專利名稱：稻瘟病抗性基因Pik及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因Pik的克隆及 其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在生長的過程中，常常受到多種病原物的侵害，而植物則采取多種防御策略 以保護(hù)自身，避免受其侵襲。植物中一個(gè)最重要的防御機(jī)理就是能夠識(shí)別專性致病微生物 的存在并啟動(dòng)自身的防御應(yīng)答系統(tǒng)。植物對病原菌的識(shí)別由抗病基因所介導(dǎo)。因此，對抗 病基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析與研究，是了解植物抗病機(jī)制的基礎(chǔ)，對于其病害的預(yù)防和控制 也具有重要的指導(dǎo)意義。迄今為止，已經(jīng)從植物中分離了 80多個(gè)抗病基因。對這些抗病基因的結(jié)構(gòu)和 產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，雖然寄主植物不同，所對應(yīng)的病原物也有真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等差 異，但抗病基因的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物卻有許多共同的結(jié)構(gòu)特征，如C-端存在富亮氨酸重復(fù)序列 (leucine-rich repeat, LRR), N-端存在核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding site, NBS)，亮氨酸拉鏈(leucine zipper, LZ)，卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil，CC)，跨膜結(jié)構(gòu)域 (transmembrane domain, TM)，蛋白激酶(proteinkinase，PK)，以及果蠅 iToll 蛋白及哺乳 動(dòng)物白介素-1受體(Toll and interleukin-1 receptor, TIR)等。根據(jù)它們所編碼蛋白 的結(jié)構(gòu)特征，可將抗病基因分為 7 類(Hammond-Kosack&Jones，1997 ；Dangl & Jones 2001 ； Iyer & McCouch 2004)。第一類，毒素還原酶類抗病基因。如玉米抗病基因Hml，它是第1個(gè)被克隆的植物 抗病基因，它控制對真菌Cochliobolus carbonum小種1的抗性。Hml編碼的解毒酶能鈍化 病原真菌所產(chǎn)生的HC毒素，而HC毒素是真菌C. carbonum小種1產(chǎn)生的致病因子，它決定該 病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等，1992)。第二類，NBS-LRR類抗病基因。它們編碼 的蛋白近N端為 NBS，而近C端則由 LRR組成。如 RPS2(Bent et al. , 1994) ,RPMl (Grant et al.，1995)、I2(Simonet al.，1998) ；RPP5 (Parker et al. , 1997) > N (Dodd et al. ,2001) > L6(Lawrence et al. ,1995)> Mlal(Zhou et al. ,2001)> Mla6(Halterman et al. ,2001)； 7K稻的抗病基因如 Xal(Yoshimuraet al.，1998)、Pib (Wang et al.，1999)、Pita (Bryan et al. ,2000)等。第三類，1 類抗病基因。如番茄Pto基因，其產(chǎn)物是一種位于細(xì)胞內(nèi)的絲氨 酸-蘇氨酸蛋白激酶，沒有LRR結(jié)構(gòu)域(Martinet al.，1993)。第四類，LRR-TM類抗病基 因。番茄抗葉霉病不同生理小種的基因Cf-2 (Dixon etal.，1996)、Cf-4 (Thomas et al.， 1997)、Cf-5 (Dixon et al.，1998)、Cf-9 (Jones et al.，1994)，以及甜菜抗胞囊線蟲的基 因Hslpra-1 (Cai et al. , 1997)等。第五類，LRR-TM-PK類抗病基因，以水稻抗白葉枯病基因 Xa2KSong et al. , 1995)為代表。第六類，以擬南芥的RPW8為代表，其編碼的蛋白僅含有 完整的CC和NBS結(jié)構(gòu)域(Xiao et al.，2001)。第七類，以水稻的xa5基因?yàn)榇?，其編碼 的蛋白為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(TFIIAy) (Iyer&McCouch，2004)。編碼NBS-LRR類抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一類抗病基因，根據(jù)NBS-LRR類抗病蛋白N末端的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，又可將該類基因分為兩大類TIR-NBS-LRR和 CC-NBS-LRR(Meyers et al. ,2002 ；Pan et al. ,2000 ；Cannon et al. ,2002 ；Richly et al.，200幻。TIR-NBS-LRR類抗病基因主要發(fā)現(xiàn)在雙子葉植物，至今還沒有在單子葉植物 基因組中發(fā)現(xiàn)(Baiet al. ,2002 ；Meyers et al.，2002)。目前在單子葉植物中鑒定到的 抗病基因主要編碼CC-NBS-LRR類抗病蛋白，雙子葉植物中也存在大量的CC-NBS-LRR類抗 病基因，相對而言，單子葉植物中的CC-NBS-LRR類抗病基因比雙子葉植物中的更豐富多樣 (Cannon et al.，2002)o研究表明，NBS、CC、TIR結(jié)構(gòu)域可能參與信號(hào)傳導(dǎo)(Hammond-Kosack&Jones 1997)，盡管這類R蛋白不具有內(nèi)在的激酶活性，但NBS可以激活激酶或G蛋白，NBS具有結(jié) 合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut et al.，1994)。IlR結(jié)構(gòu)可能參與植物抗病防衛(wèi)反 應(yīng)下游的信號(hào)傳導(dǎo)(Jones et al.，1994)。最近的證據(jù)表明，亞麻的L族多樣性選擇也發(fā)生 在TIR區(qū)域，這個(gè)區(qū)域與相應(yīng)的LRR區(qū)域共進(jìn)化形成特異性(Luck et al.，2000)。LRR結(jié) 構(gòu)域的功能主要涉及到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和與配體的相互作用(Jones&Jones，1996 ；Kajava et al.，1998)，據(jù)推測是抗病基因產(chǎn)物直接和病原菌無毒基因編碼的產(chǎn)物或間接產(chǎn)物相互 作用的部位(Bent，1996 ;Baker et al.，1997)。Jia et al. Q000)通過酵母雙雜交證明 AVR-Pita編碼的蛋白加工為一個(gè)176氨基酸的活性蛋白AVR-Pite176小種特異性的激發(fā)子， 傳遞到植物細(xì)胞質(zhì)特異地與Pita受體的LRD區(qū)域結(jié)合，從而激活細(xì)胞內(nèi)Pita介導(dǎo)的防衛(wèi) 反應(yīng)。當(dāng)Pita中的Ala變?yōu)镾er后AtrPitami不能與LRD結(jié)合，因而表現(xiàn)感病。這一結(jié) 果直接證明了 LRR結(jié)構(gòu)域可能就是病原菌識(shí)別的區(qū)域；Pita與AvrPita的互作第一次從分 子水平驗(yàn)證了水稻與稻瘟病菌的“基因?qū)颉标P(guān)系。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由病 原真菌Magnapothe oryzae (無性態(tài)=Pyricularia oryzae)引起的稻癌病是對水稻生產(chǎn)危 害最嚴(yán)重的病害之一，每年都造成嚴(yán)重的糧食損失。從環(huán)境保護(hù)與農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展的觀 點(diǎn)來看，抗病品種的育成與利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群體 的多樣性及易變性，加之人們?nèi)狈剐曰虻挠行Ю茫约皩剐詸C(jī)理缺乏充分的了 解，以致抗病品種的感病化問題不但沒有得到解決，反而因有效抗源基因的缺乏和抗病品 種的短命化而成為育種學(xué)家最為棘手的問題。因此，發(fā)掘、鑒定和克隆抗病基因并合理地應(yīng) 用于抗病育種計(jì)劃中，已成為農(nóng)業(yè)科研中優(yōu)先解決的重要問題。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，迄今，至少有80多個(gè)水稻稻瘟病主效抗性基因已經(jīng) 被報(bào)道，其中60個(gè)已經(jīng)被分子定位。目前，除了水稻的第3染色體上還沒有被鑒定到稻瘟 病主效抗性基因之外，其余的11條染色體上均被鑒定到有主效抗性基因位點(diǎn)，并且有的 染色體上含有多個(gè)稻瘟病抗性位點(diǎn)，而且有些基因位點(diǎn)的抗性基因是成簇存在的。目前， 在稻瘟病抗性基因的克隆研究方面，正式報(bào)道的已有13個(gè)抗性基因，Pib (Wang et al., 1999), Pita (Bryan et al. ,2000), Pi9 (Qu et al.，2006)，Pid2(Chen et al.,2006), Piz-t 和 Pi2(Zhou et al.，2006b)，Pi36 (Liu et al.，2007a)，Pi37 (Lin et al. ,2007), Pik-m(Ashikawa et al. ,2008), Pit(Hayashi et al.,2009), Pi5(Leeet al.,2009), Pid3(Shang et al.，2009)禾口 pi21(Fukuoka et al. ,2009) 克隆抗病基因是對水稻抗性機(jī)理深入研究的前提，揭示水稻抗稻瘟病的分子機(jī)理 可以更好地控制和降低稻瘟病菌對水稻的危害。同時(shí)，對克隆的抗病基因進(jìn)行修飾和改造，可以人為地控制和增加植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī)植物育種和 改良技術(shù)所不能達(dá)到的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻稻瘟病抗性基因和包含調(diào)控這個(gè)基因的啟動(dòng)子的 DNA片段。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述稻瘟病抗性基因所編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另 一個(gè)目的是提供上述含有上述抗性基因的載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述載體的宿 主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明的進(jìn)一 步目的是提供上述抗性基因產(chǎn)生的分子標(biāo)記及其在選育對稻瘟病具有抗病性的水稻中的 應(yīng)用。本發(fā)明從水稻品種Kusabue中分離得到Pik基因，包括2個(gè)編碼NBS-LRR類蛋 白的基因Pik-I和Pik-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示，它們分 別編碼SEQ ID NO. 3以及SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列，結(jié)構(gòu)如圖6和圖7所示。它 們的蛋白都包含2個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域NBS和LRR區(qū)域，其中Pik-INBS結(jié)構(gòu)域含有保守的 kinase la :GLPGGGKTTVAR, kinase 2 =NKKYLIVIDDIff, kinase 3a=DLGGRIIMTTRLNSI, GLPL EDNSCYDIV匪CYGMPLALIW ；Pik_2NBS 結(jié)構(gòu)域含有保守的 kinase la :VLSIVGFGGVGKTTIA, kinase 2 =LEQLLAEKSYILLIDDIff, kinase 3a =EQVPEEIffKICGGLPLAIVT, GLPL EQVPEEIWKICGGLPLAIV, RNBS-D :CLLYLSIFPKGWK，MHDV :KTFQVHDMVLEYI。而 Pik-1 蛋白的 C-末端為16個(gè)不完整的LRR重復(fù)，其亮氨酸含量為14.0% (附圖6)。Pik_2蛋白的C-末 端為13個(gè)不完整的LRR重復(fù)，其亮氨酸含量為17.0% (附圖7)。應(yīng)當(dāng)理解，在不影響蛋白活性的前提下(不在蛋白的活性中心)，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可對SEQ ID NO. 3或SEQ ID N0. 4所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè) 或幾個(gè)氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其 編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區(qū)在不影響蛋白表達(dá)的條件下，對編 碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行修改。本發(fā)明還包括基于所述基因的正義序列或反義序列，包 括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞、含有 所述核苷酸序列或其片段的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明同樣包括將Pik抗性基因的主要結(jié)構(gòu)部分有效地連接上合適的調(diào)節(jié)序列 所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種基因的植物和這種植物的種子。這種基因可 以是天然的或是嵌合的。例如，將包含該基因的片段和一個(gè)組成型表達(dá)的啟動(dòng)子連接，該啟 動(dòng)子可以在任何條件下和細(xì)胞發(fā)育的任何時(shí)期表達(dá)。這種組成型表達(dá)的啟動(dòng)子包括花椰菜 花葉病毒的35S啟動(dòng)子等。另一方面，也可以將該基因和一個(gè)組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子或 發(fā)育時(shí)期特異性表達(dá)的啟動(dòng)子或精確環(huán)境誘導(dǎo)的啟動(dòng)子連接，這些啟動(dòng)子稱之為誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子。這樣，環(huán)境的改變，發(fā)育時(shí)期的不同都可以改變該基因的表達(dá)。同樣地，也可以將該 基因的表達(dá)限定在某一個(gè)組織內(nèi)，使由該基因誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)得到人為的控制。其中環(huán)境 條件包含病原菌的攻擊、厭氧條件和光等，組織和發(fā)育時(shí)期包括葉、果實(shí)、種子和花等。本發(fā)明還進(jìn)一步克隆得到所述基因的啟動(dòng)子，包含調(diào)控該基因的啟動(dòng)子的DNA片 段分別如SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6所示。根據(jù)本發(fā)明提供的Pik基因序列信息(SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過以下方法容易地獲得與Pik等同的基因(1)通過數(shù)據(jù)庫檢索獲得；(2) 以Pik基因片段為探針篩選水稻或其它植物的基因組文庫或cDNA文庫獲得；(3)根據(jù)Pik 基因序列信息設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，用PCR擴(kuò)增的方法從水稻或其它植物的基因組、mRNA和 cDNA中獲??；(4)在Pik基因序列的基礎(chǔ)上用基因工程方法改造獲得；(5)用化學(xué)合成的方 法獲得該基因。本發(fā)明提供的稻瘟病抗性基因Pik具有重要的應(yīng)用價(jià)值，其賦予植物對稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)所引起的病害產(chǎn)生特異性的抗病反應(yīng)(圖幻。其適用于對所有對該 病原菌敏感的植物，這些植物包括單子葉植物和雙子葉植物。應(yīng)用之一是將所述的Pik基 因序列連接到任何一種植物轉(zhuǎn)化載體，用任何一種轉(zhuǎn)化方法將Pik抗病基因?qū)胨净蚱?他植物細(xì)胞，可獲得表達(dá)所述基因的轉(zhuǎn)基因抗病品種，從而應(yīng)用于生產(chǎn)。本發(fā)明所述的基因 構(gòu)建到植物轉(zhuǎn)化載體中，可以對所述基因或其調(diào)控序列適當(dāng)修飾，也可以在其轉(zhuǎn)錄起始密 碼子前用其它啟動(dòng)子取代所述基因原有的啟動(dòng)子，從而拓寬和增強(qiáng)植物對病原菌的抗性。本發(fā)明提供的抗性基因的另一個(gè)應(yīng)用是根據(jù)所述基因序列信息產(chǎn)生特異性的分 子標(biāo)記，包括但不限于SNP(單核苷酸多態(tài))、SSR(簡單序列重復(fù)多態(tài))、RFLP(限制性內(nèi)切 酶長度多態(tài))、CAPS (切割擴(kuò)增片段多態(tài))。用此標(biāo)記可鑒定水稻或其它植物的抗性基因型， 用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。本發(fā)明具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和效果。將克隆的抗病基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有助于產(chǎn)生 新的抗病植物。特別是可以用轉(zhuǎn)化技術(shù)在植物中累加多個(gè)抗病基因，而不會(huì)產(chǎn)生傳統(tǒng)育種 技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的基因組中不良基因的連鎖問題，并且可以縮短育種時(shí)間。抗病基因的克 隆是克服傳統(tǒng)育種中不能在植物種間轉(zhuǎn)移抗病基因的問題的前提。本發(fā)明能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用利用上述DNA片段獲得的抗病的轉(zhuǎn)基因植株和相 應(yīng)的種子，以及用本發(fā)明的基因或基于該基因的重組體轉(zhuǎn)化的植株或由這類植株獲得的種 子?？梢杂糜行噪s交的方式將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入其他的植株中。


圖1.水稻稻瘟病抗性基因Pik的圖位克隆技術(shù)路線圖。圖2. 4個(gè)Pik簇等位基因?qū)?0個(gè)中國稻瘟病菌群體抗譜的比較。圖中縱坐標(biāo)為抗性頻率，橫坐標(biāo)為10個(gè)稻瘟病菌群體(GD，廣東；FJ，福建；HN，湖 南；YN，云南；GZ，貴州；SC，四川；JS，江蘇；LN，遼寧；幾，吉林；HLJ，黑龍江)。4個(gè)Pik簇等 位基因(Shin 2，Pik-s ；K60, Pik-p ；Kusabue, Pik ；Tsuyuake，Pik-m)。由此可以看出，Pik 對廣東、福建、湖南、貴州、四川、江蘇的稻瘟病菌群體表現(xiàn)高度的抗性。圖3A. Pik基因位點(diǎn)的連鎖標(biāo)記圖。圖中橫線上面的數(shù)字為標(biāo)記之間的物理距離[用堿基(bp)表示]；括號(hào)內(nèi)的數(shù)字 為該標(biāo)記檢測出的重組體/配子體。圖3B. Pik基因位點(diǎn)在日本晴類型基因組上存在的具有NBS-LRR保守結(jié)構(gòu)的6個(gè) 抗性候選基因。圖3C. Pik基因位點(diǎn)在Kusabue/K60/Tsuyuake類型基因組上存在的具有NBS-LRR 保守結(jié)構(gòu)的2個(gè)抗性候選基因。由此可以看出，在Pik基因位點(diǎn)存在兩種類型的基因組，彼此之間存在很大的缺失/插入；Pik基因只有2個(gè)候選基因(Pikl-KU和Pik2-KU)。圖4(左桶).水稻稻瘟病抗性基因Pik之組成基因Pik-I (K3)之遺傳互補(bǔ)Ttl植 株的抗性鑒定實(shí)物圖。由于受體品種Q1063存在與Pik-I (K3)匹配(序列完全相同)的Pik_2 (K4)，圖中 的轉(zhuǎn)化植株中出現(xiàn)抗病個(gè)體(實(shí)線箭頭)，說明單一的Pik-I導(dǎo)入與之匹配的背景中也能產(chǎn) 生抗性。圖4(中桶).水稻稻瘟病抗性基因Pik之組成基因Pik_2(K4)之遺傳互補(bǔ)Ttl植 株的抗性鑒定實(shí)物圖。由于受體品種Q1063不存在與Pik_2(K4)匹配的Pik_l (K3)，圖中所有轉(zhuǎn)化植株都 表現(xiàn)感病(虛線箭頭)，說明單一的Pik-2不具備抗性功能。圖4(右桶).水稻稻瘟病抗性基因Pik(由Pik-I和Pik-2組成)之遺傳互補(bǔ)Ttl 植株的抗性鑒定實(shí)物圖。圖中實(shí)線箭頭所指的是抗病植株，虛線箭頭所指的是感病植株，說明抗性基因Pik 由Pik-I和Pik-2組成才能表現(xiàn)功能。圖5.水稻稻瘟病抗性基因Pik遺傳互補(bǔ)的部分Ttl轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記HPT基因的 PCR檢測圖。圖中由左至右，泳道1 分子量標(biāo)記DL2000 ；泳道2 空載體(Vector)，陽性對照； 泳道3 =H2O,陰性對照；泳道4 受體品種龍粳24，陰性對照；泳道5-14 =T0轉(zhuǎn)化體。結(jié)果表 明，所有抗病的轉(zhuǎn)化體都檢測到了選擇性標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，而大部分的感病轉(zhuǎn)化體沒 有檢測到選擇性標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，說明抗病的轉(zhuǎn)化體是由于轉(zhuǎn)化構(gòu)建體已經(jīng)整合到了 高感的受體品種中獲得了表達(dá)而恢復(fù)了抗性。其中出現(xiàn)的陽性中感個(gè)體(泳道1 可能是 由于外源基因的整合等問題，在受體品種中并沒有得到充分的表達(dá)。R 高抗；MR 中抗；MS 中感；S 感病。圖6A.水稻稻瘟病抗性基因Pik之組成基因Pik-I的基因結(jié)構(gòu)圖。圖中淺色方框表示5’和3’ -UTR ；深色方框表示外顯子；線條表示內(nèi)含子；該基因 編碼區(qū)的啟動(dòng)子(ATG)和終止子(TAG)以及各個(gè)區(qū)域的大小(bp)亦標(biāo)示于其中。圖6B.水稻稻瘟病抗性基因Pik之組成基因Pik-I編碼的氨基酸多肽序列結(jié)構(gòu) 圖。圖中CC結(jié)構(gòu)域中的斜體字表示形成CC motif的氨基酸，NBS區(qū)域的黑體字表示 NBS中保守的氨基酸序列。下部分獨(dú)立列出的氨基酸殘基為C-末端LRR區(qū)域，黑體字表示 形成LRR區(qū)域的xLDL保守基序。LRR區(qū)域后面還帶有一段CNL (C端非LRR區(qū)域)氨基酸序 列。星號(hào)標(biāo)示的氨基酸序列為Pik特異的氨基酸替換[substitution，與Pik簇的其他其他 等位基因(Pik-h，Pik-p, Pik-m)相比]。圖7A.水稻稻瘟病抗性基因Pik之另一組成基因Pik-2的基因結(jié)構(gòu)圖。圖中淺色方框表示5’和3’ -UTR ；深色方框表示外顯子；線條表示內(nèi)含子；該基因 編碼區(qū)的啟動(dòng)子(ATG)和終止子(TAG)以及各個(gè)區(qū)域的大小(bp)亦標(biāo)示于其中。圖7B.水稻稻瘟病抗性基因Pik之另一組成基因Pik-2編碼的氨基酸多肽序列結(jié) 構(gòu)圖。圖中CC結(jié)構(gòu)域中的斜體字表示形成CC結(jié)構(gòu)的氨基酸，NBS區(qū)域帶下劃線的黑體字表示NBS中保守的氨基酸序列。下部分獨(dú)立列出的氨基酸殘基為C-末端LRR區(qū)域，黑體 字表示形成LRR區(qū)域的xLDL保守基序。圖8.水稻稻瘟病抗性基因Pik表達(dá)特性的定量RT-PCR檢測圖。左圖為組成基因Pik-I在不同的接種時(shí)間點(diǎn)(0hr，iair，Mhr，7air)的相對表 達(dá)水平，由此可以看出，該基因呈逐步上調(diào)的表達(dá)類型。中圖為另一個(gè)組成基因Pik-2在 不同的接種時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)水平，由此可以看出，該基因也呈逐步上調(diào)的表達(dá)類型，但是 前者上調(diào)的幅度比后者的大。右圖為病原菌誘導(dǎo)表達(dá)基因PBZl (pathogenesis-related probenazole-inducible gene)作為對照的相對表達(dá)水平，由此可以看出，該基因在接種對 照(H2O)和接種病原菌之間表現(xiàn)明顯不同的誘導(dǎo)型表達(dá)。2個(gè)組成基因都表現(xiàn)為組成型表 達(dá)，因?yàn)榻臃N之前和之后都能檢測到2個(gè)基因的表達(dá)。圖9.利用水稻稻瘟病抗性基因Pik特異性分子標(biāo)記的基因型鑒定圖。由此可以看出，利用該分子標(biāo)記可以把抗性品種Kusakue(Ku)的基因型(Pik/ Pik)；感病品種IR36(IR)的基因型(pik/pik)；含有與Pik等位的抗性品種Tsuyuake (TS) 的基因型(Pikm/Pikm)；抗性品種K60的基因型(Pikp/Pikp)；抗性品種K3的基因型(PiWi/ Pikh)；以及抗性品種Kusabue與感病品種頂36的雜交F2之感病個(gè)體S1-S4的基因型(pik/ pik) ；R1-R2的雜合基因型(Pik/pik)鑒別出來。圖中，M 分子量標(biāo)記DL2000。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。在本發(fā)明的實(shí)施例部分，我們闡述了 Pik基因的分離過程(附圖1)和該基因的特 點(diǎn)，分離的Pik基因能夠與載體連接，轉(zhuǎn)入植物體中，使該植物體帶有抗性。實(shí)施例1 抗性基因Pik的抗性特征首先，為了比較和明確在Pik位點(diǎn)上4個(gè)等位基因(Pik，Pik-p, Pik-s, Pik-m)的 抗譜，利用從廣東(GD, 60個(gè)菌株)，福建(FJ，40個(gè))，湖南(HN, 40個(gè))，貴州(GZ, 60個(gè))，云 南(YN，43個(gè))，四川6(，66個(gè))，江蘇(幾，72個(gè))，遼寧(1^，108個(gè))，吉林(幾，60個(gè))和黑 龍江(HLJ，63個(gè))，收集的總計(jì)612個(gè)菌株對上述4個(gè)等位基因所持品種(分別是Kusabue， K60, Shin 2和Tsuyuake)進(jìn)行了抗譜比較分析。結(jié)果表明，Pik對廣東、福建、湖南、貴州、 四川、江蘇的稻瘟病菌群體表現(xiàn)高度的抗性。由此說明該基因可在上述地區(qū)使用。生物材 料水禾S品禾中 Kusabue, Shin 2, K60, Tsuyuake 已在文獻(xiàn)(Wang et al. Characterization of riceblast resistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus. Phytopathology, 2009,99 :900-905)中公開。實(shí)施例2 :水稻稻瘟病抗性基因Pik的定位及電子物理作圖本發(fā)明對由粳稻抗病品種Kusabue與頂36等秈稻感病品種的雜交組合由來的F2 群體，接種CHL346等對雙親品種表現(xiàn)分明的非親和性/親和性反應(yīng)的菌株(稻瘟病菌單一 孢子分離的菌株)。結(jié)果表明，這些&群體中抗病植株與感病植株的分離比都符合3 1。由 此推斷，Kusabue所表現(xiàn)的對這些接種菌株的抗性都是由一對顯性基因控制的。對這些&群體對應(yīng)的抗性基因進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果表明它們受同一顯性基因控制，因此，構(gòu)建了由499 個(gè)體組成的一個(gè)作圖群體(相當(dāng)于998個(gè)配子體)。生物材料水稻品種頂36已在文獻(xiàn)(Lin et al. A high-resolution map ofthe rice blast resistance gene Pil5constructed by sequence-ready markers. Plant Breeding，2007，126 :287-290)中公幵。生物材料水稻品 禾中 CHL346 已在文獻(xiàn)(Ma et al. Identification and fine mappingof AvrPi 15, a novel avirulence gene of Magnaporthe grisea. Theor Appl Genet，2006，113 :875-883)中公 開。前期的遺傳分析表明Pik基因與Pik-m基因是等位的，而申請人所在的研究室已 經(jīng)對 Pik-m 基因進(jìn)行了精細(xì)定位(Li et al. 2007,Molecular Breeding，20 179-188)。因 此，申請人利用Li et aK2007)開發(fā)的分子標(biāo)記進(jìn)行了連鎖分析。結(jié)果表明，在標(biāo)記K34 和RM5766分別檢測出了 7個(gè)和11個(gè)重組體(附圖3)。為了縮小Pik位點(diǎn)的染色體區(qū)域 并找到與之共分離的標(biāo)記(沒有重組體發(fā)生的標(biāo)記)，進(jìn)一步在K34-RM5766區(qū)域內(nèi)，從Li et al (2007)開發(fā)的標(biāo)記中獲得了 2個(gè)多態(tài)性標(biāo)記(K33，以8)，并對上述18個(gè)不同的重組 體進(jìn)行了連鎖分析。結(jié)果表明，在標(biāo)記K33和以8分別檢測出了 0個(gè)和7個(gè)重組體。因此， Pik位點(diǎn)最終被界定于1(34—以8之間的區(qū)域內(nèi)，其中標(biāo)記K33與之完全共分離。為了構(gòu)建Pik位點(diǎn)的電子物理圖，把與之連鎖的標(biāo)記通過生物信息學(xué)方法著陸于 水稻品種日本晴(Nipponbare)的參考序列上，并由此構(gòu)建了該基因位點(diǎn)的重疊群。由參考 序列可以推測Pik位點(diǎn)被界定于側(cè)翼標(biāo)記K34和以8之間約1271Λ的范圍內(nèi)。實(shí)施例3 水稻稻瘟病抗性基因Pik候選基因的注釋及序列分析為了確定Pik的候選基因，申請人利用日本晴的參考序列，通過3種基因預(yù)測軟 件 RiceGAAS (http //ricegaas. dna. affrc. go. jp)、Gramene (http ://143. 48. 220. 116/ resources/)禾口 Softberry 的 FGENESH(http://www. softberry. com)對目的基因區(qū)域進(jìn) 行了基因預(yù)測及注釋分析，初步確定了 Pik的候選抗性基因?yàn)?個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富 亮氨酸重復(fù)(nucleotide binding site-leucine-rich repeat, NBS-LRR)的候選基因 (Pikl-NP, Pik2-NP, Pik3_NP，Pik4_NP，Pik5_NP，和 Pik6_NP)。對6個(gè)候選基因進(jìn)行基于基因特異性標(biāo)記的存在/缺失(presence/absence，P/ Α)分析，結(jié)果表明，在日本晴參考序列存在的4個(gè)候選基因(Pikl-NP，Pik2-NP, Pik3_NP， Pik4-NP)在Kusabue中是不存在的。因此，Pik的候選抗性基因?qū)嶋H上只有2個(gè)Pik-I和 Pik-2(圖3)。下一步通過以下的基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其功能。實(shí)施例4 水稻稻瘟病抗性基因Pik的遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)化子的抗性鑒定首先，利用高保真酶phusion結(jié)合長片段PCR(long_range PCR，LR-PCR)技術(shù)， 以 Kusabue 的總 DNA 為模板，根據(jù)或參考 Liu et al. (2007, Genetics, 176 :2541-2549)和 Lin et al. (2007, Genetics，177 1871-1880)描述的實(shí)驗(yàn)方法和程序，分別擴(kuò)增、克隆了 Pik-I (正向引物:TTTTGGCGCGCCGCCAGTGTCCACCAACCACAGTAATAAA ；反向引物:TTTTGGCGCGC CGAACAGCCTGAGGAAGCAGAACATCGTC)和 Pik_2 (正向引物:TTTTGGCGCGCCGCAAGATCAGTACCAT CACGAGTAATAGCA ；反向引物:TTTTGGCGCGCCAGGGACAGAATGACAGTGTAAGTGAGTTTG)，并進(jìn)行了 遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，候選基因Pik-I在感病受體品種Q1063(Lin et al. ,The blast resistance gene Pi37encodesan NBS-LRR protein and is a member of a resistance gene cluster on rice chromosome 1. Genetics, 2007,177 :1871-1880)中實(shí)現(xiàn)了功能互補(bǔ)(附圖4左桶)；而候選基因Pik-2在感病受體品種Q1063中則沒有實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)(表 1 ；附圖4中桶)。對感病受體品種Q1063進(jìn)行序列比較分析發(fā)現(xiàn)，該品種中存在與候選基 因Pik-I匹配的Pik-2，而不存在與候選基因Pik-2匹配的Pik-I。表1. Pik 2個(gè)組成基因的遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果候選基因/ 構(gòu)建體受體品種T0轉(zhuǎn)化植株的反應(yīng)型a功能互補(bǔ)RMRMSS總數(shù)成功率(％)bPik-IQ1063535425514.5Pik-2Q10630001101100Pik-12Q10631OO48492.0龍粳24136O52479.2a自各個(gè)構(gòu)建體的Ttl轉(zhuǎn)化植株接種對Pik無毒性的菌株CHL381或CHL346。R，抗 ??；MR，中抗；MS，中感；S，感病。b 功能互補(bǔ)成功率(0A)為 R+MR/R+MR+MS+S*100。進(jìn)一步將上述2個(gè)候選基因拼接為一個(gè)整體的基因在上述感病受體品種Q1063以 及完全沒有這2個(gè)候選基因的感病受體品種龍粳M中進(jìn)行遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，該拼 接基因在上述2個(gè)感病受體品種中都實(shí)現(xiàn)了功能互補(bǔ)(表1 ；附圖4右桶)。利用轉(zhuǎn)化載體 中的潮霉素基因(HPT)標(biāo)記對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行了 PCR檢測。結(jié)果表明，目的基因片段已經(jīng)導(dǎo)入 所有抗病轉(zhuǎn)化體中，而沒有導(dǎo)入大部分的感病轉(zhuǎn)化體中(部分結(jié)果見附圖5)。上述遺傳互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗性基因Pik由2個(gè)基因Pik-I和Pik-2組成才 能表現(xiàn)其功能。實(shí)施例5 =Pik基因的結(jié)構(gòu)采用移步法對Pik的DNA序列進(jìn)行了測定。利用RACE技術(shù)，獲得了 Pik的全長 cDNA序列并對其進(jìn)行了測序。Pik基因DNA長度為16. 91Λ (包含Pik-I和Pik_2)，其中， Pik-I的全長cDNA序列為3695bp，含有一個(gè)3432bp的開放讀碼框，5，和3，非翻譯區(qū)分別 為73bp和190bp。通過比較基因組DNA和cDNA序列，發(fā)現(xiàn)該基因的開放讀碼框含有2個(gè) 內(nèi)含子和3個(gè)外顯子(附圖6A)。另一個(gè)組成基因Pik-2的全長cDNA為351 lbp，含有一個(gè) 3066bp的開放讀碼框，5，和3，非翻譯區(qū)分別為162bp和^!3bp。通過比較基因組DNA和 cDNA序列，發(fā)現(xiàn)該基因的開放讀碼框含有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子(附圖7A)。實(shí)施例6 =Pik抗性蛋白的結(jié)構(gòu)Pik基因包含的2個(gè)組成基因編碼的蛋白序列如序列表中Pik-ISEQ ID No. 3和 Pik-2SEQID No. 4所示。Pik-I基因編碼1個(gè)由1143個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白多肽，分子 量為126.80KD，等電點(diǎn)為6. 16。利用COIL工具分析表明該蛋白多肽有CC(Coiled-Coil) 結(jié)構(gòu)域。Pik-I蛋白屬于NBS-LRR蛋白，NBS結(jié)構(gòu)域中保守的kinase Ia(GLPGGGKTTVAR) 位于該多肽的第291個(gè)氨基酸殘基；kinase 2 (NKKYLIVIDDIff)位于該多肽的第376 個(gè)氨基酸殘基；kinase 3a (DLGGRIIMTTRLNSI)位于該多肽的第403個(gè)氨基酸殘基， GLPL(EDNSCYDIVNMCYGMPLALI)位于該蛋白多肽462個(gè)氨基酸殘基。而該蛋白的C-端的 611-961個(gè)氨基酸殘基為16個(gè)不完整LRR重復(fù)，其亮氨酸含量為14. 0%，其C末端還有個(gè)非 LRR結(jié)構(gòu)(CNL)的氨基酸序列(附圖6B)。圖中星號(hào)標(biāo)示的氨基酸序列為Pik基因特異的氨基酸替換(substitution)，由此可以鑒別Pik基因與其他等位基因(Pik-s，Pik-h，Pik-m， Pik-p)的不同。Pik-2基因編碼1個(gè)由1021個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白多肽，分子量為114. 57kd， 等電點(diǎn)為8. 39。利用coil工具分析表明該蛋白多肽沒有cc結(jié)構(gòu)域，但是利用更為強(qiáng) 大的預(yù)測工具i^aircoiU分析發(fā)現(xiàn)有cc結(jié)構(gòu)域。Pik_2蛋白屬于nbs-lrr蛋白，NBS結(jié) 構(gòu)域中保守的kinase la (gfggvgkttia)位于該多肽的第211個(gè)氨基酸殘基；kinase 2 (KSYILLIDDIff)位于該多肽的第330個(gè)氨基酸殘基；kinase 3a (ggriivttrfqav)位于該多 肽的第358個(gè)氨基酸殘基，glpl(eqvpeeiwkicgglplaiv)位于該多肽的第415個(gè)氨基酸殘 基，Rnbs-Wcllylsifi3KGWK)位于該多肽的第488個(gè)氨基酸殘基，mhdv (ktfqvhdmvleyi)位 于該多肽的第553個(gè)氨基酸殘基。而該蛋白的c-末端的610-960個(gè)氨基酸殘基為13個(gè)不 完整lrr重復(fù)，其亮氨酸含量為17.0% (附圖7b)。實(shí)施例7 =Pik基因的表達(dá)特性分析利用定量RT-PCR技術(shù)對Pik基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。在抗病品種 Kusabue接種后不同的時(shí)間點(diǎn)(Ohr，12hr, 24hr, 72hr)上采集葉片并提取其總RNA,利 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 SuperScript Reverse TranscriptaseII (Invitrogen 公司)進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄 cDNA 第一條鏈的合成。RT-PCR 的引物為，RRT5F GAAGCTCTGATCAACGGTATTCC, RRT5R :TCTTTGATCATCTTCGGGATACG；RRT17F :TGAACTTCCACGATTGGATCCAC, RRT17R ACATGGTTCTTGAATACATCATGTC。實(shí)時(shí)定量RT-PCR 使用 CFX96Real_time PCR 檢測系統(tǒng)和 STOR Premix Ex Taq 試 劑盒(寶生物公司)，操作按照試劑盒說明進(jìn)行。附圖8(左)為組成基因Pik-I在不同的 接種時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)水平，由此可以看出，該基因呈逐步上調(diào)的表達(dá)類型。附圖8(中)為 另一個(gè)組成基因Pik-2在不同的接種時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)水平，由此可以看出，該基因也呈 逐步上調(diào)的表達(dá)類型，但是前者逐步上調(diào)的幅度比后者的大。附圖8(右)為病原菌誘導(dǎo)表 iiSElPBZl (pathogenesis-related probenazole-inducible gene)作為對照白勺才百對表達(dá) 水平，由此可以看出，該基因在接種對照(H2O)和病原菌接種之間表現(xiàn)明顯不同的誘導(dǎo)型表 達(dá)。2個(gè)組成基因都表現(xiàn)為組成型表達(dá)，因?yàn)榻臃N之前和之后都能檢測到2個(gè)基因的表達(dá)。實(shí)施例8 轉(zhuǎn)化Pik基因產(chǎn)生的抗性植株的應(yīng)用將Pik 基因克隆到植物轉(zhuǎn)化載體 pCAMBIA1300(Lin et al.，The blast resistance gene Pi37encodes an NBS-LRR protein and is a member of a resistance gene cluster on rice chromosome 1. Genetics, 2007,177 :1871-1880),導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株 EHA105中，用于轉(zhuǎn)化感病的水稻品種龍粳24，獲得了 M株轉(zhuǎn)化植株，其中19株表現(xiàn)抗性反 應(yīng)(表1)。這說明可以用Pik基因轉(zhuǎn)化水稻感病品種，結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)經(jīng)過自交、純化選擇等 一系列育種程序之后，即可產(chǎn)生抗病品種而應(yīng)用于生產(chǎn)。實(shí)施例9 =Pik基因序列在分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用利用本發(fā)明提供的Pik基因序列信息可開發(fā)基因特異性的dCAPS分子標(biāo)記 (Pik-SNP-IF TTCGAGGCCCTACCAAGACA ；Pik-SNP-IR CATGGAAGGCTATCCTTGGTA,擴(kuò)增產(chǎn)物用 限制性內(nèi)切酶KpnI進(jìn)行酶切)，既可用于鑒別Pik基因與其他等位基因(Pik-h，Pik-m, Pik-p, Pik-s)的不同，也可在雜交后代用于鑒定Pik位點(diǎn)上的各種基因型，即PiWi/PiWi、 Pikh/pikh和pilih/pilch的植株，這些信息可在分子標(biāo)記輔助選擇育種過程中加以應(yīng)用，以提高育種的目的性和效率(附圖9)。序列說明SEQ ID NO. 1&2 是Pik-1 和 Pik_2 的核苷酸序列；SEQ ID NO. 3&4 是 SEQ ID NO. 1&2 的編碼產(chǎn)物；SEQ ID NO. 5&6是帶有啟動(dòng)子的Pik-I和Pik_2核苷酸序列。SEQ ID NO. 7&8 和SEQ ID NO. 9&10是分別用來擴(kuò)增Pik-I和Pik-2的引物對；SEQ ID NO. 11&12和SEQ IDN0. 13&14 分別是引物對 RRT5F、RRT5R 和 RRT17F、RRT17R ；SEQ ID NO. 15&16 是引物對 Pik-SNP-IF 和 Pik-SNP-IR ；SEQ ID N0. 17 26 分別是 Pik-I 的 kinase la、kinase 2、 kinase 3a、GLPL 序列以及 Pik-2 的 kinase la、kinase 2、kinase 3a、GLPL> RNBS-D> MHD 序列。
權(quán)利要求
1.稻瘟病抗性基因Pik，其至少編碼a)和b)所述氨基酸序列中的一種，其中a)SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列；b)SEQID NO. 4所示的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示。
3.權(quán)利要求1或2所述基因的cDNA序列。
4.權(quán)利要求1或2所述基因編碼的蛋白。
5.由權(quán)利要求1或2所述基因或權(quán)利要求3所述cDNA與啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)盒。
6.含有權(quán)利要求1或2所述基因或權(quán)利要求3所述cDNA的表達(dá)載體。
7.權(quán)利要求1或2所述基因、權(quán)利要求3所述cDNA、權(quán)利要求4所述蛋白、權(quán)利要求5 所述表達(dá)盒或權(quán)利要求6所述表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1或2所述基因、權(quán)利要求3所述cDNA、權(quán)利要求4所述蛋白、權(quán)利要求5 所述表達(dá)盒或權(quán)利要求6所述表達(dá)載體在提高水稻抗稻瘟病中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2的所述基因產(chǎn)生的分子標(biāo)記。
10.權(quán)利要求9所述的分子標(biāo)記在水稻抗稻瘟病的輔助育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種稻瘟病抗性基因Pik及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了水稻稻瘟病抗性基因Pik的核苷酸序列及其編碼的氨基酸多肽序列。該序列包含有2個(gè)基因，都屬于CC-NBS-LRR抗性基因家族的成員，且皆為組成型表達(dá)的基因。本發(fā)明還提供了應(yīng)用該基因轉(zhuǎn)化水稻或其它植物培育抗病品種以及根據(jù)該基因序列產(chǎn)生的分子標(biāo)記應(yīng)用于育種。
文檔編號(hào)A01P3/00GK102051368SQ20101010568
公開日2011年5月11日 申請日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者林菲, 潘慶華, 王玲, 翟純, 董忠秋 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)