專利名稱：一株衣藻藻株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物能源領(lǐng)域，具體地涉及一種衣藻及其制備生物柴油的應(yīng)用，更具 體地，本發(fā)明涉及一株新的衣藻藻株，其油脂含量較好，可用于制備生物柴油、飼料或食用 油的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著日益嚴(yán)重的環(huán)境惡化，控制汽車尾氣排放和溫室效應(yīng)，保護(hù)人類賴以生存的 自然環(huán)境成為人類急需解決的問(wèn)題。同時(shí)全球能源需求不斷擴(kuò)大，尋求可以替代石油在能 源結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位的可再生清潔能源是目前普遍關(guān)注的熱點(diǎn)。微藻是一類在水中生長(zhǎng)的種類繁多且分布極其廣泛的低等植物，它是由陽(yáng)光驅(qū)動(dòng) 的細(xì)胞工廠，通過(guò)微藻細(xì)胞高效的光合作用，吸收CO2,將光能轉(zhuǎn)化為脂肪或淀粉等化合物 的化學(xué)能，并放出02。微藻是光合效率最高的原始植物，也是自然界中生長(zhǎng)最為迅速的一種 低等植物，而且某些微藻可以生長(zhǎng)在高鹽、高堿環(huán)境的水體中，可充分利用灘涂、鹽堿地、沙 漠進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，也可利用海水、鹽堿水、工業(yè)廢水等非農(nóng)用水進(jìn)行培養(yǎng)，還可以利用工 業(yè)廢氣中的co2。利用微藻生產(chǎn)生物柴油能夠解決目前使用植物原料發(fā)展生物柴油面臨的 耕地不足、氣候變化對(duì)產(chǎn)量影響大和引起農(nóng)作物價(jià)格上漲等突出問(wèn)題。因此，微藻生物柴油 作為可再生清潔能源成為了潛在的能源研究熱點(diǎn)。衣藻(Chlamydomonas)亦稱“單衣藻”。綠藻門、團(tuán)藻目、衣藻科中的衣藻屬。藻 體為單細(xì)胞，球形或卵形，前端有兩條等長(zhǎng)的鞭毛，能游動(dòng)。鞭毛基部有伸縮泡兩個(gè)；另在細(xì) 胞的近前端，有紅色眼點(diǎn)一個(gè)。載色體大型杯狀，具淀粉核一枚。無(wú)性繁殖產(chǎn)生游動(dòng)孢子； 有性生殖為同配、異配和卵式生殖。在不利的生活條件下，細(xì)胞停止游動(dòng)，并進(jìn)行多次分裂， 外圍厚膠質(zhì)鞘，形成臨時(shí)群體稱“不定群體”。環(huán)境好轉(zhuǎn)時(shí)，群體中的細(xì)胞產(chǎn)生鞭毛，破鞘逸 出。其中的萊茵衣藻是一種單細(xì)胞真核鞭毛藻類，是研究多種生命活動(dòng)(如光合作用、生理 節(jié)律和趨光性等)的模式生物，與酵母細(xì)胞有許多共同的特征，素有“光合酵母”之稱。關(guān) 于衣藻基因方面的研究有大量報(bào)道，如專利CN200610026203. 3衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基 因CrmRFP、其合成方法及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，CN200810066705. 8表達(dá)人組織激肽 釋放酶的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的構(gòu)建方法，CN 200610018306. 5 —種萊茵衣藻外源基因表達(dá)系 統(tǒng)及其構(gòu)建生產(chǎn)PHB轉(zhuǎn)基因藻的方法，卻未見(jiàn)衣藻生產(chǎn)生物柴油的報(bào)道，本發(fā)明提供了一 種含油量較高的衣藻，其可以進(jìn)一步進(jìn)行基因改造。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)油衣藻及其在生物能源領(lǐng)域的應(yīng)用。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一株衣藻藻株DQA-Ol (Chlamydomonas sp. DQA-01)， 保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)為CGMCC No. 3577。此 衣藻藻粉含油量占干重量的—一50%，其油脂可以做成生物柴油，飼料或食用油；所 述的產(chǎn)油衣藻是屬于衣藻屬的一個(gè)新種，命名為DQA-01，與作為基因工程中微藻模式生物的萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)在進(jìn)化樹(shù)上非常相近，可為能源微藻基因工程 改造提供材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述衣藻藻株DQA-Ol在15-35°C的溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)， 溫度優(yōu)選為23°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述衣藻藻株DQA-Ol在培養(yǎng)過(guò)程光照強(qiáng)度控制在 50-—200umol/m2. s。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述衣藻藻株在光照強(qiáng)度150-300umol/m2. s誘導(dǎo) 下積累油脂。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述衣藻藻株首先在60umol/m2. s培養(yǎng)，在第3天時(shí)將光 強(qiáng)加大到120umol/m2. s，在第7天時(shí)將光強(qiáng)加大到200umol/m2. s。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 衣藻藻株DQA-Ol在培養(yǎng)期間將培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)在7-9之間，優(yōu)選pH為7. 2。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供篩選所述含油衣藻的方法，所述方法包括下述步 驟1)藻樣采集，選擇含有多種藻類的污染河流、湖泊或沼澤地，使用藻樣采集器進(jìn)行 藻樣采集；2)藻種分離純化，利用稀釋鋪平板法或毛細(xì)管法將混合在一起的多種藻種進(jìn)行分 離，得到單個(gè)藻種的純?cè)逯辏?)藻種培養(yǎng)及油脂誘導(dǎo)，將純?cè)逯暝贐Gll培養(yǎng)基，25°C下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)藻的濃度 達(dá)到l_8g/l的時(shí)候，加強(qiáng)光進(jìn)行油脂誘導(dǎo)；4)油脂含量測(cè)定，取油脂誘導(dǎo)后的藻進(jìn)行尼羅紅染色，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察， 選擇熒光比較多的藻種，從而快速得到含油較高的藻種。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包 括對(duì)純?cè)逯赀M(jìn)行藻種鑒定，通過(guò)形態(tài)和分子相結(jié)合的方法確定藻種在進(jìn)化樹(shù)中的位置的步
馬聚ο在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)生物柴油的方法，所述方法特征在于使用 本發(fā)明提供的所述衣藻藻株DQA-Ol進(jìn)行。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)飼料的方法，所述方法特征在于使用本發(fā) 明提供的所述衣藻藻株DQA-Ol進(jìn)行。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)食用油的方法，所述方法特征在于使用本 發(fā)明提供的所述衣藻藻株DQA-Ol進(jìn)行。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種對(duì)衣藻藻株進(jìn)行基因改造的方法，所述方法特 征在于使用本發(fā)明提供的所述衣藻藻株DQA-Ol進(jìn)行。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供所述衣藻藻株DQA-Ol用于制備生物柴油、飼料或食 用油的應(yīng)用。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供所述衣藻藻株DQA-Ol用于制備基因改造藻株的應(yīng)用。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種飼料，其由本發(fā)明提供的所述衣藻藻株DQA-Ol 制備而來(lái)。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種食用油，其由本發(fā)明提供的所述衣藻藻株 DQA-Ol制備而來(lái)。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種生物柴油，其特征在于，其是通過(guò)培養(yǎng)本發(fā)明提 供的衣藻藻株DQA-01，并從中分離油脂制備而來(lái)。本發(fā)明中的衣藻藻體為單細(xì)胞，球形或卵形，前端有兩條等長(zhǎng)的鞭毛，能游動(dòng)。鞭 毛基部有伸縮泡兩個(gè)；另在細(xì)胞的近前端，有紅色眼點(diǎn)一個(gè)。載色體大型杯狀，具淀粉核一
4枚。無(wú)性繁殖產(chǎn)生游動(dòng)孢子；有性生殖為同配、異配和卵式生殖。在不利的生活條件下，細(xì) 胞停止游動(dòng)，并進(jìn)行多次分裂，外圍厚膠質(zhì)鞘，形成臨時(shí)群體稱“不定群體”。環(huán)境好轉(zhuǎn)時(shí)，群 體中的細(xì)胞產(chǎn)生鞭毛，破鞘逸出。其用于藻種鑒定的ITS序列是(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG GTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGAATCTATCACAATCCACAACCCGCGAACCATACTGTTGGCCTTC CTTGGTTTCGGCCAAGGAGCCAGGCTCTGTCGGTGCTCACGCGCCGTACGGCAGCCTGGGTCGCCTGCCCAATTAAT TATTAATTAATTAGCTGGGCCGGCGTCGGTCTCTTAACCAACCACACACCAAACATAACAATAATAAAAAACGAGCG CTTGGCTTAGAGCCGACGCTCACCAACCAAAGACAACTCTCAACAACGGATATCTTGGCTCTCATAACGATGAAGAA CGCAGCGAAATGCGATACGTAGTGCGAATTGCAGAAATACGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAAATTGCGCTCGA GGCTTCGGCCAAGAGCATGTCTGCCTCAGCGTCGGGTTAATACTCGCCTGCTGCACTGCCTGTGCATGCAAGCGGAG CTGGCTGTCTCGGCCCCTCGTAAAACAGGTGCCGGGTCTGCTGAAGTACAGAGGTTGATGCATGGACCCGCTCATGG GCCTCAACTGGGTAGGCAACTCGTTGCTAATGCTTTAGTTGATGGCTTGGATCCGCGCTTGTCGACCCGAACCAGGA ACTCGGCTTCTGCCGAGCAAACCCCTCATTTTCTCGACCTGAGCTCAGGCAAGAACACCCGCTGAACTTAAGCATAT CAATAAGCGGAGGA) (SEQ ID NO :1)，與最相近的 Chlamydomonas callosa 的相似度為 89%, 是衣藻屬的一個(gè)新種。發(fā)明人已將所述衣藻DQA-Ol藻株(Chlamydomonas sp. DQA-01)于2010年1月6 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào)，簡(jiǎn)稱CGMCC)，其保藏號(hào)為CGMCCNo. 3577。發(fā)明效果本發(fā)明分離的衣藻藻株在高光的情況下可以積累占干重20%以上的油脂，其油具 有很好的流動(dòng)性，是品質(zhì)比較好的油脂。此株衣藻本身就含有比較高油脂的特征，將對(duì)微 藻生物柴油利用基因工程改造突破現(xiàn)有能源微藻產(chǎn)量低、成本高等難題具有十分重要的意 義。


圖1為根據(jù)DQA-Ol藻株的ITS及5. 8S部分序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)。圖2為DQA-Ol藻株的顯微照片圖3為DQA-Ol藻株的油脂尼羅紅染色熒光顯微照片圖 4 為 DQA-Ol 藻 ITS 序列與 genebank 中 Chlamydomonas callosa 比對(duì)結(jié)果照片本發(fā)明的創(chuàng)新性目前用于基因工程改造的衣藻是不產(chǎn)油或產(chǎn)油非常少的藻種，而其它含油量高的 藻株在基因改造方面難度比衣藻大。本發(fā)明中提供的微藻不僅產(chǎn)油，而且是衣藻屬的一個(gè)物種，為產(chǎn)生物柴油的微藻 基因改造提供了操作性簡(jiǎn)便的材料。下面將通過(guò)具體實(shí)施方式
來(lái)對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行說(shuō)明。但是本發(fā)明的保 護(hù)范圍并不受所述實(shí)施例的限制。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1篩選含油衣藻藻株取無(wú)菌水稀釋后的從達(dá)旗地區(qū)取回的小河水水樣，在400倍顯微鏡觀察后，大約
5細(xì)胞濃度為800-1200個(gè)/ml，用毛細(xì)管取大約Iul的藻液，接種于48孔裝有BGl 1培養(yǎng)基的 培養(yǎng)板中，在25°C、光照強(qiáng)度為50umol/m2. s情況下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)達(dá)到一定細(xì)胞濃度時(shí)，顯微 鏡觀察，選擇只有單藻株的孔，進(jìn)行鋪平板，得到單藻株。將純?cè)逯暝贐Gll培養(yǎng)基中，25°C、光照強(qiáng)度為50umol/m2. s下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)藻的濃 度達(dá)到3g/l的時(shí)候，加開(kāi)燈管，使光強(qiáng)達(dá)到250umol/m2. s，進(jìn)行油脂誘導(dǎo)；將單藻株進(jìn)行尼羅紅染色，藻內(nèi)油脂被染上了色，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察(見(jiàn) 圖3)，選擇熒光多的藻株，即為油脂含量高的藻株。將分離出來(lái)的含油量較高的藻株命名為 DQA-O1。實(shí)施例2確定藻種在講化樹(shù)上的分類。藻株鑒定采取形狀鑒定和分子鑒定相結(jié)合。形狀鑒定(見(jiàn)圖2)對(duì)上述分離出來(lái)的藻株DQA-Ol在1000倍顯微鏡進(jìn)行觀察， 發(fā)現(xiàn)藻體為單細(xì)胞，球形或卵形，前端有兩條等長(zhǎng)的鞭毛，能游動(dòng)。鞭毛基部有伸縮泡兩個(gè)； 另在細(xì)胞的近前端，有紅色眼點(diǎn)一個(gè)。載色體大型杯狀，具淀粉核一枚。無(wú)性繁殖產(chǎn)生游動(dòng) 孢子；有性生殖為同配、異配和卵式生殖。在不利的生活條件下，細(xì)胞停止游動(dòng)，并進(jìn)行多次 分裂，外圍厚膠質(zhì)鞘，形成臨時(shí)群體稱“不定群體”。檢索《中國(guó)淡水藻類一系統(tǒng)、分類及生 態(tài)》，發(fā)現(xiàn)此藻在形態(tài)上分類相同的為綠藻門、綠藻綱、團(tuán)藻目、衣藻科、衣藻屬。分子鑒定A，從分離的衣藻擴(kuò)增其ITS及5. 8S部分核苷酸序列用CTAB法提取培養(yǎng)4天的DQA-Ol藻基因組DNA。取一定量的細(xì)胞，研磨處理后加 入適量CTAB緩沖液，勻漿，加入等體積的酚氯仿抽提，等體積異丙醇沉淀，75 %乙醇洗滌 后溶于一定體積滅菌雙蒸水中，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。ITS序列擴(kuò)增采用真核生物ITS擴(kuò)增通用引物(引物合成由上海生工生物工程公 司合成)。引物 1 5，GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3，引物 2 5’ GCATATCAATAAGCGGAGGA 3’取1 μ 1總DNA為模板。擴(kuò)增條件如下94°C變性5min，然后94°C 40s, 56V 40s, 72°C 2min 30個(gè)循環(huán)，最后72°C IOmin0 1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR擴(kuò) 增獲得約750bp片斷。序列如SEQ IDNO :1所顯示。B，所克隆的核苷酸序列同源性搜索將獲得的DQA的ITS及5. 8S部分序列登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié) 果顯示與 ACCESSION 號(hào)為 U66945 的 Chlamydomonascallosa 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 1 (ITSl)， 5. 8S核糖體RNA及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)序列具有較高的相似性達(dá)89% (見(jiàn)圖4)，該 Chlamydomonas callosa 序列，I- 217bp 為 ITSl 序列，218-378 為 5. 8S 核糖體 RNA 基因序 列，377-625 為 ITS2 序列。C，根據(jù)上述序列作出進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖1。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST工具對(duì)藻株DQA的ITS部分序列進(jìn)行序列相似性 分析。選取部分同源序列和該藻株的ITS部分序列利用ClustaLx軟件包進(jìn)行序列同源 進(jìn)化比對(duì)，形成一個(gè)多重序列匹配排列矩陣。然后，運(yùn)用Mega4. 0軟件，采用鄰位相連 (Neighbor-joining)算法，自展數(shù)據(jù)集bootstraps值為1000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。
根據(jù)形態(tài)和ITS blast的結(jié)果，限定DQA-01為衣藻屬-ChlamydomonasSp的一個(gè) 新種。發(fā)明人已將所述藻株于2010年1月6日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，簡(jiǎn)稱CGMCC)，其保藏號(hào)為CGMCC No.3577。實(shí)施例3衣藻油脂積累將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻種接種在配制好的培養(yǎng)基中，通過(guò)光強(qiáng)的調(diào)節(jié)進(jìn)行生長(zhǎng)培 養(yǎng)和油脂誘導(dǎo)培養(yǎng)。進(jìn)行衣藻油脂積累的培養(yǎng)基和一般方法如下A，培養(yǎng)基配制根據(jù)下表BGl 1配方進(jìn)行培養(yǎng)基配制NaNO30. 8—1. 5g/lK2HPO4. 3H200. 02-0. 08g/lMgSO4. 7H200. 075g/lCaCl2. 2H200. 036g/lcitric acid0.006g/lFerric ammonium citrate0.006g/lEDTA(dinatrium-salt)0.001g/lNa2CO30. 02g/lA5+Co solution*Iml去離子水919ml*A5+Co solution 的組成成分加到1000ml去離子水中H3BO32. 86gMnCl2. H2O1. 81gZnSO4. 7H200. 222gCuSO4. 5H200. 079gNa2MoO4. 2H200. 390gCo (NO3) 2. 6H200. 049gB，接種將所述衣藻藻株DQA-01綠色游動(dòng)細(xì)胞接種在配置好的培養(yǎng)基中，使細(xì)胞密度達(dá) 到 OD75tl 為 0. 2-—0. 8 之間。C,培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程光照強(qiáng)度控制在50-200umOl/m2. s,利用通氣使藻株在培養(yǎng)基中保持均 勻，溫度調(diào)控在15-35°C范圍內(nèi)，在培養(yǎng)期內(nèi)，通過(guò)向培養(yǎng)液中通人二氧化碳，將培養(yǎng)基的 PH值調(diào)節(jié)在7-9之間。D，油脂積累誘導(dǎo)從培養(yǎng)的第5天起，加大光照強(qiáng)度，使光照強(qiáng)度在150-300umOl/m2. s，在這一階段 內(nèi)，衣藻開(kāi)始油脂積累。
E，采收藻培養(yǎng)進(jìn)行到第12天，藻液顏色變黃或乳白時(shí)，將藻液收集，通過(guò)離心或自然沉降 的方法獲得藻泥，將藻泥在100°C下進(jìn)行干燥。藻粉油脂含量積累及測(cè)定按上述步驟進(jìn)行培養(yǎng)，其初始接種細(xì)胞密度OD75tl為0. 5，使用BGll培養(yǎng)基，其中 NaNO3 濃度為 0. 9g/l、K2HPO4 3H20 濃度為 0. 04g/l,光照強(qiáng)度為 60umol/m2· s，pH 為 7. 2， 溫度維持在23°C左右，在第3天時(shí)將光強(qiáng)加大到120umol/m2. s，在第7天時(shí)將光強(qiáng)加大到 200umol/m2. s,培養(yǎng)到第12天，藻液顏色變黃或乳白時(shí)，將藻液收集，通過(guò)離心或自然沉降 的方法獲得藻泥，將藻泥在ioo°c下進(jìn)行干燥。測(cè)定干燥后的藻粉油脂含量，其測(cè)定方法取50mg或IOOmg凍干藻粉放置在具 Telfnon螺口瓶蓋的體積為15_20ml的小玻璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2_4ml 10% DMSO-Methanol溶液，40°C砂浴(盛砂的燒杯放置恒溫加熱磁力攪拌器上)5分鐘；然后 在4°C下磁力攪拌抽提30分鐘，3500轉(zhuǎn)離心，轉(zhuǎn)移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加 入1 1的乙醚、正己烷4-8ml 4°C下磁力攪拌抽提1小時(shí)，3500轉(zhuǎn)離心，轉(zhuǎn)移上清液到上 述一小瓶中?？芍貜?fù)上述過(guò)程直到藻渣變白。在上述合并抽提液中加入純水使四者(水、 DMSO-Methanol、乙醚、正己烷)比例為1 1 1 1，震蕩分相，移取有機(jī)相轉(zhuǎn)移到另一小 玻璃瓶中，在通風(fēng)櫥中用氮?dú)獯抵脸蓾饪s液，然后轉(zhuǎn)移到事先稱重過(guò)的1. 5ml塑料離心管 中，再用氮?dú)獯蹈芍梁阒?，稱量恒重后的管重，用此管重減去事先稱重過(guò)的離心管重得到油 脂重量，然后用油脂重量除以藻粉重，計(jì)算出其油脂總含量為藻粉干重31 %。取25mg-100mg藻粉照上面方法進(jìn)行提取后，用正己烷溶解，使用Agilent 6820氣 相色譜儀進(jìn)行氣相色譜分析(色譜條件為載氣氮?dú)饬髁縧ml/min、氫氣流量30ml/min、空 氣流量300ml/min，進(jìn)樣口溫度280°C，檢測(cè)器溫度280°C，檢測(cè)器類型FID，分析方法內(nèi) 標(biāo)法，進(jìn)樣口類型分流/不分流進(jìn)樣口)，其油脂組分含量如下表1。表1氣相色譜測(cè)定的樣品總脂組分表(組分含量為重量百分比)
樣品名稱DQA-OlI (%)畺I釤苗部哄督未知1. 760±0. 002C1401. 587±0. 004C1616. 834±0. 009C16012. 582±0. 011C1822. 481±0. 018C1812. 868±0. 001C1800. 258 ±0. 004C2052. 468±0. 038C2000. 227±0. 004總含量(%)31. 065±0. 091 本發(fā)明中的衣藻具有一定的油含量，可用于提煉生物柴油；此藻種為衣藻屬下的 一個(gè)種，其與做了大量基因方面研究的萊茵衣藻是同一屬，在進(jìn)化上具有許多相似處，故可 以借鑒萊茵衣藻基因方面的研究經(jīng)驗(yàn)對(duì)此產(chǎn)油衣藻進(jìn)行基因改造，有助于能源微藻基因改
8造方面的研究。序列表
<110>新奧科技發(fā)展有限公司
<120> 一株衣藻藻株及其應(yīng)用
<130>IB096695
<160>1
<170>Patent In version 3.1
<210>1
<211>728
<212>DNA
<213>衣藻藻株(Chlamydomonas sp
<400>1
ggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgta ggtgaacctgcggaaggatcattgaatcta60
tcacaatccacaacccgcgaaccatactgt tggccttccttggtttcggccaaggagcca120
ggctctgtcggtgctcacgcgccgtacggc agcctgggtcgcctgcccaattaattatta180
attaattagctgggccggcgtcggtctctt aaccaaccac acaccaaacataacaataat240
aaaaaacgagcgcttggcttagagccgacg ctcaccaaccaaagacaactctcaacaacg300
gatatcttggctctcataacgatgaagaac gcagcgaaatgcgatacgtagtgcgaattg360
cagaaatacgtgaatcatcgaatctttgaa cgcaaattgcgctcgaggcttcggccaaga420
gcatgtctgcctcagcgtcgggttaatact cgcctgctgcactgcctgtgcatgcaagcg480
gagctggctgtctcggcccctcgtaaaaca ggtgccgggtctgctgaagtacagaggttg540
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權(quán)利要求
一株衣藻藻株DQA 01(Chlamydomonas sp.DQA 01)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)為CGMCCNo.3577。
2.權(quán)利要求1的衣藻藻株，其特征在于在15-35°C的溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)。
3.權(quán)利要求1的衣藻藻株，其特征在于在培養(yǎng)過(guò)程中光照強(qiáng)度控制在50—200umol/o
4.權(quán)利要求1的衣藻藻株，其特征在于，其在光照強(qiáng)度150-300umOl/m2.s下被誘導(dǎo)積 累油脂。
5.權(quán)利要求1的衣藻藻株，其特征在于，在培養(yǎng)期間將培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)在7-9之間。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的衣藻藻株用于制備生物柴油、飼料或食用油的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的衣藻藻株用于制備基因改造藻株的應(yīng)用。
8.—種生產(chǎn)生物柴油的方法，所述方法特征在于使用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的衣藻藻株 進(jìn)行生產(chǎn)。
9.一種分離含油量高的微藻藻株的方法，所述方法包含下列步驟1)藻樣采集選擇含有多種藻類的污染河流、湖泊或沼澤地，使用藻樣采集器進(jìn)行藻 樣采集；2)藻種分離純化利用稀釋鋪平板法或毛細(xì)管法將混合在一起的多種藻種進(jìn)行分離， 得到單個(gè)藻種的純?cè)逯辏?)藻種培養(yǎng)及油脂誘導(dǎo)將純?cè)逯暝贐G11培養(yǎng)基，25°C下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)藻的濃度達(dá)到 lg/l-8g/l的時(shí)候，加強(qiáng)光進(jìn)行油脂誘導(dǎo)；4)油脂含量測(cè)定取油脂誘導(dǎo)后的藻進(jìn)行尼羅紅染色，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，選 擇熒光比較多的藻種，從而快速得到含油較高的藻種。
全文摘要
本發(fā)明提供一株衣藻藻株，經(jīng)過(guò)鑒定所述藻株為一株新的藻株，其保藏號(hào)為CGMCC No.3577。所述衣藻藻株油脂含量較高，可應(yīng)用于制備生物柴油，飼料或食用油。
文檔編號(hào)A23K1/14GK101892159SQ201010002968
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者吳義誠(chéng), 吳洪, 李青, 黃龍耀 申請(qǐng)人:新奧科技發(fā)展有限公司