專利名稱：：豬體外受精和胚胎移植方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及動物體人工繁殖的方法，尤其涉及一種豬體外受精方法和胚胎的移植方法。
背景技術(shù)：
：動物胚胎移植也叫受精卵移植或借腹懷胎，是指將一頭良種母畜配種后的早期胚胎取出，或者由體外受精及其他方式獲得的胚胎，移植到另一頭生理狀態(tài)相同的母畜子宮內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成新個體。哺乳動物的胚胎移植起始于20世紀(jì)30年代。英國劍橋大學(xué)He即e等首先完成了免的胚胎移植試驗，提出動物受精卵可以在宿主母體內(nèi)發(fā)育的可能性。隨后，大動物胚胎移植也相繼試驗成功，如綿羊(1934)、山羊(1974)、豬(1951)、牛(1958)、馬(1973)。60年代以后，隨著與胚胎移植相配套的超數(shù)排卵、同期發(fā)情、胚胎凍存、胚胎非手術(shù)采集和移植等技術(shù)在某些動物上研究成功，使胚胎移植技術(shù)開始進人生產(chǎn)和商業(yè)化。尤其是牛、羊的胚胎移植技術(shù)，已經(jīng)形成了很完善的技術(shù)體系。大量在生產(chǎn)中應(yīng)用的結(jié)果，使生產(chǎn)經(jīng)營者帶來了豐厚的經(jīng)濟利益。而豬的胚胎移植，一方面由于豬是多胎動物，胚胎移植被陷入應(yīng)用范圍較窄的誤區(qū)；另一方面是由于配套的非手術(shù)取卵和移植及胚胎凍存很困難，因此至今未能像牛、羊那樣被廣泛應(yīng)用。豬胚胎移植的方法主要為手術(shù)法移植，但由于手術(shù)法胚胎移植需要嚴(yán)格的外科手術(shù)，并對受體造成一定的傷害，因此它在商業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用受到了一定的限制。而且豬生殖器構(gòu)造復(fù)雜，如子宮頸鄒褶較多較深、子宮角較長等等，還沒有建立像牛那樣高效的非手術(shù)移植方法，采胚和移植必須采用外科手術(shù)，增加了難度和費用，且手術(shù)后常有粘連的發(fā)生，造成同一頭豬不能反復(fù)利用。
發(fā)明內(nèi)容為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種安全、高效的豬體外受精和胚胎移植方法。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的—種豬體外受精和胚胎移植方法，步驟如下卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備收集豬卵巢，抽取直徑為26mm的卵泡，挑選卵母細(xì)胞復(fù)合體，依次用洗卵液和成熟液沖洗，然后放入培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)；精子獲能處理將精液離心處理后，加入受精液調(diào)整精子濃度，調(diào)整好以后放入培養(yǎng)箱內(nèi)獲能；體外受精及受精卵的體外培養(yǎng)挑選出成熟的卵母細(xì)胞，將卵母細(xì)胞采用受精液清洗后放入受精液孔中，然后放入培養(yǎng)箱內(nèi)，將獲能后的精液加入受精液孔中，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育后，將胚胎取出，放入胚胎培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)；胚胎移植選擇受體母豬，清洗受體母豬外陰，采用胚胎移植管移植，胚胎移植管包括子宮輸入管和陰道引導(dǎo)管，移植前，將子宮輸入管插入陰道引導(dǎo)管內(nèi)部，將胚胎保存液注入子宮輸入管，將陰道引導(dǎo)管插入母豬陰道并進入子宮頸鎖定狀態(tài)，然后緩慢推動子宮輸入管進入子宮，同時在子宮輸入管尾端用注射器注入緩沖液，然后注射混合胚胎的培養(yǎng)液，最后用緩沖液或者胚胎培養(yǎng)液沖洗子宮，待1520分鐘后，先緩慢抽出子宮輸入管，后一起將陰道引導(dǎo)管一起抽出?？蛇x的，精子獲能處理過程中，精液洗滌采用梯度離心的方法處理采用90%和45%濃度的Percoll(—種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒)溶液作為洗精液，按90%Percoll溶液、45%Percoll溶液、精液的順序依次添加到離心管內(nèi)，離心后，棄上清液，再加入受精液混勻離心?？蛇x的，體外受精及受精卵的體外培養(yǎng)過程中，將成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞與0.1%透明質(zhì)酸酶混合，除去卵丘細(xì)胞，挑選出成熟的卵母細(xì)胞，然后用受精液將成熟卵母細(xì)胞洗滌至少一次后移入在39°C、含5%C02、最大相對濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)平衡4h以上的蓋有礦物油的受精液孔中?？蛇x的，所述受精液包括下列重量份的組分NaCl0.63125-0.63127份，KC10.07454-0.07457份，MgS047H200.00985-0.00988份，KH2P040.00475-0.00478，NaHC030.2104-0.2108份，葡萄糖0.01879-0.01803，乳酸f丐0.077074-0.077076份，丙酮酸鈉0.0021-0.0023份，牛血清白蛋白0.29-0.31份，肝素鈉0.048-0.051份，咖啡因0.02424-0.02426份?？蛇x的，卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備過程中采用39t:的添加抗生素的生理鹽水洗滌卵巢?？蛇x的，所述洗卵液為O.1%PVA-DPBS溶液，1L溶液中含9.551gDPBS粉劑、1.0gPVA(聚乙烯醇)、青霉素0.132g、鏈霉素0.100g。可選的，所述成熟液為TCM199，含10%PFF(卵泡液)、10%胎牛血清、1%PMSG(孕馬血清促性腺激素)、1%HCG(人絨毛膜促性腺激素)、1%L-半胱氨酸、1%EGF(上皮生長因子)、1%瘦素。本發(fā)明提供的豬體外受精和胚胎移植方法操作簡單，在不實施外科手術(shù)的前提下實現(xiàn)體外受精、胚胎移植，不會對豬造成傷害，成功率高，成本較低，對于推動豬體外受精、豬克隆、轉(zhuǎn)基因胚胎研究與生產(chǎn)具有重要意義。具體實施例方式下面將結(jié)合具體實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明，在此本發(fā)明的示意性實施例以及說明用來解釋本發(fā)明，但并不作為對本發(fā)明的限定。本實施例提供的豬體外受精和胚胎移植方法，包括如下步驟1、體外胚胎制備1)卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備從屠宰場收集豬卵巢，立即放入裝有39t:添加了抗菌素的生理鹽水中，豬卵巢運回實驗室后，剪除卵巢表面的結(jié)締組織，用39t:的生理鹽水(添加抗生素)沖洗3次后，用注射器抽取直徑為2-6mm的卵泡，在實體顯微鏡下用自制撿卵針挑選帶有3層卵丘細(xì)胞以上、胞質(zhì)均勻的卵丘_卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，用洗卵液(0.1%PVA-DPBS溶液，1L溶液中含9.551gDPBS粉劑、1.0gPVA(聚乙烯醇)、青霉素0.132g、鏈霉素0.100g)洗3遍，再在成熟液(TCM-199:含10%PFF(卵泡液)、10%胎牛血清、1%PMSG(孕馬血清促性腺激素)、1XHCG(人絨毛膜促性腺激素)、1XL-半胱氨酸、1XEGF(上皮生長因子)、1X瘦素。)中洗3遍，最后將卵母細(xì)胞放入預(yù)熱4h以上、覆蓋石蠟油、注有TCM-199溶液(每孔500iU)四孔板中。將培養(yǎng)皿放入39t:、充有5%C02、最大相對濕度的培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)42-46h。2)精液的采集采用徒手采精法，采得的精液，先將采集時用的過濾紗布及上面的膠體丟掉，然后將巻在杯口的精液袋上部撕去放在杯外，用蓋子蓋住采精杯，迅速傳遞到精液處理室進行檢查、稀釋。3)精液稀釋采用短效商品化的精液稀釋劑進行稀釋。按照包裝上的說明配制一定量的稀釋液，然后測量稀釋液和精液的溫度，確保兩者溫度相差不超過士rc。將稀釋液緩慢倒入精液中，并將兩者輕柔混勻，調(diào)節(jié)精子濃度，保證每包轉(zhuǎn)頭份有效精子密度在20-45億個之間。4)精子獲能處理精液洗滌采用Percoll梯度離心的辦法處理。濃度為90%和45%的Percoll溶液各2ml，按90XPercoll溶液、45XPercoll溶液、精液的順序依次添加到15ml的離心管內(nèi)，轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)離心20min，棄上清液，加入5ml受精液混勻，然后轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)離心5min，重復(fù)一次。最后加入適量在培養(yǎng)箱中平衡好的受精液，用血細(xì)胞計數(shù)板計算精子密度，用受精液調(diào)整精子濃度達到2X106個/mL，然后放入39°C、含5%0)2、最大相對濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)獲能。其中受精液配方<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>將除BSA外的所有干粉成分溶解于80MLSigma胚胎級水的燒杯中，然后進行攪拌，然后加入BSA繼續(xù)攪拌至完全溶解，用量筒定容至IOOML，最后用0.2um的濾器過濾，于4°C儲存，三周內(nèi)用完。5)體外受精及受精卵的體外培養(yǎng)將成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞復(fù)合體與0.1%透明質(zhì)酸酶混合，用移液器反復(fù)吹打除去卵丘細(xì)胞，在裸光的卵母細(xì)胞中挑選出成熟的卵母細(xì)胞(以第一極體排出為成熟標(biāo)志)，然后用受精液將成熟卵母細(xì)胞洗3遍后移入在39t:、含5%0)2、最大相對濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)平衡4h以上蓋有礦物油的400受精液孔中，每孔中有40枚左右卵母細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱內(nèi)等待受精。在上述每個盛有卵母細(xì)胞的受精液孔中加入適量獲能的精液使精子最終濃度為lX10e個/mL。精子和卵子在39t:、含5XC02、最大相對濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)共孵育lh后，將卵母細(xì)胞移出受精液滴，用胚胎培養(yǎng)液洗滌35次，盡量去除附在透明帶上的多余精子。最后以40枚為一組移入蓋有礦物油的500ii1胚胎培養(yǎng)液液滴中繼續(xù)培養(yǎng)7d。6)早期胚胎發(fā)育潛力的評定受精當(dāng)天記為第0d，第2d檢查卵裂情況，第7d檢查囊胚發(fā)育情況。以用于受精的卵母細(xì)胞總數(shù)為基數(shù)，分別計算分裂率和囊胚率，有囊胚腔的視為囊胚。2、胚胎移植受體豬的準(zhǔn)備選取健康和生殖機能正常且已生產(chǎn)3胎以上的母豬作為受體母豬，適配當(dāng)天記為第0天，第6天進行胚胎移植，移植前禁食半天，只供飲水。3、非手術(shù)移植將受體母豬在欄舍內(nèi)固定，用消毒水沖洗外陰部并用毛巾擦拭干凈。采用胚胎移植管移植，胚胎移植管包括子宮輸入管和陰道引導(dǎo)管，移植前保證子宮輸入管已經(jīng)位于陰道引導(dǎo)管內(nèi)部，用胚胎保存液注入子宮輸入管直至充滿管道，使用時首先將陰道引導(dǎo)管插入母豬陰道，在海綿頭涂上潤滑劑插入母豬陰道并進入子宮頸鎖定狀態(tài)，然后緩慢推動子宮輸入管進入子宮，同時在子宮輸入管尾端用注射器注入緩沖液，避免前端不銹鋼頭開孔被堵塞。當(dāng)導(dǎo)管三分之二已經(jīng)推進并且不能再前進時，換裝有精液或者混合胚胎的培養(yǎng)液注射器連接導(dǎo)管尾端進行注射，最后用緩沖液或者胚胎培養(yǎng)液沖洗子宮輸入管如圖。待15分鐘后，先緩慢抽出子宮輸入管，后一起將陰道引導(dǎo)管一起抽出。以上對本發(fā)明實施例所提供的技術(shù)方案進行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個例對本發(fā)明實施例的原理以及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只適用于幫助理解本發(fā)明實施例的原理；同時，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明實施例，在具體實施方式以及應(yīng)用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。權(quán)利要求一種豬體外受精和胚胎移植方法，其特征在于包括如下步驟卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備收集成年母豬卵巢，抽取直徑為3～6mm的卵泡，挑選卵母細(xì)胞復(fù)合體，依次用洗卵液和成熟液沖洗，然后放入培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)；精子獲能處理將豬精液離心分離處理后，加入受精液調(diào)整精子濃度，調(diào)整好以后放入培養(yǎng)箱內(nèi)獲能；體外受精及受精卵體外培養(yǎng)挑選出成熟的卵母細(xì)胞，將卵母細(xì)胞采用受精液清洗后放入受精液培養(yǎng)孔中與精液在培養(yǎng)箱內(nèi)共孵育，將胚胎取出，放入胚胎培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)；胚胎移植選擇受體母豬，清洗受體母豬外陰，采用胚胎移植管移植，胚胎移植管包括子宮輸入管和陰道引導(dǎo)管，移植前，將子宮輸入管插入陰道引導(dǎo)管內(nèi)部，將胚胎保存液注入子宮輸入管，將陰道引導(dǎo)管插入母豬陰道并進入子宮頸鎖定狀態(tài)，然后緩慢推動子宮輸入管進入子宮，同時在子宮輸入管尾端用注射器注入緩沖液，然后注射混合胚胎的培養(yǎng)液，最后用緩沖液或者胚胎培養(yǎng)液沖洗移植管，待15～20分鐘后，先緩慢抽出子宮輸入管，后一起將陰道引導(dǎo)管一起抽出。2.如權(quán)利要求1所述的豬體外受精和胚胎移植方法，其特征在于精子獲能處理過程中，精液洗滌采用梯度離心的方法處理采用經(jīng)過等滲處理的90%和45%濃度的Percoll溶液(一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒)作為洗精液，按90%Percoll溶液、45%Percoll溶液、精液的順序依次添加到離心管內(nèi)，離心后，棄上清液，再加入受精液混勻離心。3.如權(quán)利要求1所述的豬體外受精和胚胎移植方法，其特征在于體外受精及受精卵的體外培養(yǎng)過程中，將成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞與0.1%透明質(zhì)酸酶混合，除去卵丘細(xì)胞，挑選出成熟的卵母細(xì)胞，然后用受精液將成熟卵母細(xì)胞洗滌至少一次后移入在391\含5%(A、最大相對濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)平衡4h以上的蓋有礦物油的受精液孔中。4.如權(quán)利要求1所述的豬體外受精和胚胎移植方法，其特征在于所述受精液包括下列重量份的組分NaCl0.63125-0.63127份，KC10.07454-0.07457份，MgS047H200.00985-0.00988份，KH2P040.00475-0.00478，NaHC030.2104-0.2108份，葡萄糖0.01879-0.01803，乳酸牽丐0.077074-0.077076份，丙酮酸鈉0.0021-0.0023份，牛血清白蛋白0.29_0.31份，肝素鈉0.048-0.051份，咖啡因0.02424-0.02426份。5.如權(quán)利要求1所述的豬體外受精和胚胎移植方法，其特征在于卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備過程中采用39t:的添加抗生素的生理鹽水洗滌卵巢。6.如權(quán)利要求l所述的豬體外受精和胚胎移植方法，其特征在于所述洗卵液為O.1%PVA-DPBS溶液lL溶液中含9.551gDPBS粉劑、1.0g聚乙烯醇、青霉素0.132g、鏈霉素0.100g。7.如權(quán)利要求1所述的豬體外受精和胚胎移植方法，其特征在于所述成熟液為TCM199，含10%卵泡液、10%胎牛血清、1%孕馬血清促性腺激素、1%人絨毛膜促性腺激素、1%卜半胱氨酸、1%上皮生長因子、1%瘦素。全文摘要本發(fā)明公開了一種豬體外受精和胚胎移植方法，步驟如下卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備；精子獲能處理將精液離心處理后，加入受精液調(diào)整精子濃度，調(diào)整好以后放入培養(yǎng)箱內(nèi)獲能；體外受精及受精卵的體外培養(yǎng)；胚胎移植采用胚胎移植管移植。本發(fā)明提供的豬體外受精和胚胎移植方法操作簡單，在不實施外科手術(shù)的前提下實現(xiàn)體外受精、胚胎移植，不會對豬造成傷害，成功率高，成本較低，對于推動豬體外受精、豬克隆、轉(zhuǎn)基因胚胎研究與生產(chǎn)具有重要意義。文檔編號A61D19/04GK101779989SQ201010019489公開日2010年7月21日申請日期2010年1月19日優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日發(fā)明者劉德武,吳珍芳,周海斌,周榮,石俊松,莫啟杯,趙云翔申請人:廣東溫氏食品集團有限公司;華南農(nóng)業(yè)大學(xué)