專(zhuān)利名稱(chēng)：一種墨蘭種苗繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種蘭花育苗繁殖技術(shù)，尤其是一種組織培養(yǎng)與菌根真菌共生培養(yǎng)育 苗的繁殖技術(shù)。
背景技術(shù)：
蘭花是指整個(gè)蘭科植物(Orchidaceae)的總稱(chēng)。在我國(guó)，傳統(tǒng)的“蘭花”概念僅指 產(chǎn)于我國(guó)的蘭科、蘭屬(Cymbidium)植物，稱(chēng)國(guó)蘭，地生，故又稱(chēng)地生蘭。蘭科植物是一類(lèi)觀 賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的珍貴植物。其中，云南蘭科植物就有100屬，530多種，為全國(guó)之冠。但是到目前為止，我國(guó)蘭花開(kāi)發(fā)與利用仍處于初級(jí)階段，未能解決大量繁殖 的問(wèn)題，因此供需矛盾突出。一方面是由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)，農(nóng)民上山大量采挖野生 蘭花，野生蘭花資源受到嚴(yán)重破壞，尤其是較名貴的墨蘭(Cymbidium sinense)、春蘭 (Cymbidiumgoeringii)、寒蘭(Cymbidium kanran)、春劍(Cymbidium longibracteatun)禾口 連瓣蘭(Cymbidiumlianpan)破壞最為嚴(yán)重。其次是森林面積大幅度減少，蘭花生存環(huán)境的 改變，不僅對(duì)野生蘭花種群延續(xù)形成威脅，也使得許多種類(lèi)蘭花在一些地區(qū)消失。近年來(lái)， 我國(guó)加強(qiáng)了野生植物資源的保護(hù)工作，我國(guó)第一部專(zhuān)門(mén)保護(hù)野生植物的行政法規(guī)《中華人 民共和國(guó)野生植物保護(hù)條例》自1997年1月1日實(shí)施，根據(jù)該條例的規(guī)定，擬定并經(jīng)審議通 過(guò)了《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》，蘭科所有種均列在名錄中。但是僅采用法律形式保護(hù) 蘭花資源還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，在加強(qiáng)管理的同時(shí)，也應(yīng)重視發(fā)展蘭花的繁殖技術(shù)，才能根本解 決保護(hù)蘭花物種的目的。蘭花的繁殖技術(shù)目前主要有兩種，分株和組織培養(yǎng)。傳統(tǒng)的分株繁殖速度慢，繁殖 率低，周期長(zhǎng)，且易傷母株，種子在自然條件下發(fā)芽率極低，很難滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要。而 組織培養(yǎng)，移栽無(wú)菌苗成活率低，生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，開(kāi)花遲，甚至不開(kāi)花，原因主要是缺少與之 共生的菌根真菌。真菌為蘭花提供生長(zhǎng)繁殖所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。蘭科植物與菌根真菌形成 菌根是自然界的一種普遍現(xiàn)象，所以菌根真菌為蘭科植物提供營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育是解決人 工栽培蘭科植物的關(guān)鍵，也是我國(guó)蘭花資源與利用保護(hù)所面臨的主要問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的就是僅靠分株和組織培養(yǎng)繁殖墨蘭不能夠滿足我國(guó)蘭花植物 資源保護(hù)的問(wèn)題。本發(fā)明從野生墨蘭根中分離內(nèi)生真菌，使其與墨蘭組培苗共生培養(yǎng)，篩選 出能與墨蘭組培苗有效共生并能明顯促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育的有效菌根真菌，對(duì)墨蘭組培苗進(jìn)行 菌根化培育，從根本上克服了試管苗繁殖，缺乏菌根真菌，移栽無(wú)菌苗成活率低，生長(zhǎng)緩慢， 開(kāi)花遲緩，花小甚至不開(kāi)花的缺點(diǎn)。本發(fā)明的一種墨蘭種苗繁殖方法，其種苗獲得主要包括種子萌發(fā)、原球莖繼代增 殖和生根培養(yǎng)過(guò)程，其特征在于該繁殖方法在種苗獲得后還進(jìn)行生根苗的煉苗及與菌根真 菌的菌根化過(guò)程，具體為
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煉苗將生根苗在室內(nèi)自然光照條件下開(kāi)瓶蓋過(guò)渡1 1. 5周后取出，洗凈沾附在 小苗根部的培養(yǎng)基備用；苗木菌根化將取出的小苗用含有菌根真菌的基質(zhì)包裹種植于穴盤(pán)中，在適度溫 度下，置于陰涼通風(fēng)處栽培，期間向葉部噴灑水，促進(jìn)新根生長(zhǎng)，3周后移入溫室中進(jìn)行正常 水、肥、藥管理，9. 5月后即可得菌根化種苗；所述的基質(zhì)是按重量份分別將1/4份泥炭、1/4 份珍珠巖、1/4份干腐質(zhì)土和1/4份紅土中加入拌有菌液(Rhizoctonia sp. MLX102)的櫟樹(shù) 葉三級(jí)菌種少許而得。上述的種子萌發(fā)過(guò)程主要包括以下步驟a)外植體的選擇選擇墨蘭未裂開(kāi)的蒴果為外植體；b)種子處理將墨蘭蒴果無(wú)菌處理后取出粉沫狀種子無(wú)菌處理；c)種子萌發(fā)將經(jīng)處理的墨蘭種子均勻播種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長(zhǎng)為原 球莖；所使用的培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA0. 5 1. Omg/L+6-BAO. 5 1. 0mg/L+100ml/L椰 乳+甘露醇lg/L+活性碳0. 5g/L+蔗糖25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為5. 0 6. 0。上述的原球莖繼代增殖過(guò)程是將初代培養(yǎng)的原球莖和芽分別在培養(yǎng)基上繼代增 殖培養(yǎng)50 60天，長(zhǎng)成新芽或原球莖，以后不斷切割原球莖繼代，即可幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)；所使 用的培養(yǎng)基配方為1/2MS+KT0. 5mg/L+甘露醇lg/L+活性碳0. 5g/L+蔗糖25g/L+瓊脂3g/ L，培養(yǎng)基PH值為5.0 6.0。上述的生根培養(yǎng)過(guò)程是將較大的根系不發(fā)達(dá)的苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使生 根率達(dá)95%以上，植株生長(zhǎng)旺盛，7周后形成5 7cm的小苗；所使用的培養(yǎng)基配方為 1/2MS+NAA0. 5mg/L+ 活性碳 0. 5g/L+ 蔗糖 25g/L+ 瓊脂 3g/L，培養(yǎng)基 PH 值為 5. 0 6. 0。本發(fā)明通過(guò)調(diào)整激素濃度、配比和根菌真菌的共生培養(yǎng)，能有效利用蘭科植物菌 根共生促進(jìn)生長(zhǎng)的特點(diǎn)，縮短蘭科植物組培苗的繁殖周期，成活率達(dá)到了 95%以上。本發(fā)明 采用墨蘭種子無(wú)菌萌發(fā)與菌根真菌共生的菌根化培育技術(shù)，既可繁殖優(yōu)良品種，從種子實(shí) 生苗中選擇優(yōu)良蘭株，又能快速提高墨蘭繁育速度，克服純組培苗生長(zhǎng)緩慢，周期長(zhǎng)，甚至 不開(kāi)花的缺點(diǎn)，對(duì)墨蘭的大面積產(chǎn)業(yè)化擴(kuò)繁具有重要的利用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 選用2003年在云南省西雙版納野生的優(yōu)良單株上采得的墨蘭種子，于 2004年6月份在西南林學(xué)院的溫室大棚內(nèi)進(jìn)行煉苗，該繁殖方法墨蘭種苗成活率達(dá)到了 95%以上，具體的種苗繁殖過(guò)程如下(1)種子萌發(fā)將野外成熟180天的蒴果采回，在4度冰箱種冷藏2周，用流水沖洗 20分鐘取墨蘭未裂開(kāi)的蒴果為外植體。在70 75%的酒精中表面消毒30 50秒，無(wú)菌水 漂洗一次，又用2%的次氯酸鈉消毒20分鐘，用無(wú)菌水沖洗4 5次，再以0. 的升汞溶 液消毒10 15分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗5次。將洗凈的成熟蒴果置于滅菌濾紙上吸干水 分，把消毒的蒴果置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌手術(shù)刀縱向切開(kāi)墨蘭蒴果；再用鑷子取出 墨蘭粉沫狀種子放入預(yù)先準(zhǔn)備好的無(wú)菌小濾紙袋內(nèi)，浸入0. 15 0. 2mol/L的NaOH溶液中 處理8 10分鐘取出，在無(wú)菌水中沖洗4 5次，每次換水前用滅過(guò)菌的干濾紙擠壓濾紙 袋吸干水分；然后把經(jīng)處理的墨蘭種子均勻地播種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn) 入每天光照12 14小時(shí)，光照強(qiáng)度1000 15001UX，溫度25°C。培養(yǎng)160 180天即可
4生長(zhǎng)為原球莖。其培養(yǎng)基的配方為1/2MS+NAA0. 5 1. Omg/L+6-BAO. 5 1. 0mg/L+100ml/ L椰乳+甘露醇lg/L+活性碳0. 5g/L+蔗糖25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為5. O 6. O。(2)原球莖繼代增殖將初代培養(yǎng)的原球莖和芽分別在培養(yǎng)基上繼代增殖培養(yǎng)， 原球莖增殖速度快，增殖效果好，50 60天長(zhǎng)成新芽或原球莖，以后不斷切割原球莖繼代， 即可幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)。其培養(yǎng)基的配方為1/2MS+KT0. 5mg/L+甘露醇lg/L+活性碳0. 5g/L+ 蔗糖25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為5. O 6. O。(3)生根培養(yǎng)將較大的根系不發(fā)達(dá)的苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，植株生長(zhǎng)旺盛， 7周后形成5 7cm的小苗，根系發(fā)達(dá)。其培養(yǎng)基的配方為1/2MS+NAA0. 5mg/L+活性碳0. 5g/ L+蔗糖25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為5. O 6. O。(4)煉苗將7 8厘米高的生根苗在室內(nèi)自然光照條件下開(kāi)瓶蓋過(guò)渡1 1. 5周 后，取出洗凈沾附在小苗根部的培養(yǎng)基備用。(5)苗木菌根化將取出的苗用含有菌根真菌的基質(zhì)包裹種植于穴盤(pán)中，管護(hù)中 保持適度溫度，置于陰涼通風(fēng)處栽培，期間只需葉部噴灑水，有利于新根生長(zhǎng)，3周后移入溫 室中，進(jìn)行正常水、肥、藥管理，成活率可達(dá)95%以上，9. 5月后即可得菌根化種苗。其基質(zhì) 是按重量份分別將1/4份泥炭、1/4份珍珠巖、1/4份干腐質(zhì)土和1/4份紅土中加入拌有菌 液(Rhizoctonia sp. MLX102)的櫟樹(shù)葉三級(jí)菌種少許而得。
權(quán)利要求
一種墨蘭種苗繁殖方法，其種苗獲得主要包括種子萌發(fā)、原球莖繼代增殖和生根培養(yǎng)過(guò)程，其特征在于該繁殖方法在種苗獲得后還進(jìn)行生根苗的煉苗及與菌根真菌的菌根化過(guò)程，具體為煉苗將生根苗在室內(nèi)自然光照條件下開(kāi)瓶蓋過(guò)渡1～1.5周后取出，洗凈沾附在小苗根部的培養(yǎng)基備用；苗木菌根化將取出的小苗用含有菌根真菌的基質(zhì)包裹種植于穴盤(pán)中，在適度溫度下，置于陰涼通風(fēng)處栽培，期間向葉部噴灑水，促進(jìn)新根生長(zhǎng)，3周后移入溫室中進(jìn)行正常水、肥、藥管理，9.5月后即可得菌根化種苗；所述的基質(zhì)是按重量份分別將1/4份泥炭、1/4份珍珠巖、1/4份干腐質(zhì)土和1/4份紅土中加入拌有菌液(Rhizoctonia sp.MLX102)的櫟樹(shù)葉三級(jí)菌種少許而得。
2.如權(quán)利要求1所述的一種墨蘭種苗繁殖方法，其特征在于所述的種子萌發(fā)過(guò)程主要 包括以下步驟a)外植體的選擇選擇墨蘭未裂開(kāi)的蒴果為外植體；b)種子處理將墨蘭蒴果無(wú)菌處理后取出粉沫狀種子無(wú)菌處理；c)種子萌發(fā)將經(jīng)處理的墨蘭種子均勻播種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長(zhǎng)為原球莖； 所使用的培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA0. 5 1. Omg/L+6-BAO. 5 1. 0mg/L+100ml/L椰乳+甘 露醇lg/L+活性碳0. 5g/L+蔗糖25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為5. 0 6. 0。
3.如權(quán)利要求1所述的一利墨蘭種苗繁殖方法，其特征在于所述的原球莖繼代增 殖過(guò)程是將初代培養(yǎng)的原球莖和芽分別在培養(yǎng)基上繼代增殖培養(yǎng)50 60天，長(zhǎng)成新 芽或原球莖，以后不斷切割原球莖繼代，即可幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)；所使用的培養(yǎng)基配方為 1/2MS+KT0. 5mg/L+甘露醇lg/L+活性碳0. 5g/L+蔗糖25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為 5. 0 6. O0
4.如權(quán)利要求1所述的一種墨蘭種苗繁殖方法，其特征在于所述的生根培養(yǎng)過(guò)程是將 較大的根系不發(fā)達(dá)的苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使生根率達(dá)95 %以上，植株生長(zhǎng)旺盛，7周 后形成5 7cm的小苗；所使用的培養(yǎng)基配方為dAMS+NAAO. 5mg/L+活性碳0. 5g/L+蔗糖 25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為5. 0 6. 0。
全文摘要
一種墨蘭種苗繁殖方法，屬于一種蘭花育苗繁殖技術(shù)，尤其是一種組織培養(yǎng)與菌根真菌共生培養(yǎng)育苗的繁殖技術(shù)。本發(fā)明的一種墨蘭種苗繁殖方法，其種苗獲得主要包括種子萌發(fā)、原球莖繼代增殖和生根培養(yǎng)過(guò)程，其特征在于該繁殖方法在種苗獲得后還進(jìn)行生根苗的煉苗及與菌根真菌的菌根化過(guò)程。本發(fā)明采用墨蘭種子無(wú)菌萌發(fā)與菌根真菌共生的菌根化培育技術(shù)，既可繁殖優(yōu)良品種，從種子實(shí)生苗中選擇優(yōu)良蘭株，又能快速提高墨蘭繁育速度，克服純組培苗生長(zhǎng)緩慢，周期長(zhǎng)，甚至不開(kāi)花的缺點(diǎn)，對(duì)墨蘭的大面積產(chǎn)業(yè)化擴(kuò)繁具有重要的利用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01H17/00GK101983554SQ201010127760
公開(kāi)日2011年3月9日 申請(qǐng)日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者丁暉, 伍建榕, 劉麗, 張東華, 洪英娣, 王錦, 胡雋, 馬煥成 申請(qǐng)人:西南林學(xué)院