專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種快速培育純合抗蟲(chóng)兼抗除草劑轉(zhuǎn)基因觀賞羽衣甘藍(lán)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種快速培育純合抗蟲(chóng)兼抗除草劑轉(zhuǎn)基因觀賞羽衣甘藍(lán)的方法。
背景技術(shù)：
：觀賞羽衣甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.ac印hala)，屬十字花科二年生草本植物，是蕓薹屬甘藍(lán)種的園藝變種。以觀葉為主，其葉片形態(tài)美觀多變，心葉色彩絢麗如花，整個(gè)植株形如盛開(kāi)的牡丹花，人們形象地稱(chēng)之為“葉牡丹”。其抗寒性很強(qiáng)，能耐受_8°C左右的低溫，近來(lái)在許多城市，尤其是長(zhǎng)江流域及黃河以南城市，已成為秋冬至早春的主要景觀地被植物。我國(guó)目前種子基本依靠進(jìn)口，國(guó)內(nèi)稀有育種工作。觀賞羽衣甘藍(lán)的部分生長(zhǎng)期處于蟲(chóng)害發(fā)生嚴(yán)重季節(jié)，一方面害蟲(chóng)咬食的結(jié)果，造成了觀賞性的嚴(yán)重破壞，另一方面，大量噴施殺蟲(chóng)劑，也易造成環(huán)境污染及害蟲(chóng)抗藥性的形成。此外，作為觀賞植物，通常大片栽種于戶外露地，人工除草是一個(gè)耗時(shí)耗工的勞動(dòng)。因此培育抗蟲(chóng)、抗除草劑的觀賞羽衣甘藍(lán)具有重要的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在甘藍(lán)類(lèi)作物中，幾乎不存在抗蟲(chóng)種質(zhì)，更不存在抗除草劑種質(zhì)。采用基因工程手段，引入抗蟲(chóng)及抗除草劑基因，是培育抗蟲(chóng)兼抗除草劑品種的最直接、有效的手段，而且由于是單基因的引入，也保證了其觀賞性狀不受影響。目前國(guó)際上使用較多的殺蟲(chóng)基因有來(lái)自蘇云金桿菌的Bt基因，也有部分工作中采用了來(lái)自植物的蛋白酶抑制劑基因，而這兩個(gè)基因的殺蟲(chóng)機(jī)理不同。將不同殺蟲(chóng)機(jī)理的殺蟲(chóng)蛋白基因同時(shí)導(dǎo)入同一受體植物，有可能提高植物的抗蟲(chóng)性，并延緩昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生耐受性。國(guó)際上使用較多的抗除草劑基因是來(lái)自于細(xì)菌Str印tomyceshygroscopicus的bar基因，它編碼對(duì)除草劑Basta中有效成分PPT(Phosphinothricin)的抗性。在優(yōu)良育種材料中建立高效組織培養(yǎng)離體再生體系是開(kāi)展基因工程種質(zhì)改良的基礎(chǔ)。我們已經(jīng)在幾份優(yōu)良育種材料中建立了高頻率的不定芽誘導(dǎo)及植株再生技術(shù)(趙秀樞等，2009)，而國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲(chóng)、抗除草劑觀賞羽衣甘藍(lán)的有關(guān)報(bào)道。甘藍(lán)類(lèi)作物具有很強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。生產(chǎn)中使用的種子均為雜交一代。在雜交育種中，首先必須獲得純合的雙親材料，常規(guī)育種需要經(jīng)過(guò)6-10年時(shí)間。由于植物的花粉細(xì)胞(小孢子細(xì)胞)僅具有一套染色體，通過(guò)小孢子培養(yǎng)可以一步獲得雙單倍體純合植株，僅需1-2年時(shí)間，能大大加速育種進(jìn)程。我們已經(jīng)建立了觀賞羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)技術(shù)，并獲得了相應(yīng)的國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利(ZL200610112997.5)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的方法，包括如下步驟用含有目的基因的重組農(nóng)桿菌侵染甘藍(lán)的子葉，再進(jìn)行共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)。上述過(guò)程中，所述甘藍(lán)的子葉為帶柄子葉；所述柄的長(zhǎng)度為lmm-4mm；所述柄的長(zhǎng)度具體為1mm、2mm或4mm。上述過(guò)程中，所述侵染包括如下步驟將所述甘藍(lán)的子葉置于所述含有目的基因的重組農(nóng)桿菌的菌液中，浸泡3min-5min，得到侵染后的子葉。上述過(guò)程中，所述含有目的基因的重組農(nóng)桿菌的菌液的0D_值為0.3-0.5。上述過(guò)程中，所述共培養(yǎng)的方法包括如下步驟將所述侵染后的子葉置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在溫度為22°C_27°C且黑暗的條件下培養(yǎng)2天；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基由NH4N03、KN03、CaCl22H20、MgS047H20、KH2P04、FeS047H20、EDTANa2、KI、CoCl26H20、H3B03、Na2Mo042H20、MnS044H20、CuS045H20、ZnS047H20、肌醇、煙酸、甘氨酸、硫胺素(即VB1)、鹽酸吡哆辛(即VB6)、6-芐氨基腺嘌呤(即6-BA)、a-萘乙酸(即NAA)、蔗糖、瓊脂、乙酰丁香酮和水組成；所述NH4N03在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KN03在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl22H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L，所述MgS047H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2P04在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeS047H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L，所述EDTANa2在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L,所述CoCl2-6H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3B03在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L，所述Na2Mo042H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnS04*4H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuS04*5H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述ZnS047H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述甘氨酸在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述硫胺素在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述鹽酸吡哆辛在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述6-芐氨基腺嘌呤在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1.Omg/L，所述a-萘乙酸在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述蔗糖在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1.Og/L，所述乙酰丁香酮在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為100umol/L,所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值為5.2。上述過(guò)程中，在所述共培養(yǎng)后，包括誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的步驟；和/或，所述目的基因?yàn)锽t-pinll基因和bar基因；所述Bt-pinll基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述bar基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；和/或，所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)和所述生根培養(yǎng)的方法中培養(yǎng)條件均為溫度為25V、光照周期為16h光照/8h黑暗、光強(qiáng)度為30001x；和/或，所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基由NH4N03、KN03、CaCl22H20、MgS04.7H20、KH2P04、FeS047H20、EDTANa2、KI、CoCl26H20、H3B03、Na2Mo042H20、MnS044H20、CuS045H20、ZnS047H20、肌醇、煙酸、甘氨酸、硫胺素、鹽酸吡哆辛、6-芐氨基腺嘌呤、a-萘乙酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦(稱(chēng)Phosphinothricin或PPT)、羧卞青霉素(Carbenicillin)和水組成；所述NH4N03在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KN03在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl22H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L,所述MgS047H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2P04在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeS047H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L，所述EDTANa2在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl26H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3B03在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L,所述Na2Mo042H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L，所述MnS044H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuS045H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnS047H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述甘氨酸在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基基中的濃度為2.Omg/L，所述硫胺素在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述鹽酸吡哆辛在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述6-芐氨基腺嘌呤在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1.Omg/L，所述a-萘乙酸在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述蔗糖在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1.0g/L，所述草胺膦在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為3-7mg/L，所述羧卞青霉素在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為300mg/L，所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基的pH值為5.8；和/或，所述生根培養(yǎng)基由NH4N03、KN03、CaCl22H20、MgS047H20、KH2P04、FeS047H20、EDTANa2、KI、CoCl26H20、H3B03、Na2Mo042H20、MnS044H20、CuS045H20、ZnS047H20、肌醇、煙酸、甘氨酸、硫胺素、鹽酸吡哆辛、6-芐氨基腺嘌呤、a-萘乙酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦、頭孢霉素和水組成；所述NH4N03在生根培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KN03在生根培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl22H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L，所述MgS047H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2P04在生根培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeS047H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTANa2在生根培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl26H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3B03在生根培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L,所述Na2Mo042H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L，所述MnS04*4H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L，所述CuS045H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnS047H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在生根培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在生根培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述甘氨酸在生根培養(yǎng)基中的濃度為2.0mg/L，所述硫胺素在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L,鹽酸吡哆辛在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L,所述6-芐氨基腺嘌呤在生根培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L，所述a-萘乙酸在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述蔗糖在生根培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在生根培養(yǎng)基中的濃度為1.0g/L，所述草胺膦在生根培養(yǎng)基中的濃度為3-7mg/L，所述頭孢霉素在生根培養(yǎng)基中的濃度為20-25mg/L，所述生根培養(yǎng)基的pH值為5.8。上述過(guò)程中，所述甘藍(lán)為觀賞羽衣甘藍(lán)，具體可為京冠白1號(hào)品種。由上述任一所述方法獲得的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種獲得轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)純合體的方法。本發(fā)明所提供的獲得轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)純合體的方法，包括如下步驟取上述任一所述的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的小孢子，進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、生根培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)純合體；所述小孢子取自如下時(shí)期的花蕾含70%單核靠邊期小孢子細(xì)胞和30%雙核期小孢子細(xì)胞的花蕾；和/或，所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)中使用的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基由KN03、Ca(N03)2*4H20、MgS047H20、KH2P04、FeS047H20、EDTANa2、KI、CoCl26H20、H3B03、Na2Mo042H20、MnS044H20、CuS045H20、ZnS047H20、肌醇、煙酸、卩比哆醇、硫胺素、甘氨酸、葉酸、生物素、谷氨酰胺、絲氨酸、谷胱甘肽、6-芐氨基腺嘌呤、蔗糖、活性炭和水組成；所述KN03在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為125mg/L，所述Ca(N03)24H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為500mg/L，所述MgS047H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為125mg/L，所述1^#04在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為125mg/L，所述FeS047H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTANa2在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl26H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3B03在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L，所述Na2Mo042H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnS044H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuS045H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnS047H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為lOOmg/L，所述煙酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述吡哆醇在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L,所述硫胺素在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述甘氨酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述葉酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述生物素在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.05mg/L，所述谷氨酰胺在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為800mg/L，所述絲氨酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L,所述谷胱甘肽在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為30mg/L，所述6-芐氨基腺嘌呤在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5-1.2mg/L，所述蔗糖在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為130g/L，所述活性炭在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.2g/L；所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的PH值為5.9;和/或，所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為在溫度為33°C且黑暗條件下高溫脅迫處理24小時(shí)后，再在溫度為25°C且黑暗條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)胚；和/或，所述小孢子在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為105個(gè)/mL；和/或，所述分化及篩選培養(yǎng)中所使用的分化培養(yǎng)基由NH4N03、KN03、CaCl22H20、MgS047H20、KH2P04、FeS047H20、EDTANa2、KI、CoCl26H20、H3B03、Na2Mo042H20、MnS044H20、CuS045H20、ZnS047H20、肌醇、煙酸、吡哆醇、硫胺素、甘氨酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦和水組成；所述NH4N03在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KN03在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl2.2H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L，所述MgS04.7H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2P04在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeS04.7H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTA.Na2在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L,所述KI在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl2.6H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3BO3在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L,所述Na2MoO4.2H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L，所述MnSO4.4H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L，所述CuSO4.5H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述ZnSO4.7H20在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述吡哆醇在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述硫胺素在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述甘氨酸在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述蔗糖在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為10g/L，所述草胺膦在所述分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為5.5-8.5mg/L；所述分化及篩選培養(yǎng)基的pH值為5.8。和/或，所述分化及篩選培養(yǎng)的條件為在溫度為25°C、光強(qiáng)為2000LUX、光照時(shí)間為16小時(shí)光照/天的條件下進(jìn)行分化及篩選培養(yǎng)20天；和/或，所述生根培養(yǎng)中使用的生根培養(yǎng)基由NH4N03、KNO3>CaCl2·2H20、MgSO4·7H20、KH2PO4,FeSO4·7H20、EDTA·Na2,ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3,Na2MoO4·2H20、MnSO4·4H20、CuSO4·5H20、ZnSO4·7H20、肌醇、煙酸、吡哆醇、硫胺素、甘氨酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦和水組成；所述NH4NO3在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為825mg/L，所述KNO3在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為950mg/L，所述CaCl2·2H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為220mg/L，所述MgSO4·7H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為185mg/L，所述KH2PO4在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為85mg/L，所述FeSO4·7Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L，所述EDTA.Na2在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl2·6Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述H3BO3在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L，所述Na2MoO4·2Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L，所述MnSO4·4Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L，所述CuSO4·5H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnSO4·7H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L,所述肌醇在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述吡哆醇在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述硫胺素在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.Img/L，所述甘氨酸在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述蔗糖在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為15g/L，所述瓊脂在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為8.Og/L，所述草胺膦在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為5.5-8.5mg/L，所述生根培養(yǎng)基的pH值為5.9；和/或，所述生根培養(yǎng)的條件為在溫度為25°C、光強(qiáng)2000LUX且光照時(shí)間為16小時(shí)光照/天。上述過(guò)程中，所述甘藍(lán)為觀賞羽衣甘藍(lán)，具體可為京冠白1號(hào)品種。本發(fā)明公開(kāi)了一種利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的組織轉(zhuǎn)化途徑，并結(jié)合轉(zhuǎn)基因材料的游離小孢子培養(yǎng)，快速獲得純合的抗蟲(chóng)兼抗除草劑觀賞羽衣甘藍(lán)的方法及所用的培養(yǎng)基。本發(fā)明具有以下環(huán)節(jié)及特征1)以雙價(jià)抗蟲(chóng)基因Bt-pinll為目的基因，以編碼除草劑Basta抗性的bar基因?yàn)闃?biāo)記基因，選擇觀賞羽衣甘藍(lán)的帶柄子葉為外植體，經(jīng)系列的轉(zhuǎn)化技術(shù)指標(biāo)優(yōu)化后，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高頻率轉(zhuǎn)化再生體系。該體系條件下非選擇培養(yǎng)基上的對(duì)照外植體的不定芽誘導(dǎo)率達(dá)100%，每個(gè)外植體上不定芽數(shù)高達(dá)25個(gè)；選擇培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化處理后外植體的不定芽誘導(dǎo)率達(dá)48%，每個(gè)外植體上的再生芽數(shù)平均為1-2個(gè)，經(jīng)分子鑒定確認(rèn)，再生植株中外源基因陽(yáng)性的植株比例約73%，因此外植體的轉(zhuǎn)化頻率約達(dá)35%。人工飼喂小菜蛾幼蟲(chóng)的結(jié)果證明，獲得的轉(zhuǎn)基因再生株具有抗蟲(chóng)性，最好的抗性材料其幼蟲(chóng)致死率可達(dá)97%。2)采用具有良好抗蟲(chóng)性的轉(zhuǎn)基因再生株為花粉供體母株，通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)胚狀體發(fā)生途徑，結(jié)合在胚成苗階段及幼苗生根階段的除草劑抗性篩選，快速獲得純合的轉(zhuǎn)基因植株，并在其自交后代中，通過(guò)對(duì)標(biāo)記性狀——除草劑Basta抗性的鑒定，證明沒(méi)有出現(xiàn)抗性分離，進(jìn)一步證實(shí)外源基因得到了純合。自外植體的轉(zhuǎn)化至純合轉(zhuǎn)基因抗性材料的獲得，僅需要短暫的三年時(shí)間，這是常規(guī)育種所不能達(dá)到的。本發(fā)明獲得的新材料，可以直接在生產(chǎn)中應(yīng)用，也可以用于進(jìn)一步的雜交育種體系，培育抗蟲(chóng)抗除草劑的雜種新一代。由于國(guó)際上觀賞植物的基因工程產(chǎn)品較之食用類(lèi)作物更易獲得基因工程產(chǎn)品的安全生產(chǎn)許可，本發(fā)明將具有現(xiàn)實(shí)的社會(huì)效應(yīng)和經(jīng)濟(jì)、生態(tài)效■、Λfrff.ο圖1帶柄子葉外植體在芽誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基上形成Basta抗性不定芽圖2再生株在添加Basta的生根培養(yǎng)基上生根圖3再生株完成移栽馴化圖4再生株中外源基因的分子雜交鑒定圖5再生株葉片的小菜蛾幼蟲(chóng)抗性鑒定圖6轉(zhuǎn)基因再生株的游離小孢子培養(yǎng)形成的胚狀體圖7小孢子再生植株中除草劑抗性的分離情況。圖8小孢子再生株后代的外源基因得到純合(全部抗除草劑Basta)。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。試材為觀賞羽衣甘藍(lán)白色皺葉類(lèi)型，品種名稱(chēng)為“京冠白1號(hào)”，“京冠白1號(hào)”的種子購(gòu)自北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心。除草劑Basta購(gòu)自AgrEvo公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為9000471。實(shí)施例1、培育重組觀賞羽衣甘藍(lán)的方法實(shí)驗(yàn)一、培育重組觀賞羽衣甘藍(lán)及鑒定(一)培育重組觀賞羽衣甘藍(lán)為了考察所建立的離體培養(yǎng)體系是否有效，實(shí)驗(yàn)中以相同材料設(shè)置對(duì)照，對(duì)照外植體在預(yù)培養(yǎng)后直接進(jìn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(表1)，不與農(nóng)桿菌接觸，也不經(jīng)篩選培養(yǎng)(即無(wú)步驟4、5、6)。1、無(wú)菌材料的獲得挑選籽粒飽滿、大小均勻無(wú)病蟲(chóng)害的種子，75%酒精消毒30s，無(wú)菌水沖洗3次，3%次氯酸鈉(V/V，)消毒15min(其間不斷搖動(dòng)，加一滴吐溫)，無(wú)菌水沖洗4次，無(wú)菌濾紙吸干種子表面水分，播種于MS基本培養(yǎng)基上，每瓶播種20粒。25°C散射光下或是黑暗中發(fā)芽。2、外植體的預(yù)培養(yǎng)切取萌發(fā)4天后無(wú)菌苗的帶柄子葉(柄長(zhǎng)2mm左右)作為外植體，接種(切口插入培養(yǎng)基)到預(yù)培養(yǎng)基上，在25°C、16h光照/8h黑暗光周期、光強(qiáng)度為30001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2d。3、重組農(nóng)桿菌菌液的制備重組農(nóng)桿菌EHA105/pBAC173的制備質(zhì)粒載體pBAC173中含抗蟲(chóng)基因Bt-pinll，及除草劑抗性基因bar，Bt-pinII基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，bar基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。載體pBBBasta-pinll(張軍杰，劉凡，羅晨，姚磊，趙泓，黃玉碧.大白菜的馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)化及抗菜青蟲(chóng)性的鑒定，園藝學(xué)報(bào)，2004，31(2):193-198.)(北京市農(nóng)林科學(xué)院)；載體pBPC56在基礎(chǔ)載體pSP72(購(gòu)自Promega公司)的HindIII和XbaI位點(diǎn)之間插入CaMV35S啟動(dòng)子(GenBankNo.AF502128所示序列中自5'末端起第25-859位核苷酸序列)、BamHI和KpnI位點(diǎn)插入bar基因(序列表中序列3所示)、KpnI和EcoRI位點(diǎn)之間插入Nos終止子(GenBankNo.AF502128所示序列中自5'末端起第2778-3030位核苷酸序列)，得到的重組載體記作載體PBPC56；載體PBPC56RL將pBPC56用HindIII酶切，用T4DNApolymerase(購(gòu)自Promega公司)補(bǔ)平，引入EcoRI接頭子(CCGGAATTCCGG，上海生工公司合成)獲得；^ff^IrWEHA105(HoodEE,KusnadiA,NikolovΖ,HowardJA.Molecularfarmingofindustrialproteinsfromtransgenicmaize.AdvExpMedBiol.1999，464:127-47)(北京市農(nóng)林科學(xué)院)；MJt^WpCAMBIA0390Hajdukiewicz，P.，Svab,Ζ.andMaliga,P.ThesmallversatiIepPZPfamilyofAgrobacteriumbinaryvectorsforplanttransformationoPlantMol.Biol.25(6)，989-994(1994)。(北京市農(nóng)林科學(xué)院)具體操作如下3-1、Bt基因CrylAb/Ac的人工合成與克隆采用植物基因表達(dá)密碼子偏好原則，在上海生工生物工程公司合成序列1所示CrylAb/Ac基因(即Bt基因)。將合成的基因與pUC_T載體連接，得到重組質(zhì)粒記作pUC-btl920。②根據(jù)CrylAb/Ac(l-1920bp)序列設(shè)計(jì)引物，在上游引物Crypl—端引入BamHI位點(diǎn)，在下游引物Cryl920R—端引入BglII位點(diǎn)，并設(shè)置終止密碼子。用長(zhǎng)PCR的方法擴(kuò)增目的基因(l_1930bp)。上游引物Cryp1:5，GGATCCATGGACAACAACCCAAACATCA3'下游引物Cryl920R:5，CAGATCGGCCTGAAGACCTGATAGATCT3’③PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>④PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序951預(yù)變性31^11，941變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸3min，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。⑤克隆序列的測(cè)序鑒定將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與pGEM-TeasyVector載體連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有IPTG和X_gal的LB/Amp平板上篩選白色菌落，對(duì)重組子進(jìn)行EcoRI酶切鑒定。把酶切檢測(cè)正確的質(zhì)粒送到公司進(jìn)行Sp6/T7雙向測(cè)序。比對(duì)結(jié)果表明(軟件DNAMAN)，所克隆序列與目標(biāo)基因序列同源性100%，可以確定克隆到的DNA片段就是CrylAb/Ac基因。3-2、Bt基因片段的克隆與Bt-PinII融合基因的克隆根據(jù)CrylAb(l-1920bp)和PinIIX04118基因序列，分別設(shè)計(jì)引物，先去除PinII的內(nèi)含子(intron)，然后把Bt和PinII基因融合成一個(gè)基因片段。Partl為PinII基因intron前面部分；Part2為intron后面部分。第一步，Bt-Partl融合根據(jù)基因序列，設(shè)計(jì)下游引物pin2_lAr，引物部分與CrylAb/Ac(l_1920bp)片段在1900-1920bp處有互補(bǔ)序列20bp，上游引物為Crypl，模板為pUC-btl920。擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為1960bp。pin2-lAr(58bp):GTAGGTAAGCAACGAAATTAACTTCCTTGTGAACATCCATGGTCTTCAGGCCGATCTG①PCR擴(kuò)增體系(25μL)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>②PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序95°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸3min，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。第二步，PinII基因Part2部分的PCR擴(kuò)增。分別設(shè)計(jì)引物，模板為pBBBasta-pinll質(zhì)粒DNA，擴(kuò)增大小為843bp的目的片段。引物如下上游弓丨物pin2-2f(52bp):TAATTTCGTTGCTTACCTACTAATTGTTCTTGGATTATTGGTACTTGTAAGC下游引物pin2-3r(30bp):GAATTCTGTAAATTATCTCACTTTATTAAG①PCR擴(kuò)增體系<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>②PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序95°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸lmin50s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。第三步，Bt-PinII融合。1960bp和843bp之間有20bp重疊區(qū)域，設(shè)計(jì)引物重疊延伸，用PCR方法擴(kuò)增整個(gè)基因片段，長(zhǎng)度為2783bp。模板為第一步的擴(kuò)增產(chǎn)物(模板1)和第二步的擴(kuò)增產(chǎn)物(模板2)的混合物，引物為Crypl和pin2-3r。①PCR擴(kuò)增體系(25μL)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>②PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序95°C預(yù)變性3min，94°C變性40s，56°C退火50s，72°C延伸4min20s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。得到的2.8kbPCR產(chǎn)物，測(cè)序驗(yàn)證，序列如序列表中序列2所示，確認(rèn)為Bt-PinII融合基因。3-3、表達(dá)載體PBAC173的構(gòu)建用BamHI和EcoRI分別雙酶切pBPC56和Bt-PinII基因，回收，連接，獲得中間載體PBAC169；在用HindIII和EcoRI雙酶切中間載體pBAC169和載體pCAMBIA0390，回收片段，連接，得到中間載體PBAC170；然后分別用EcoRI單酶切中間載體pBAC170(CIP處理)和載體PBPC56RL，回收，連接，獲得表達(dá)載體pBAC173。3-4、重組質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及鑒定①在超凈工作臺(tái)中將10μ1連接產(chǎn)物加入到100μ1的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，置冰水浴上30min。②42°C水浴熱激90s，再放入冰浴中12min。③加入900mlLB液體培養(yǎng)基，37°C，150rpm振蕩培養(yǎng)1.52h。④在已加入Amp(50μg/)的LB固體培養(yǎng)基上，均勻涂抹上X_gal(20mg/mL)40μ1和IPTG(200mg/mL)4y1的混合液。⑤將活化好的均勻涂布在上述LB平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，第二天觀察結(jié)果。重組質(zhì)粒的PCR鑒定及酶切鑒定挑出白色菌落，進(jìn)行PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系和條件與前述擴(kuò)增基因片段同。挑取PCR初步鑒定得到的白色單菌落，在含抗生素的液體LB中過(guò)夜培養(yǎng)，收集菌體，提取質(zhì)粒，選用重組質(zhì)粒上的單、雙酶切位點(diǎn)分別進(jìn)行酶切鑒定。正確的質(zhì)粒DNA用于下一步農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。3-5、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105(1)農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備①挑取農(nóng)桿菌EHA105單菌落于ΥΕΒ+50μg/Rif+50μg/Kan的液體培養(yǎng)基，28°C，黑暗，培養(yǎng)過(guò)夜(16h)。②取過(guò)夜培養(yǎng)菌液500μ1接種于50mLYEB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0.51.O0③菌液冰上放置15min后，4°C，2000g，離心5min，棄上清。④用ImL預(yù)冷的20mmol/LCaCl2懸浮細(xì)胞，每100μ1分裝到1.5的EP管中即可用于轉(zhuǎn)化。⑤如果不立即使用，加入甘油，液氮中速凍，置-70°C保存?zhèn)溆谩?2)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及鑒定①取100μ1感受態(tài)細(xì)胞，加入1μg提取自上述大腸桿菌，并經(jīng)驗(yàn)證確認(rèn)的質(zhì)粒PBAC173DNA,液氮中速凍3min，37°C水浴5min，然后各加入ImLYEB培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)24h0②IOOOOrpm離心30s，棄上清，分別加入0.IYEB培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，分別涂布于含有50μg/Kan和50μg/Rif的YEB平板上，28°C黑暗培養(yǎng)23d。③挑單菌落，接種于YEB液體(含有50μg/Kan,500μg/Sm和50μg/Rif)培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。④提取質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定或者重新轉(zhuǎn)化到大腸桿菌提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果得到陽(yáng)性重組農(nóng)桿菌，記作農(nóng)桿菌EHA105/pBAC173。農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與活化將重組農(nóng)桿菌EHA105/pBAC173的單克隆接種于含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福霉素的20mlLB液體培養(yǎng)基中，28°C，黑暗培養(yǎng)2d，至培養(yǎng)物的OD6tltl值為0.8-1.0；4000rpm離心收集菌體沉淀；菌侵染液的制備將菌體沉淀重新懸浮于感染液(表1)中，使其0D_為0.4，得到菌侵染液。LB液體培養(yǎng)基由胰蛋白胨、酵母提取物和NaCl組成；胰蛋白胨在LB液體培養(yǎng)基中的濃度為10g/L，酵母提取物在LB液體培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，NaCl在LB液體培養(yǎng)基中的濃度為10g/L；LB液體培養(yǎng)基的pH7.0。4、農(nóng)桿菌侵染外植體把預(yù)培養(yǎng)后的外植體放入重組農(nóng)桿菌EHA105/pBAC173侵染液中，浸泡4min，取出外植體，并在無(wú)菌濾紙上吸干多余菌液，接種到共培養(yǎng)基上。5、共培養(yǎng)在25°C、黑暗條件下共培養(yǎng)2d；共培養(yǎng)培養(yǎng)基如表1。6、轉(zhuǎn)化不定芽的誘導(dǎo)及篩選完成共培養(yǎng)后的材料接種到芽誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基上，在25°C、16h光照/8h黑暗光周期、光強(qiáng)度為30001x的培養(yǎng)條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化不定芽的誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)。20天左右，待幼芽長(zhǎng)至3cm左右(圖1)時(shí)，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基促使植株的生長(zhǎng)及根的形成。芽誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基如表17、生根及移栽將步驟6得到的苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(表1)，在25°C、16h光照/8h黑暗光周期、光強(qiáng)度為30001x的培養(yǎng)條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)10天，幼苗長(zhǎng)出新根，并迅速成株(圖2)。具有5片真葉后，即可出瓶移栽。移栽基質(zhì)由草炭和蛭石組成，質(zhì)量比為草炭蛭石=11，間隙覆蓋薄膜保濕一周后可完全揭掉(圖3)，植株存活率為100%。植株存活率的計(jì)算公式為存活率=存活植株數(shù)/移栽植株總數(shù)X100%。在上述實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)照組對(duì)照外植體在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(非選擇培養(yǎng)基上，見(jiàn)表1)培養(yǎng)20天左右，有大量的不定芽自子葉柄切口處形成，外植體的不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)100%，每個(gè)外植體上不定芽數(shù)高達(dá)25個(gè)。實(shí)驗(yàn)組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化處理后的外植體，在加有除草劑Basta(含PPT)的選擇培養(yǎng)基上，部分變褐，無(wú)不定芽形成，部分外植體的子葉柄切口端在插入培養(yǎng)基部位形成一些綠色不定芽，外植體的不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)48%，每個(gè)外植體上的再生芽數(shù)平均為1-2個(gè)。外植體的不定芽誘導(dǎo)率=具不定芽發(fā)生的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)χ100%。本發(fā)明中用外植體的轉(zhuǎn)化率來(lái)表示轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算公式為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)xlOO%。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)化效率為35%。MS基本培養(yǎng)基組成與文獻(xiàn)“MurashigeΤ.andF.Skoog,1962.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissueculture.Physiol.Plant.15:473_497.”中所述MS基本培養(yǎng)基組成一致。表1、用于羽衣甘監(jiān)遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的培養(yǎng)基配方及滅菌方式<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(二)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定1、轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定質(zhì)粒pBAC173的構(gòu)建方法與實(shí)驗(yàn)(一)中所述一致。選取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的轉(zhuǎn)基因植株，提取基因組DNA；以質(zhì)粒pBAC173DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)基因植株DNA作為陰性對(duì)照，不加DNA反應(yīng)管作空白對(duì)照，對(duì)羽衣甘藍(lán)再生植株基因組DNA進(jìn)行外源基因片段的PCR擴(kuò)增及Southern雜交鑒定；PCR擴(kuò)增引物為來(lái)自bar基因的特異序列，具體為5，-AACTTCCGTACCGAGCCGCA-3，，5，-ATGCCAGTTCCCGTGCTTGA-3’，Southern雜交中使用的核酸探針為地高辛標(biāo)記的bar基因序列。對(duì)在芽誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基上獲得的分別來(lái)自不同外植體的86個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株進(jìn)行了PCR鑒定，隨機(jī)取樣其中的18份材料進(jìn)行了Southern雜交鑒定。根據(jù)Southern雜交結(jié)果，確定再生植株中外源基因陽(yáng)性植株的頻率。代表性結(jié)果如圖4所示。圖4中，泳道1表示非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧?，泳?至泳道5為4個(gè)陽(yáng)性植株，泳道6為未檢測(cè)到外源基因的再生植株。18份材料的鑒定結(jié)果表明，再生株中，外源基因陽(yáng)性的植株頻率約為73%，這樣推算出外植體的轉(zhuǎn)化頻率約為35%(73%x48%)0這在蕓薹屬作物中是很高的。外植體轉(zhuǎn)化頻率的計(jì)算公式外源基因陽(yáng)性植株頻率χ外植體的抗性不定芽誘導(dǎo)率。2、轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(chóng)性鑒定接蟲(chóng)方法取轉(zhuǎn)基因植株及對(duì)照植株對(duì)等位置葉片，表面清洗并吸干水分后，分別放入墊有濾紙保濕的直徑9厘米培養(yǎng)皿中；將同期孵化約6小時(shí)的小菜蛾幼蟲(chóng)(1-2齡)放入培養(yǎng)皿中的菜葉上，每皿放幼蟲(chóng)10頭，每處理重復(fù)5次。在25°C，RH為60-70%條件下進(jìn)行飼蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)(圖5)。每三天更換培養(yǎng)皿中葉片。共實(shí)驗(yàn)15天，統(tǒng)計(jì)平均死亡率。調(diào)查方法每日觀察一次，檢查幼蟲(chóng)的存活數(shù)量(以毛筆輕觸蟲(chóng)體，無(wú)任何反應(yīng)判為死亡)，觀察記錄1-2齡、3-4齡幼蟲(chóng)死亡數(shù)量，統(tǒng)計(jì)平均死亡率(表2)。表2、飼喂轉(zhuǎn)Bt-PinII基因葉片的小菜蛾幼蟲(chóng)死亡率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>17"3-10__24__表中173-1至173-10為轉(zhuǎn)基因植株葉片。結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因起始材料相比，各個(gè)轉(zhuǎn)基因植株葉片均有較高的抗蟲(chóng)效果，不同單株的抗蟲(chóng)效果不同，但存在具有高抗性的單株，取食小菜蛾幼蟲(chóng)的死亡率可達(dá)97%。實(shí)驗(yàn)二、培育重組觀賞羽衣甘藍(lán)所用的種子為京冠白1號(hào)，與實(shí)驗(yàn)一中相同。(一)培育重組觀賞羽衣甘藍(lán)為了考察所建立的離體培養(yǎng)體系是否有效，實(shí)驗(yàn)中以相同材料設(shè)置對(duì)照，對(duì)照外植體在預(yù)培養(yǎng)后直接進(jìn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不與農(nóng)桿菌接觸，也不經(jīng)篩選培養(yǎng)(無(wú)步驟4、5、6)。1、無(wú)菌材料的獲得實(shí)驗(yàn)中所使用的種子為京冠白1號(hào)。方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。2、外植體的預(yù)培養(yǎng)方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同，不同的是切取萌發(fā)3天后無(wú)菌苗的帶柄子葉(柄長(zhǎng)Imm左右)作為外植體。預(yù)培養(yǎng)基如表1所示。3、重組農(nóng)桿菌菌液的制備方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。不同的是重組農(nóng)桿菌菌液的濃度為OD6tltl為0.3。重組農(nóng)桿菌EHA105/pBAC173與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。LB液體培養(yǎng)基與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。4、農(nóng)桿菌侵染外植體方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同，不同的是浸泡3min。5、共培養(yǎng)方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同，不同的是共培養(yǎng)的溫度為22°C。共培養(yǎng)培養(yǎng)基如表1。6、轉(zhuǎn)化不定芽的誘導(dǎo)及篩選方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同，不同的是篩選培養(yǎng)基中PPT的濃度為3mg/L。7、生根及移栽方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同，不同的是生根培養(yǎng)基中PPT的濃度為3mg/L，頭孢霉素的濃度為20mg/L。在上述實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)照外植體在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(非選擇培養(yǎng)基上)20天左右，有多量的不定芽自子葉柄切口處形成，外植體的不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)100%，每個(gè)外植體上不定芽數(shù)可達(dá)18個(gè)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化處理后的外植體，在加有PPT的選擇培養(yǎng)基上，部分變褐，無(wú)不定芽形成，部分外植體的子葉柄切口端在插入培養(yǎng)基部位形成一些綠色不定芽，外植體的不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)40%，每個(gè)外植體上的再生芽數(shù)平均為1個(gè)。外植體的不定芽誘導(dǎo)率=具不定芽發(fā)生的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)χ100%。(二)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定1、轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。結(jié)果表明，再生株中外源基因陽(yáng)性的植株頻率約為75%，這樣推算出外植體的轉(zhuǎn)化頻率約為30%(75%x40%)，比實(shí)驗(yàn)一中的外植體轉(zhuǎn)化頻率稍低，推測(cè)原因可能是所取用的是發(fā)芽3天后的帶柄子葉外植體，較幼嫩，致使對(duì)農(nóng)桿菌更敏感。外植體轉(zhuǎn)化頻率的計(jì)算公式外源基因陽(yáng)性植株頻率χ外植體的不定芽誘導(dǎo)率。2、轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(chóng)性鑒定方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因起始材料相比，各個(gè)轉(zhuǎn)基因植株葉片均有較高的抗蟲(chóng)效果，不同單株的抗蟲(chóng)效果不同，但存在具有高抗性的單株，取食小菜蛾幼蟲(chóng)的死亡率可達(dá)96%，與實(shí)驗(yàn)一中結(jié)果無(wú)顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)條件下，外植體的轉(zhuǎn)化效率為30%。實(shí)驗(yàn)三、培育重組觀賞羽衣甘藍(lán)所用的種子為京冠白1號(hào)，與實(shí)驗(yàn)一中相同。(一)培育重組觀賞羽衣甘藍(lán)為了考察所建立的離體培養(yǎng)體系是否有效，實(shí)驗(yàn)中以相同材料設(shè)置對(duì)照，對(duì)照外植體在預(yù)培養(yǎng)后直接進(jìn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不與農(nóng)桿菌接觸，也不經(jīng)篩選培養(yǎng)(無(wú)步驟4、5、6)。1、無(wú)菌材料的獲得實(shí)驗(yàn)中所使用的種子為京冠白1號(hào)，與實(shí)驗(yàn)一中相同。方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。2、外植體的預(yù)培養(yǎng)方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同，不同的是切取萌發(fā)5天后無(wú)菌苗的帶柄子葉(柄長(zhǎng)4mm左右)作為外植體。預(yù)培養(yǎng)基如表1所示。3、重組農(nóng)桿菌菌液的制備方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。不同的是重組農(nóng)桿菌菌液的濃度為OD6tltl為0.5。重組農(nóng)桿菌EHA105/pBAC173與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。LB液體培養(yǎng)基與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。4、農(nóng)桿菌侵染外植體方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同，不同的是浸泡5min。5、共培養(yǎng)方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同，不同的是共培養(yǎng)的溫度27°C。共培養(yǎng)培養(yǎng)基如表1。6、轉(zhuǎn)化不定芽的誘導(dǎo)及篩選方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同，不同的是篩選培養(yǎng)基中PPT的濃度為7mg/L。7、生根及移栽方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同，不同的是生根培養(yǎng)基中PPT的濃度為7mg/L，頭孢霉素在生根培養(yǎng)基中的濃度為25mg/L。在上述實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)照外植體在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(非選擇培養(yǎng)基上)20天左右，有多量的不定芽自子葉柄切口處形成，外植體的不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)95%，每個(gè)外植體上不定芽數(shù)可達(dá)16個(gè)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化處理后的外植體，在加有除草劑Basta(含PPT)的選擇培養(yǎng)基上，部分變褐，無(wú)不定芽形成，部分外植體的子葉柄切口端在插入培養(yǎng)基部位形成一些綠色不定芽，外植體的不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)36%，每個(gè)外植體上的再生芽數(shù)平均為1個(gè)。外植體的不定芽誘導(dǎo)率=具不定芽發(fā)生的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)χ100%。(二)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定1、轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。結(jié)果表明，再生株中外源基因陽(yáng)性的植株頻率約為80%，這樣推算出外植體的轉(zhuǎn)化頻率約為28.8%(外植體轉(zhuǎn)化頻率=外源基因陽(yáng)性植株頻率80%χ外植體的不定芽誘導(dǎo)率36%)，比實(shí)驗(yàn)一中的外植體轉(zhuǎn)化頻率低，推測(cè)原因可能是所取用的是發(fā)芽5天后的帶柄子葉外植體，子葉柄偏長(zhǎng)，不定芽誘導(dǎo)能力降低所致。此外還可見(jiàn)再生株中外源基因陽(yáng)性的植株頻率提高(約為80%)，這說(shuō)明芽誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基中使用7mg/L的PPT濃度是有效的。2、轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(chóng)性鑒定方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因起始材料相比，各個(gè)轉(zhuǎn)基因植株葉片均有較高的抗蟲(chóng)效果，不同單株的抗蟲(chóng)效果不同，但存在具有高抗性的單株，取食小菜蛾幼蟲(chóng)的死亡率可達(dá)95%，與實(shí)驗(yàn)一中結(jié)果無(wú)顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)條件下，外植體的轉(zhuǎn)化效率為28.8%。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因再生株通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)快速得到純合材料一般情況下，獲得的轉(zhuǎn)基因植株中，外源基因都是呈雜合態(tài)存在，如果受體材料自生的遺傳背景也是雜合的，如在甘藍(lán)類(lèi)作物中，常規(guī)需要8-10年時(shí)間的自交，才能獲得完全純合的材料，用于雜交制種。本實(shí)驗(yàn)采用單倍體育種方法，結(jié)合轉(zhuǎn)基因材料的特性，在1-2年的時(shí)間內(nèi)快速培育出純合的轉(zhuǎn)基因材料。將抗蟲(chóng)性良好的轉(zhuǎn)基因羽衣甘蘭供體母株173-2，173-6，173-7,173-8,173-9栽種于具有防蟲(chóng)網(wǎng)的塑料大棚內(nèi)，在3-6月上旬采集小孢子用本發(fā)明的方法進(jìn)行體外培養(yǎng)，可以一次性獲得純合的轉(zhuǎn)基因植株。具體過(guò)程包括以下步驟實(shí)驗(yàn)一、純合體的獲得1)游離小孢子培養(yǎng)通過(guò)細(xì)胞核的DAPI熒光染色(ColemenAW,GoffLJ.ApplicationoffluorochrometopollenbiologyI.Mithramycinand4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)asvitalstainandforquantificationofnuclearDNA.StainTechnol，1985，60:145-154)，顯微鏡檢，確定小孢子的發(fā)育時(shí)期，取含70%單核靠邊期小孢子細(xì)胞和30%雙核期小孢子細(xì)胞的花蕾，將花蕾用體積比為2.5%的次氯酸鈉水溶液表面滅菌15分鐘，無(wú)菌水清洗3次，用杵棒擠壓法在B5培養(yǎng)液中釋放出游離小孢子，經(jīng)50μm孔徑尼龍網(wǎng)過(guò)濾懸浮液，IOOOrpm離心5分鐘，棄上清，以B5培養(yǎng)液重新懸浮沉淀，再重復(fù)清洗2次后，將小孢子接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，至終濃度為IO5個(gè)/mL，分裝于06cm培養(yǎng)皿中，每皿2.5mL，接著在33°C、黑暗條件下高溫脅迫處理24小時(shí)后，再轉(zhuǎn)入25°C、黑暗條件下培養(yǎng)，以誘導(dǎo)胚狀體。3天后，培養(yǎng)于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的小孢子即開(kāi)始出現(xiàn)一次分裂，在以后的培養(yǎng)時(shí)間里細(xì)胞持續(xù)分裂，依次形成細(xì)胞團(tuán)、原胚、球形胚和心型胚，約25天后形成魚(yú)雷期、子葉期胚(圖6)。之后，轉(zhuǎn)入25°C、2000Lux、16小時(shí)光照/天條件下培養(yǎng)7天。B5士音夜的農(nóng)iS~i:fi^“G￡imborgetal.Planttissueculturemedia.Invitro,1976，12:473_478”中所述相同。胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基如表3所述。2)分化及篩選培養(yǎng)將步驟1)得到的胚狀體接種于分化及篩選培養(yǎng)基中，在25°C、2000Lux、16小時(shí)光照/天條件下進(jìn)行分化培養(yǎng)20天，部分胚狀體長(zhǎng)出綠色莖、葉(圖7A)，部分胚狀體在該分化及篩選培養(yǎng)基上直接變黃、枯死，部分胚狀體即使長(zhǎng)出了莖葉，也慢慢變黃枯死(圖7B)，說(shuō)明自原始轉(zhuǎn)化再生株中，通過(guò)花粉培養(yǎng)，分離出了攜帶外源基因的配子體和沒(méi)有攜帶外源基因的配子體形成的植株，實(shí)現(xiàn)了外源基因的純合。分化及篩選培養(yǎng)基如表3所述。3)生根培養(yǎng)將長(zhǎng)出莖、葉的綠色植株轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中，在25°C、2000Lux、16小時(shí)光照/天條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到羽衣甘蘭完整再生植株。生根培養(yǎng)基如表3所述。4)移栽、采種洗凈植株根部附帶的瓊脂，移栽入基質(zhì)(草炭蛭石=11)中?；ㄆ谥仓瓿Ｒ?guī)套袋自交授粉，收獲種子。5)純合轉(zhuǎn)基因材料的鑒定將約200粒種子播種于苗盤(pán)中，子葉長(zhǎng)出后，噴施0.5%(V/V)Basta水溶液(含PPT750mg/L)，隔周?chē)娛捕?。三周后調(diào)查幼苗的除草劑抗性分離情況。結(jié)果表明，小孢子培養(yǎng)獲得的再生株中，外源基因均已純合，其后代全部抗除草劑，不發(fā)生抗性分離現(xiàn)象(圖8)。0.5%(V/V)Basta水溶液(含PPT750mg/L)就是將Basta溶于水得到的，0.5%(V/V)Basta水溶液中PPT的濃度為750mg/L。至此，在三年的時(shí)間內(nèi)快速獲得了抗蟲(chóng)兼抗除草劑的純合轉(zhuǎn)基因觀賞羽衣甘藍(lán)材料。表3、用于轉(zhuǎn)基因羽衣甘蘭游離小孢子培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方及滅菌方式<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>滅菌處理過(guò)濾滅菌高壓滅菌后加過(guò)濾滅菌的高壓滅菌后加過(guò)濾滅菌的___Basta溶液_Basta溶液_實(shí)驗(yàn)二、純合體的獲得1)游離小孢子培養(yǎng)小孢子的獲得取含70%單核靠邊期小孢子細(xì)胞和30%雙核期小孢子細(xì)胞花蕾中的小孢子，方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。將小孢子接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在33°C、黑暗條件下高溫脅迫處理24小時(shí)后，再轉(zhuǎn)入25°C、黑暗條件下培養(yǎng)，以誘導(dǎo)胚狀體，約25天后形成魚(yú)雷期、子葉期胚；再轉(zhuǎn)入25°C、2000Lux、16小時(shí)光照/天條件下培養(yǎng)7天。胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基與實(shí)驗(yàn)一中胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的不同之處在于6-BA在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L。2)分化培養(yǎng)將步驟1)得到的胚狀體接種于分化及篩選培養(yǎng)基中，在25°C、2000Lux、16小時(shí)光照/天條件下進(jìn)行分化培養(yǎng)20天，部分胚狀體長(zhǎng)出綠色莖、葉(圖7A)，部分胚狀體在該分化及篩選培養(yǎng)基上直接變黃、枯死，部分胚狀體即使長(zhǎng)出了莖葉，也慢慢變黃枯死(圖7B)，說(shuō)明自原始轉(zhuǎn)化再生株中，通過(guò)花粉培養(yǎng)，分離出了攜帶外源基因的配子體和沒(méi)有攜帶外源基因的配子體形成的植株，實(shí)現(xiàn)了外源基因的純合。分化及篩選培養(yǎng)基的組成與實(shí)驗(yàn)一中分化及篩選培養(yǎng)基的不同之處在于PPT在分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為5.5mg/L。3)生根培養(yǎng)將長(zhǎng)出莖、葉的綠色植株轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中，在25°C、2000Lux、16小時(shí)光照/天條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到羽衣甘蘭完整再生植株。生根培養(yǎng)基的組成與實(shí)驗(yàn)一中生根培養(yǎng)基的不同之處在于PPT在生根培養(yǎng)基中的濃度為5.5mg/L。4)移栽、采種方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。5)純合轉(zhuǎn)基因材料的鑒定將約200粒種子播種于苗盤(pán)中，子葉長(zhǎng)出后，噴施0.5%(V/V)Basta水溶液(含PPT750mg/L)，隔周?chē)娛?，共二次。三周后調(diào)查幼苗的除草劑抗性分離情況。結(jié)果表明，其后代全部抗除草劑，不發(fā)生抗性分離現(xiàn)象，說(shuō)明小孢子培養(yǎng)獲得的再生株中，外源基因均已純合。至此，在三年的時(shí)間內(nèi)快速獲得了抗蟲(chóng)兼抗除草劑的純合轉(zhuǎn)基因觀賞羽衣甘藍(lán)材料。實(shí)驗(yàn)三、純合體的獲得1)游離小孢子培養(yǎng)小孢子的獲得取含70%單核靠邊期小孢子細(xì)胞和30%雙核期小孢子細(xì)胞花蕾中的小孢子，方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。將小孢子接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在33°C、黑暗條件下高溫脅迫處理24小時(shí)后，再轉(zhuǎn)入25°C、黑暗條件下培養(yǎng)，以誘導(dǎo)胚狀體，約25天后形成魚(yú)雷期、子葉期胚；再在25°C、2000Lux、16小時(shí)光照/天條件下培養(yǎng)7天。胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基與實(shí)驗(yàn)一中胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的不同之處在于6-BA在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為1.2mg/L。2)分化培養(yǎng)將步驟1)得到的胚狀體接種于分化及篩選培養(yǎng)基中，在25°C、2000Lux、16小時(shí)光照/天條件下進(jìn)行分化培養(yǎng)20天，部分胚狀體長(zhǎng)出綠色莖、葉(圖7A)，部分胚狀體在該分化及篩選培養(yǎng)基上直接變黃、枯死，部分胚狀體即使長(zhǎng)出了莖葉，也慢慢變黃枯死(圖7B)，說(shuō)明自原始轉(zhuǎn)化再生株中，通過(guò)花粉培養(yǎng)，分離出了攜帶外源基因的配子體和沒(méi)有攜帶外源基因的配子體形成的植株，實(shí)現(xiàn)了外源基因的純合。分化及篩選培養(yǎng)基的組成與實(shí)驗(yàn)一中分化及篩選培養(yǎng)基的不同之處在于PPT在分化及篩選培養(yǎng)基中的濃度為8.5mg/L。3)生根培養(yǎng)將長(zhǎng)出莖、葉的綠色植株轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中，在25°C、2000Lux、16小時(shí)光照/天條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到羽衣甘蘭完整再生植株。生根培養(yǎng)基的組成與實(shí)驗(yàn)一中生根培養(yǎng)基的不同之處在于PPT在生根培養(yǎng)基中的濃度為8.5mg/L。4)移栽、采種方法與實(shí)驗(yàn)一中所述相同。5)純合轉(zhuǎn)基因材料的鑒定將約200粒種子播種于苗盤(pán)中，子葉長(zhǎng)出后，噴施0.5%(V/V)Basta水溶液(含PPT750mg/L)，隔周?chē)娛?，共二次。三周后調(diào)查幼苗的除草劑抗性分離情況。結(jié)果表明，其后代全部抗除草劑，不發(fā)生抗性分離現(xiàn)象，說(shuō)明小孢子培養(yǎng)獲得的再生株中，外源基因均已純合。至此，在三年的時(shí)間內(nèi)快速獲得了抗蟲(chóng)兼抗除草劑的純合轉(zhuǎn)基因觀賞羽衣甘藍(lán)材料。權(quán)利要求一種培育轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的方法，包括如下步驟用含有目的基因的重組農(nóng)桿菌侵染甘藍(lán)的子葉，再進(jìn)行共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述甘藍(lán)的子葉為帶柄子葉；所述柄的長(zhǎng)度為lmm-4mm；所述柄的長(zhǎng)度具體為lmm、2mm或4mm。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述侵染包括如下步驟將所述甘藍(lán)的子葉置于所述含有目的基因的重組農(nóng)桿菌的菌液中，浸泡3min-5min，得到侵染后的子葉。4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述含有目的基因的重組農(nóng)桿菌的菌液的0D600值為0.3-0.5。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)的方法包括如下步驟將所述侵染后的子葉置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在溫度為22°C_27°C且黑暗的條件下培養(yǎng)2天；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基由NH4N03、KNO3>CaCl2·2H20、MgSO4·7H20、KH2PO4,FeSO4·7H20、EDTA·Na2,ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3,Na2MoO4·2H20、MnSO4·4H20、CuSO4·5H20、ZnSO4·7H20、肌醇、煙酸、甘氨酸、硫胺素、鹽酸吡哆辛、6-芐氨基腺嘌呤、α-萘乙酸、蔗糖、瓊脂、乙酰丁香酮和水組成；所述NH4NO3在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KNO3在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl2·2H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L，所述MgSO4·7H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2PO4在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeSO4·7H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L，所述EDTA·Na2在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L,所述CoCl2·6Η20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3BO3在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L，所述Na2MoO4·2H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnSO4·4Η20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuSO4·5Η20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述ZnSO4·7H20在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述甘氨酸在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述硫胺素在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述鹽酸吡哆辛在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述6-芐氨基腺嘌呤在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1.Omg/L，所述α-萘乙酸在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述蔗糖在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為1.Og/L，所述乙酰丁香酮在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為100μmol/L,所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值為5.2。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述共培養(yǎng)后，包括誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的步驟；和/或，所述目的基因?yàn)锽t-pinll基因和bar基因；所述Bt-pinll基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述bar基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；和/或，所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)和所述生根培養(yǎng)的方法中培養(yǎng)條件均為溫度為25°C、光照周期為16h光照/8h黑暗、光強(qiáng)度為30001x；和/或，所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基由NH4N03、KNO3>CaCl2·2H20、MgSO4.7H20、KH2PO4,FeSO4·7H20、EDTA·Na2、ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3,Na2MoO4·2H20、MnSO4·4H20、CuSO4·5H20、ZnSO4·7H20、肌醇、煙酸、甘氨酸、硫胺素、鹽酸吡哆辛、6-芐氨基腺嘌呤、α-萘乙酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦、羧卞青霉素和水組成；所述NH4NO3在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KNO3在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl2·2H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L,所述MgSO4·7H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2PO4在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeSO4·7H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTA·Na2在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L,所述KI在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl2·6H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3BO3在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L,所述Na2MoO4·2H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L，所述MnSO4·4H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuSO4·5H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnSO4·7H20在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述甘氨酸在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基基中的濃度為2.Omg/L，所述硫胺素在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述鹽酸吡哆辛在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述6-芐氨基腺嘌呤在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1.Omg/L，所述α-萘乙酸在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述蔗糖在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為1.0g/L，所述草胺膦在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為3-7mg/L，所述羧卞青霉素在所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中的濃度為300mg/L，所述誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基的pH值為5.8；和/或，所述生根培養(yǎng)基由NH4N03、KN03、CaCl2·2H20、MgSO4·7H20、KH2P04、FeSO4·7H20、EDTA·Na2、ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3、Na2MoO4·2H20、MnSO4·4H20、CuSO4·5H20、ZnSO4·7H20、肌醇、煙酸、甘氨酸、硫胺素、鹽酸吡哆辛、6-芐氨基腺嘌呤、α-萘乙酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦、頭孢霉素和水組成；所述NH4NO3在生根培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KNO3在生根培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L,所述CaCl2·2H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L，所述MgSO4·7H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2PO4在生根培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeSO4·7H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L，所述EDTA·Na2在生根培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L,所述CoCl2·6H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3BO3在生根培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L,所述Na2MoO4·2H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnSO4·4H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuSO4·5H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnSO4·7H20在生根培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在生根培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在生根培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述甘氨酸在生根培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述硫胺素在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L,鹽酸吡哆辛在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L,所述6-芐氨基腺嘌呤在生根培養(yǎng)基中的濃度為1.Omg/L，所述α-萘乙酸在生根培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述蔗糖在生根培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在生根培養(yǎng)基中的濃度為1.0g/L，所述草胺膦在生根培養(yǎng)基中的濃度為3-7mg/L，所述頭孢霉素在生根培養(yǎng)基中的濃度為20-25mg/L，所述生根培養(yǎng)基的PH值為5.8;和/或，所述方法，在所述侵染前，包括如下預(yù)培養(yǎng)的步驟將所述甘藍(lán)的子葉置于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在溫度為25°C、16h光照/8h黑暗光周期和光強(qiáng)度為30001x的條件下培養(yǎng)2d;所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中除不含有乙酰丁香酮外，其余組成成分及各成分在培養(yǎng)基中的濃度與所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基相同。7.一種獲得轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)純合體的方法，取權(quán)利要求1-6中任一所述方法獲得的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的小孢子，依次進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化篩選培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)純合體；所述小孢子取自如下時(shí)期的花蕾含70%單核靠邊期小孢子細(xì)胞和30%雙核期小孢子細(xì)胞的花蕾；和/或，所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)中使用的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基由KN03、Ca(NO3)2·4H20、MgSO4·7H20、KH2PO4,FeSO4·7H20、EDTA·Na2,ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3,Na2MoO4·2H20、MnSO4·4H20、CuSO4·5H20、ZnSO4·7H20、肌醇、煙酸、卩比哆醇、硫胺素、甘氨酸、葉酸、生物素、谷氨酰胺、絲氨酸、谷胱甘肽、6-芐氨基腺嘌呤、蔗糖、活性炭和水組成；所述KNO3在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為125mg/L，所述Ca(NO3)2·4H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為500mg/L，所述MgSO4·7H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為125mg/L，所述KH2PO4在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為125mg/L，所述FeSO4·7H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTA·Na2在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl2·6H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述H3BO3在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L，所述Na2MoO4·2H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnSO4·4H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuSO4·5H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L,所述ZnSO4·7H20在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為IOOmg/L，所述煙酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述吡哆醇在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述硫胺素在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述甘氨酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述葉酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述生物素在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.05mg/L，所述谷氨酰胺在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為800mg/L，所述絲氨酸在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述谷胱甘肽在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為30mg/L，所述6_芐氨基腺嘌呤在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5-1.2mg/L，所述蔗糖在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為130g/L，所述活性炭在所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.2g/L；所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的PH值為5.9；和/或，所述胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為在溫度為33°C且黑暗條件下脅迫處理24小時(shí)后，再在溫度為25°C且黑暗條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)胚；和/或，所述小孢子在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為IO5個(gè)/mL。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述分化篩選培養(yǎng)中所使用的分化篩選培養(yǎng)基由NH4N03、KNO3>CaCl2·2H20、MgSO4·7H20、KH2PO4,FeSO4·7H20、EDTA·Na2,ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3、Na2MoO4·2H20、MnSO4·4H20、CuSO4·5H20、ZnSO4·7H20、肌醇、煙酸、批哆醇、硫胺素、甘氨酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦和水組成；所述NH4NO3在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為1650mg/L，所述KNO3在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為1900mg/L，所述CaCl2.2H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為440mg/L，所述MgSO4.7H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為370mg/L，所述KH2PO4在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為170mg/L，所述FeSO4.7H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTA.Na2在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L,所述KI在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl2.6H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述H3BO3在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L,所述Na2MoO4.2H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnSO4.4H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuSO4.5H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述ZnSO4.7H20在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L，所述肌醇在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述吡哆醇在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述硫胺素在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述甘氨酸在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述蔗糖在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為30g/L，所述瓊脂在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為10g/L，所述草胺膦在所述分化篩選培養(yǎng)基中的濃度為5.5-8.5mg/L；所述分化篩選培養(yǎng)基的pH值為5.8。和/或，所述分化篩選培養(yǎng)的條件為在溫度為25°C、光強(qiáng)為2000LUX、光照時(shí)間為16小時(shí)光照/天的條件下進(jìn)行分化篩選培養(yǎng)20天。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述生根培養(yǎng)中使用的生根培養(yǎng)基由NH4N03、KN03、CaCl2·2H20、MgSO4·7H20、KH2P04、FeSO4·7H20、EDTA·Na2、ΚΙ、CoCl2·6H20、H3BO3、Na2MoO4·2H20、MnS04·4H20、CuS04·5H20、ZnS04·7H20、肌醇、煙酸、吡哆醇、硫胺素、甘氨酸、蔗糖、瓊脂、草胺膦和水組成；所述NH4NO3在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為825mg/L，所述KNO3在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為950mg/L，所述CaCl2·2Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為220mg/L，所述MgSO4·7Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為185mg/L，所述KH2PO4在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為85mg/L，所述FeSO4·7H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為27.8mg/L,所述EDTA·Na2在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為37.3mg/L，所述KI在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.83mg/L，所述CoCl2·6Η20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述!1系03在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為6.2mg/L，所述Na2MoO4·2H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.25mg/L,所述MnSO4·4H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為22.3mg/L,所述CuSO4·5H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.025mg/L，所述ZnSO4·7H20在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為8.6mg/L,所述肌醇在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述煙酸在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述吡哆醇在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L，所述硫胺素在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L，所述甘氨酸在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為2.Omg/L，所述蔗糖在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為15g/L，所述瓊脂在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為8.Og/L，所述草胺膦在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為5.5-8.5mg/L,所述生根培養(yǎng)基的pH值為5.9；和/或，所述生根培養(yǎng)的條件為溫度為25°C、光強(qiáng)2000LUX且光照時(shí)間為16小時(shí)光照/天。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述甘藍(lán)為觀賞羽衣甘藍(lán)；所述觀賞羽衣甘藍(lán)為京冠白1號(hào)品種。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種快速培育純合抗蟲(chóng)兼抗除草劑轉(zhuǎn)基因觀賞甘藍(lán)的方法。本發(fā)明培育轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的方法包括如下步驟用含有目的基因的重組農(nóng)桿菌侵染甘藍(lán)的子葉，再進(jìn)行共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)。本發(fā)明中，在選擇培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化處理后外植體的不定芽誘導(dǎo)率達(dá)48％，每個(gè)外植體上的再生芽數(shù)平均為1-2個(gè)，經(jīng)分子鑒定確認(rèn)，再生芽的轉(zhuǎn)化頻率達(dá)35％。人工飼喂小菜蛾幼蟲(chóng)的結(jié)果證明，獲得的轉(zhuǎn)基因再生株具有抗蟲(chóng)性，最好的抗性材料其幼蟲(chóng)致死率可達(dá)97％。自外植體的轉(zhuǎn)化至純合轉(zhuǎn)基因抗性材料的獲得，僅需要短暫的三年時(shí)間。文檔編號(hào)C05G3/02GK101822156SQ201010125939公開(kāi)日2010年9月8日申請(qǐng)日期2010年3月16日優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日發(fā)明者劉凡,張曉東,張?jiān)略?趙秀樞申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院