專利名稱：：檢測(cè)環(huán)境化學(xué)物的雄性生殖毒性的制劑及模型建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種用于檢測(cè)環(huán)境化學(xué)物的雄性生殖毒性的制劑和模型建立方法。
背景技術(shù)：
：隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)，特別是現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，人類接觸外源化學(xué)物如醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品添加劑以及環(huán)境中存在的各種污染物日益增多，其中許多物質(zhì)反復(fù)接觸后可損傷生殖細(xì)胞，引起生殖毒性。在雄性，具體表現(xiàn)為睪丸各級(jí)生精細(xì)胞受損，繼而導(dǎo)致精液質(zhì)量下降、精子DNA損傷等，由于精子DNA損傷不僅是引起不育的重要原因，也是輔助生育治療成功率下降的重要因素，而且，攜有DNA損傷的幸存精子可能逃避體內(nèi)精子選擇機(jī)制而將遺傳缺陷傳遞給子代，從而顯著增加先天性缺陷甚至兒童期腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，因此研發(fā)一種檢測(cè)方法和手段，能夠快速、準(zhǔn)確評(píng)估化學(xué)物的雄性生殖毒性、特別是對(duì)精子DNA的潛在危害，已經(jīng)成為環(huán)境學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥理和毒理學(xué)領(lǐng)域迫切需要解決的問題，同時(shí)也可為優(yōu)生優(yōu)育的提供保證。根據(jù)目前國(guó)際上檢測(cè)外源化學(xué)物的雄性生殖毒性的方法，我國(guó)2006年11月頒布的《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中指出雄性生殖毒性的檢測(cè)主要包括以下策略(1)雄性動(dòng)物(大、小鼠或家兔)交配前染毒或給藥4-10周，交配成功后處死，觀察睪丸組織病理結(jié)構(gòu)，主要觀察終點(diǎn)為生殖器官的退變或壞死、精子計(jì)數(shù)、精子活力或形態(tài)學(xué)檢測(cè)、交配行為、內(nèi)分泌功能或總體生育力改變；(2)染毒交配后，觀察胎仔數(shù)目和質(zhì)量，評(píng)價(jià)父代染毒對(duì)子代發(fā)育的影響。然而，以上策略耗時(shí)很長(zhǎng)(一月到數(shù)月)且觀察終點(diǎn)比較粗略，不能反映精子遺傳物質(zhì)的隱性損傷。如果能夠有一種替代方法，可以實(shí)現(xiàn)既靈敏又快速的反映化學(xué)物造成的雄性生殖危害，將有助于我們更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)化學(xué)物的安全性，也有利于縮短藥品的臨床前生殖毒性實(shí)驗(yàn)周期。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)空白，提供一種用于檢測(cè)環(huán)境化學(xué)物的雄性生殖毒性的制劑和模型建立的方法，該制劑含有特異性的抑制小鼠oggl基因表達(dá)的雙鏈siRNA，將其應(yīng)用于小鼠睪丸微環(huán)境敲減基因表達(dá)后，能建立快速靈敏檢測(cè)環(huán)境化合物對(duì)雄性生殖毒性的模型。技術(shù)方案有助于檢測(cè)環(huán)境化合物雄性生殖毒性的制劑，該試劑含有以下三段雙鏈siRNA雙鏈1由SEQIDNo1和SEQIDNo2組成；雙鏈2由SEQIDNo3和SEQIDNo4組成；雙鏈3由SEQIDNo5和SEQIDNo6組成。檢測(cè)環(huán)境化合物雄性生殖毒性的模型建立方法，步驟為選擇剛斷乳的新生雄性ICR小鼠，2%wt戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，局部酒精消毒，備皮，恥骨聯(lián)合上區(qū)手術(shù)，暴露小鼠睪丸；顯微注射Wt臺(tái)盼藍(lán)與上述檢測(cè)試劑等體積混合稀釋，檢測(cè)試劑的劑量范圍30nmol300nmol，顯微注射至精曲小管充盈，一側(cè)睪丸注射混合稀釋后的檢測(cè)試劑，另一側(cè)睪丸注射對(duì)照，術(shù)后縫合獲得檢測(cè)環(huán)境化合物雄性生殖毒性的模型。檢測(cè)試劑使用的劑量?jī)?yōu)選30nmol。原理各種有害環(huán)境化學(xué)物作用于精子，會(huì)產(chǎn)生損傷效應(yīng)，包括精子DNA的損傷。而機(jī)體的損傷修復(fù)機(jī)制可以對(duì)抗損傷、保護(hù)遺傳信息穩(wěn)定性。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷修復(fù)基因oggl可保護(hù)生殖細(xì)胞免受外源化學(xué)物所致?lián)p傷。利用本發(fā)明所保護(hù)的雙鏈siRNA制劑特異性敲減oggl基因在小鼠精母細(xì)胞的表達(dá)，更能靈敏的反映外源化學(xué)物的損傷效應(yīng)(圖1)。進(jìn)而在小鼠睪丸微環(huán)境敲減oggl，可增加雄性生殖系統(tǒng)對(duì)受試化學(xué)物所致?lián)p傷的易感性。由此，建立小鼠睪丸微環(huán)境基因敲減模型結(jié)合染毒方法評(píng)價(jià)外源化合物的生殖毒性效應(yīng)，較之離體實(shí)驗(yàn)更為真實(shí)客觀，較之轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)和普通染毒試驗(yàn)更為快捷有效，該技術(shù)對(duì)于一大類具有雄性生殖毒性的環(huán)境化學(xué)物的檢測(cè)和安全評(píng)估有一定推廣意義。有益效果本發(fā)明提供的用于檢測(cè)環(huán)境化學(xué)物對(duì)雄性生殖毒性的試劑和模型建立的方法，可以實(shí)現(xiàn)既靈敏又快速的反映化學(xué)物造成的雄性生殖危害，將有助于我們更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)化學(xué)物的安全性，也有利于縮短藥品的臨床前生殖毒性實(shí)驗(yàn)周期。四圖1，實(shí)施例1中，小鼠精母細(xì)胞oggl-RNA干擾后原位雜交驗(yàn)證敲減效率及外源化學(xué)物氰戊菊酯農(nóng)藥(Fen)25uM染毒后彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷結(jié)果。A，C為正常對(duì)照，B，D為siRNA雙鏈干擾組。箭頭顯示oggl典型的核定位表達(dá)被敲減。表明，oggl在小鼠精母細(xì)胞中有修復(fù)DNA損傷、維持遺傳穩(wěn)定的作用；圖2，實(shí)施例1中，小鼠睪丸微環(huán)境敲減oggl模型建立成功。術(shù)后2周睪丸冰凍切片原位雜交結(jié)果顯示oggl敲減成功，且不影響自身的生精過程，適合作為染毒的模型；其中=Oggl敲減A、C，對(duì)照序列:B、D，顯微注射:A、B，原位雜交C、D。圖3，實(shí)施例2中，不同濃度白消安處理小鼠4周后，睪丸OgglsiRNA敲減組及對(duì)照組的精液參數(shù)、精子DNA損傷變化情況的柱狀示意圖。*與O周(染毒前)比較，P<0.05;#與O周(染毒前)比較，P<0.01。圖4，實(shí)施例2中，睪丸病理HE染色。相同染毒劑量(白消安5mg/kg)染毒4周，oggl敲減組(圖3A，左側(cè)睪丸)和對(duì)照組(圖3B，右側(cè)睪丸)相比，敲減組可以更靈敏的反映外源化合物的睪丸的損傷效應(yīng)；圖5，實(shí)施例2中，睪丸病理透射電鏡。相同染毒劑量(白消安5mg/kg)染毒4周，oggl敲減組(圖4A，左側(cè)睪丸)和對(duì)照組(圖4B，右側(cè)睪丸)相比，敲減組可以更靈敏的反映處源化合物的睪丸的損傷效應(yīng)；圖6，實(shí)施例3中，小鼠白消安染毒(5mg/kg)0、2、4周時(shí)間，oggl敲減組及對(duì)照組精液參數(shù)、精子DNA損傷變化情況的柱狀示意圖。*與O周(染毒前)比較，？<0.05;#與O周(染毒前)比較，P<0.01。圖7，實(shí)施例4中，小鼠睪丸微環(huán)境oggl基因敲減模型經(jīng)受試農(nóng)藥染毒2周后精子DNA損傷情況的柱狀示意圖。*與溶劑對(duì)照組比較，P<0.05；#與溶劑對(duì)照比較，P<0.01。圖8，實(shí)施例4中，小鼠睪丸oggl敲減模型，白消安lmg/kg(A)，受試農(nóng)藥5mg/kg(B)，受試農(nóng)藥10mg/kg(C)，受試農(nóng)藥20mg/kg(D)，染毒2周。結(jié)果顯示睪丸oggl敲減的動(dòng)物模型可以快速、靈敏的反映外源化學(xué)物致小鼠睪丸損傷的生殖毒性。五具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述實(shí)施例1(1)靶向oggl基因的特定雙鏈SiRNA的干擾序列的設(shè)計(jì)、合成。①設(shè)計(jì)并合成靶向oggl基因的特定的SiRNA干擾序列。siRNA-oggl序列設(shè)計(jì)的雙鏈序列如下所示，對(duì)照組為無關(guān)序列siRNA雙鏈。上述siRNA干擾片段均設(shè)計(jì)成雙鏈組合并經(jīng)化學(xué)修飾(主要是末端經(jīng)過TT修飾)，可穩(wěn)定至少3周不被降解。②靶向oggl的siRNA雙鏈序列(很可能是下列中的全部或者部分)候選雙鏈1(RNA)-UUGGGAAGCCAUGAUAA⑶GACAUC(RNA)-GAU⑶CACUUAUCAUGGCUUCCCAA候選雙鏈2(RNA)-AGCUGAAUGAGUCGAGGUCCAAAGG(RNA)-CCUUUGGACCUCGACUCAUUCAGCU候選雙鏈3:(RNA)-AAACCAAGUCCAGACGCAGCUCAGA(RNA)-UCUGAGCUGCGUCUGGACUUGGUUU③體外細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)靶向oggl的siRNA雙鏈的敲減效率及生物學(xué)功能，顯示特異性敲減DNA修復(fù)基因oggl在小鼠精母細(xì)胞的表達(dá)，精母細(xì)胞更易受損傷、更能靈敏的反映外源化學(xué)物的損傷效應(yīng)(圖1)。(2)建立小鼠睪丸微環(huán)境oggl基因敲減模型。①動(dòng)物選擇處理選擇剛斷乳的新生雄性ICR小鼠(此發(fā)育階段便于觀察精子生成第一個(gè)高峰)6只/組，2%wt戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，局部酒精消毒，備皮，恥骨聯(lián)合上區(qū)雙側(cè)腹股溝處手術(shù)，切口0.5cm，暴露小鼠左、右雙側(cè)睪丸。②顯微注射wt臺(tái)盼藍(lán)與干擾siRNA雙鏈(劑量范圍30nmOl300nmol，優(yōu)選是30nmol)等體積混合稀釋后，顯微注射至精曲小管充盈(圖2)，左側(cè)睪丸注射oggl干擾組，右側(cè)睪丸注射對(duì)照，每組注射2uL?？p合手術(shù)區(qū)皮膚并注意小鼠保溫(麻醉后基礎(chǔ)代謝率降低，可能會(huì)導(dǎo)致新生鼠死亡)。③證實(shí)oggl睪丸敲減的動(dòng)物模型成功建立小鼠睪丸冰凍切片原位雜交、熒光定量PCR均驗(yàn)證oggl基因敲減2周后仍有效(圖2)，oggl表達(dá)被下調(diào)，同時(shí)睪丸組織觀察精子數(shù)目及睪丸形態(tài)、TUNEL試劑盒檢測(cè)精子DNA完整性。上述結(jié)果顯示，靶向oggl的siRNA敲減有效，睪丸微環(huán)境oggl低表達(dá)的動(dòng)物模型建立，且該操作本身不會(huì)引起精子DNA的異常。(3)取上述已建立的動(dòng)物模型，運(yùn)用待測(cè)試化學(xué)物(如藥物、化學(xué)品、農(nóng)藥等環(huán)境毒物)經(jīng)口染毒2周，評(píng)價(jià)該化學(xué)物生殖毒性，如睪丸形態(tài)、精子數(shù)目、特別是精子DNA損傷(TUNEL試劑盒檢測(cè))等，以驗(yàn)證該動(dòng)物模型用于生殖毒性評(píng)價(jià)的靈敏度和快速性。具體內(nèi)容見下述具體實(shí)施案例。實(shí)施例2取本發(fā)明所涉及的動(dòng)物模型，不同濃度的陽(yáng)性藥物(白消安lmg/kg，5mg/kg)經(jīng)口染毒4周。精子計(jì)數(shù)及精子DNA損傷(TUNEL值)結(jié)果顯示(表1，圖3)在較低濃度劑量濃度染毒時(shí)(lmg/kg)，與普通染毒(即右側(cè)對(duì)照睪丸)比較，左側(cè)oggl敲減睪丸更易檢出DNA損傷效應(yīng)。睪丸病理HE染色(圖4)及透射電鏡(圖5)的結(jié)果也同樣顯示相同染毒劑量下(白消安lmg/kg)，oggl敲減組(左睪丸)和對(duì)照組(右睪丸)相比，敲減組可以更靈敏的反映外源化合物的睪丸損傷效應(yīng)。表1不同濃度白消安處理小鼠4周后，ogglSiRNA干擾組及正常對(duì)照組的精液參數(shù)及精子DNA損傷變化表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*與溶劑對(duì)照組比較，P<0.05；#與溶劑對(duì)照組比較，P<0.01實(shí)施例3取本發(fā)明所涉及的動(dòng)物模型(左側(cè)睪丸oggl敲減，右側(cè)睪丸對(duì)照序列)，同濃度的白消安(5mg/kg)經(jīng)口染毒，分別于0、2、4周時(shí)觀察生殖毒性效應(yīng)(主要為精子數(shù)目、DNA損傷)。結(jié)果顯示較之傳統(tǒng)方法，oggl敲減組在更短時(shí)間內(nèi)，即可檢測(cè)出DNA損傷效應(yīng)，(表2，圖6)。表2小鼠白消安染毒(5mg/kg)不同時(shí)間段，干擾組及對(duì)照組的精子數(shù)及DNA損傷的變化表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*與O周(染毒前)比較，P<0.05與O周(染毒前)比較，P<0.01實(shí)施例4取本發(fā)明所涉及的動(dòng)物模型，分組溶劑對(duì)照組(陰性組)/陽(yáng)性組(白消安)/受試物(某種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，其主要成分是氰戊菊酯和瞇菊酯)經(jīng)口染毒。具體方案選擇上述oggl敲減小鼠25只，每組5只，受試農(nóng)藥設(shè)3個(gè)劑量組(分別是5mg/kg，10mg/kg,20mg/kg)。siRNA片段顯微注射(左側(cè)睪丸干擾組，右側(cè)睪丸對(duì)照組)。次日開始各組別染毒，灌胃每天一次，持續(xù)2周。處死小鼠，取睪丸組織，綜合評(píng)價(jià)各項(xiàng)效應(yīng)指標(biāo)，主要關(guān)注精子DNA損傷效應(yīng)及睪丸病理變化(表3，圖7、圖8)。結(jié)果提示oggl敲減的動(dòng)物模型可以快速、靈敏的檢測(cè)出外源化學(xué)物致小鼠精子DNA損傷的生殖毒性。表3小鼠睪丸微環(huán)境oggl基因敲減模型小鼠受試物染毒2周后精子DNA損傷情況表。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*與溶劑對(duì)照組比較，P<0.05；#與溶劑對(duì)照比較，P<0.0權(quán)利要求檢測(cè)環(huán)境化學(xué)物的雄性生殖毒性的制劑，其特征在于該試劑含有以下三段雙鏈siRNA雙鏈1由SEQIDNo1和SEQIDNo2組成；雙鏈2由SEQIDNo3和SEQIDNo4組成；雙鏈3由SEQIDNo5和SEQIDNo6組成。2.檢測(cè)環(huán)境化合物雄性生殖毒性的模型建立方法，其特征在于步驟為a.選擇剛斷乳的新生雄性ICR小鼠，2%wt戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，局部酒精消毒，備皮，恥骨聯(lián)合上區(qū)手術(shù)，暴露小鼠睪丸；b.顯微注射wt臺(tái)盼藍(lán)與上述檢測(cè)試劑等體積混合稀釋，檢測(cè)試劑的劑量范圍30nmol300nmol，顯微注射至精曲小管充盈，一側(cè)睪丸注射混合稀釋后的檢測(cè)試劑，另一側(cè)睪丸注射對(duì)照，術(shù)后縫合獲得檢測(cè)環(huán)境化合物雄性生殖毒性的模型。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)環(huán)境化合物雄性生殖毒性的模型建立方法，其特征在于檢測(cè)試劑使用的劑量為30nmol。全文摘要本發(fā)明涉及一種雙鏈siRNA及其應(yīng)用，特別是涉及一種DNA損傷修復(fù)ogg1基因的雙鏈siRNA，將其應(yīng)用于小鼠睪丸微環(huán)境敲減基因表達(dá)，可提高雄性生殖系統(tǒng)對(duì)環(huán)境化學(xué)物的損傷作用的敏感性，從而提供一種快速、靈敏的檢測(cè)環(huán)境化學(xué)物的雄性生殖毒性的方法。本發(fā)明作為環(huán)境化學(xué)物生殖毒性的檢測(cè)的新方法，可以實(shí)現(xiàn)既靈敏又快速的反映化學(xué)物造成的雄性生殖危害，將有助于我們更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)化學(xué)物的安全性，也有利于縮短藥品的臨床前生殖毒性實(shí)驗(yàn)周期。文檔編號(hào)A01K67/027GK101805751SQ201010129228公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2010年3月19日優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日發(fā)明者吉貴祥,王心如,趙鵬,顧愛華,龍燕申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)