液(0.5iig/mL)中染色15min，通過ALPHA凝膠成像系統(tǒng)顯示記錄電泳結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測后送到上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，測序引物為ITS5。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方面研究的結(jié)果，將菌株P(guān)PF-001鑒定為Bipolarismaysis(Y.Nisik.&C.Miyake)Shoemaker。菌株P(guān)PF-001的形態(tài)學(xué)特征為在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周，菌落呈黑色帶白色扇形區(qū)域；在水瓊脂麥桿培養(yǎng)基(TWA+W)上，菌落灰褐色，平展，絨毛狀，表面氣生菌絲色淺，較短。分生孢子梗中至深黃褐色，頂端色淺，屈膝狀彎曲，單生或簇生，少分支，寬4.57.5iim。分生孢子淺黃褐色，擬紡錘形，明顯彎曲，光滑，510個(gè)(多89個(gè))假隔膜，50.0130.0X10.020.0iim，(平均80.0X15.0iim);臍部平截，略突出，明顯。此菌株的形態(tài)特征與專著(SivanesanA，1987.GraminicolousspeciesofBipolaris，Curvularia，Drechslera，Exserohilumandtheirteleomorphs.MycologicalPapers158:1-261)上Bipolarismaysis(Y.Nisik.&C.Miyake)Shoemaker的描述一致。將此菌株提取的DNA進(jìn)行了rDNAITS序列測定，測得的序列采用Blast程序與GenBank上的序列進(jìn)行同源性比較，菌株P(guān)PF-001與GenBank上B.maysis的序列AF158107(BerbeeML，PirseyediMandHubbardS，1999.Cochliobolusphylogeneticsandtheoriginofknown,highlyvirulentpathogens，inferredfromITSandglyceraldehydes_3_phosphatedehydrogenasegenesequences.Mycologia91(6):961-977.)相似率達(dá)100%。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方面序列特征的比對結(jié)果，均支持此菌株的分類學(xué)命名為Bipolarismaysis(Y.Nisik.&C.Miyake)Shoemaker。本發(fā)明還提供一種除草組合物，包含本發(fā)明的玉蜀黍平臍蠕孢新菌株P(guān)PF-001的培養(yǎng)物或其無菌濾液和農(nóng)藥領(lǐng)域常用的載體。所述菌株P(guān)PF-001的培養(yǎng)物可以以被培養(yǎng)的活細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物的無菌濾液或細(xì)胞與濾液的混合物的形式用于除草組合物中，所述的活細(xì)胞可以是分生孢子、菌絲或含有分生孢子和菌絲的菌絲體的形式，優(yōu)選使用該菌株的無菌濾液。含有菌株P(guān)PF-001和載體的本發(fā)明除草組合物可被加工成多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑、水分散粒劑等，優(yōu)選加工成適于噴灑施用的劑型。上述劑型所使用的載體是農(nóng)藥領(lǐng)域常用的且在生物學(xué)上是惰性的載體，可以是固體的或液體的形式。固體載體的實(shí)例包括礦物，如粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻土；植物材料，如玉米粉、豆粉或淀粉；高分子化合物，如聚乙烯醇、聚二醇。液體載體的實(shí)例包括各種有機(jī)溶劑，如癸烷和十二烷；植物油；礦物油和水。根據(jù)需要，本發(fā)明的除草組合物可使用表面活性劑、粘合劑、穩(wěn)定劑等助劑，表面活性劑如吐溫20、吐溫so等，穩(wěn)定劑可使用抗氧化劑和/或ra調(diào)節(jié)劑等。本發(fā)明的除草組合物可以與其它適合的化學(xué)除草劑配合使用，從而降低化學(xué)除草劑的用量，減少對環(huán)境的污染。本發(fā)明的菌株P(guān)PF-001或除草組合物可用于防除禾本科雜草馬唐，抑制馬唐種子的萌發(fā)。本發(fā)明的菌株P(guān)PF-001或除草組合物可用于馬唐危害的農(nóng)田和園林中，優(yōu)選用于雙子葉植物、果園以及園林環(huán)境中防除馬唐。本發(fā)明的除草劑對環(huán)境友好，可抑制雜草的耐藥和抗藥性發(fā)展，有利于綠色食品和有機(jī)農(nóng)業(yè)的推廣，并且成本低、無污染、對農(nóng)作物安全。生物學(xué)試驗(yàn)1菌株P(guān)PF-001孢子懸浮液對馬唐的致病性測定將馬唐種子播于直徑8cm的塑料花盆中，在溫度為20_30°C的溫室中培育，待馬唐長至3-4葉期，選取12盆，每盆保留生長一致馬唐植株10株待用。待測菌株P(guān)PF-001接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)或玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)平板26t:恒溫箱中培養(yǎng)。兩周后，將菌落用刮鏟輕輕刮下，經(jīng)兩層紗布過濾，用含有O.1%吐溫-80的滅菌水配制懸浮液，稀釋至血球計(jì)數(shù)板測得濃度為1X105個(gè)孢子/ml。接種采用孢子懸浮液噴霧法，用微型噴霧器將混勻的孢子懸浮液均勻噴灑到已準(zhǔn)備好的馬唐植株上；對照噴含0.1%吐溫-80的無菌水；對照和孢子懸浮液接種馬唐各6盆。接種后的植株置于密閉容器內(nèi)室溫下保濕培養(yǎng)24h，然后移到人工氣候箱中培養(yǎng)，每天光照/黑暗交替12h，光照度16500Lx，溫度32t:/25°C(光照/黑暗)、相對濕度80%。在兩周內(nèi)調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算馬唐植株的死亡率。接種馬唐后，對照馬唐死亡率為O，菌株P(guān)PF-OOl接種后馬唐死亡率為100%。2菌株P(guān)PF-001無菌濾液對馬唐及其他植物種子萌發(fā)的抑制率測定無菌濾液的準(zhǔn)備250ml三角瓶中加入100ml液體PD(PDA去掉瓊脂)培養(yǎng)基，滅菌后備用。用打孔器取三個(gè)菌株P(guān)PF-OOl的菌餅，無菌操作條件下接入PD液體培養(yǎng)基中，搖床上23°C，80rpm，培養(yǎng)一周后，用中速濾紙過濾菌液，得到足夠量的無菌濾液。將馬唐和其他植物種子(供試植物名單見表2)用1%的H202浸泡24hr，加入無菌水放入12hr光照/黑暗交替的培養(yǎng)箱中催芽至露白。取滅菌培養(yǎng)皿，每皿加入2張中速濾紙，選取催芽后的馬唐種子20粒置于培養(yǎng)皿中濾紙上，每培養(yǎng)皿為1處理，重復(fù)3次；其他植物種子根據(jù)種子大小不同置培養(yǎng)皿上5-20粒種子，也是每皿為1處理，重復(fù)3次。將滅菌水和無菌濾液各10ml，分別加入3個(gè)放有露白種子的培養(yǎng)皿中，一周后記錄種子萌發(fā)數(shù)，計(jì)算萌發(fā)抑制率，測量萌發(fā)后種子的根、莖長，用SPSS11.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)獨(dú)立樣本T-test分析O.1%水平的差異顯著性。種子萌發(fā)率(％)=萌發(fā)種子數(shù)/供試種子總數(shù)X100%平均根(芽)生長抑制率(％)=[對照平均根(芽)長-處理平均根(芽)長]/對照平均根(芽)長X100%。2.1菌株P(guān)PF-001無菌濾液對馬唐種子的抑制作用對照馬唐種子發(fā)芽率為100%，菌株P(guān)PF-001無菌濾液處理馬唐種子的發(fā)芽率為41.7%，抑制58.3%的馬唐種子萌發(fā)(見表1)。平均根生長抑制率(%)=(3.8467-0.2333)/3.8467X100%=93.9%。平均芽生長抑制率(％)=(1.1683-0.5074)/1.1683X100%=56.6%。無菌濾液處理的馬唐平均根(芽)長度跟對照用無菌水處理的差異極顯著，無菌濾液處理后明顯抑制馬唐根(芽)的生長。2.2菌株P(guān)PF-001無菌濾液對狗尾草種子的抑制作用對照和用菌株P(guān)PF-001無菌濾液處理的狗尾草種子發(fā)芽率均為98.3%，無菌濾液和對照的處理相比，對狗尾草種子萌發(fā)率抑制不明顯(見表l)。但無菌濾液處理的狗尾草平均根(芽)長度跟對照用無菌水處理的差異極顯著，無菌濾液處理后明顯抑制狗尾草根(芽)的生長。平均根生長抑制率(%)=(0.3-0.12)/0.3X100%=60%。平均芽生長抑制率(%)=(1.0746-0.5729)/1.0746X100%=46.7%。表1對照和處理的馬唐和狗尾草種子萌發(fā)情況表6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.3菌株P(guān)PF-001無菌濾液對幾種植物種子的抑制試驗(yàn)無菌濾液處理對谷子、萵苣、豌豆和豇豆根、芽抑制率與對照相比差異不顯著，對谷子的芽和豌豆根的生長有促進(jìn)作用(見表2)。表2菌株P(guān)PF-001對不同植物種子萌發(fā)的致病性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注**表示在0.001水平上差異極顯著'權(quán)利要求一種玉蜀黍平臍蠕孢菌的菌株P(guān)PF-001，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏日期2009年4月1日；保藏號CGMCCNo.2988。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株P(guān)PF-001，其形態(tài)學(xué)特征為在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周，菌落呈黑色帶白色扇形區(qū)域；在水瓊脂麥桿培養(yǎng)基(TWA+W)上，菌落灰褐色，平展，絨毛狀，表面氣生菌絲色淺，較短。分生孢子梗中至深黃褐色，頂端色淺，屈膝狀彎曲，單生或簇生，少分支，寬4.57.5iim。分生孢子淺黃褐色，擬紡錘形，明顯彎曲，光滑，510個(gè)(多89個(gè))假隔膜，50.0130.0X10.020.Oiim，(平均80.0X15.0iim);臍部平截，略突出，明顯。3.—種除草組合物，包含權(quán)利要求1所述的菌株P(guān)PF-OOl的培養(yǎng)物或其無菌濾液和農(nóng)藥領(lǐng)域常用的載體。4.權(quán)利要求1所述菌株P(guān)PF-OOl的無菌濾液。5.權(quán)利要求1的菌株P(guān)PF-OOl用于防除禾本科雜草的用途。6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其用于防除雙子葉作物農(nóng)田、園林和草坪環(huán)境中的禾本科雜草。7.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，所述禾本科雜草是狗尾草或馬唐。全文摘要本發(fā)明涉及一種菌株P(guān)PF-001，該菌株屬于玉蜀黍平臍蠕孢Bipolarismaydis(Y.Nisik.&C.Miyake)Shoemaker，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2009年4月1日，保藏號CGMCCNo.2988。本發(fā)明還涉及菌株P(guān)PF-001的培養(yǎng)物或其無菌濾液和農(nóng)藥領(lǐng)域常用載體的除草組合物，以及用于防除禾本科雜草馬唐和狗尾草的用途。采用濃度為1×105個(gè)孢子/ml的孢子懸浮液接種馬唐后死亡率為100％，該菌株的無菌濾液明顯抑制馬唐根、芽的生長，抑制率分別為93.9％和56.6％。文檔編號A01N63/04GK101735956SQ20101000023公開日2010年6月16日申請日期2010年1月5日優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日發(fā)明者牛永春,鄧暉申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所