專利名稱：一種鼠李糖脂的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物表面活性劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鼠李糖脂的制備方法以及其 作為生物農(nóng)藥、助劑、殺蟲劑、含油污泥脫水劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物表面活性劑是一類由微生物、動物或植物產(chǎn)生在性能上與化學(xué)合成的表面 活性劑非常相似，即分子由極性親水基團(tuán)和非極性親油基團(tuán)兩部分組成，可以在相界面上 形成分子層，降低界面能量的物質(zhì)，具有好的表面活性作用，如乳化、分散、潤濕和滲透等功 能。與化學(xué)合成表面活性劑相比，生物表面活性劑由于化學(xué)基團(tuán)復(fù)雜且數(shù)目也多，使其表 面活性更強，乳化能力也更強；本身無毒，使用量更少，易被微生物降解，具有很好的環(huán)境友 好特性；還具有抗菌，抗病毒等藥理作用，輔助和提高產(chǎn)品的總體質(zhì)量。而目前普遍使用的 化學(xué)表面活性劑因難被土壤微生物降解而破壞生態(tài)系統(tǒng)和污染地表地下水等，且本身(如 Toximul系列)往往有毒。鼠李糖脂作為一種生物表面活性劑，具有較強的表面和界面活性，低毒、可生物降 解性，被廣泛用于石油開采、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥化工、食品以及農(nóng)業(yè)上。這類生物表面活性劑基 本是由碳水化合物和長鏈脂肪酸或羥基脂肪酸以共價鍵形式結(jié)合而成，以糖為親水集團(tuán)， 以脂肪酸為憎水基團(tuán)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)一般都是由極性基和非極性基構(gòu)成。極性基易溶于水，具 有親水性質(zhì)，非極性基易溶于水。其具體作用如下(1)乳化類似于雙甘油月桂酸鈉、蓖麻 油聚氧乙基醚等表面活性劑，可促使不相溶的兩相液體形成不透明或半透明乳濁液，當(dāng)表 面活性劑濃度大于臨界膠束濃度(CMC)時，還能形成中間攜帶有機藥物的膠束，增加有機 物的表觀溶解度。(2)分散阻止分散體系中固體或液體粒子的聚并和保持其處于分散的 穩(wěn)定狀態(tài)；(3)潤濕由于作物葉表覆蓋有不同厚度的蠟質(zhì)層，使其成為疏水低能的表面， 不利于液體對其表面的潤濕，進(jìn)而影響?zhàn)B分的吸收；(4)跨膜滲透由于具有表面活性和生 物相容的雙重作用，可以增加動植物細(xì)胞膜的能力。雖然鼠李糖脂潛在的廣泛用途，但其組成成分多樣且隨具體的培養(yǎng)條件變化，發(fā) 酵過程中易產(chǎn)生泡沫，生產(chǎn)成本也高，目前實際進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的報道較 少。鼠李糖脂的發(fā)酵一般采用各類植物油或正己烷作為碳源，發(fā)酵周期較長，也因發(fā)酵原料 成本較高，制約了鼠李糖脂的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。利用各種廢棄油脂發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂，不 僅節(jié)約了生產(chǎn)成本，而且保護(hù)了環(huán)境，達(dá)到“以廢治廢”的目的。真菌感染在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中是最常見的病害之一。近年來，番茄晚疫病、辣椒疫霉病 和葡萄霜霉病等真菌病蟲害的發(fā)生流行面積和防治難度不斷加大，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p 失。目前，對感染農(nóng)作物的植物病害真菌，常規(guī)的化學(xué)農(nóng)藥防治效果不好，且使用劑量逐年 上升，常常造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)，且具有嚴(yán)重的生物和環(huán)境毒性。因此開發(fā)具有高效、安全和 環(huán)保型的表面活性劑類抑菌劑具有十分重要的意義。鼠李糖脂作為一種環(huán)境友好的生物表 面活性劑，可在早期破壞真菌的游動孢子膜，有效阻斷各種真菌病害的發(fā)展。基于可持續(xù)性發(fā)展新型農(nóng)業(yè)的目的，隨著日益增加的對農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展的重視，要求使用高效、低毒和環(huán)境友好的水劑型農(nóng)藥，和發(fā)展葉面施肥(即現(xiàn)代集約化農(nóng)業(yè)中 一項有效的營養(yǎng)調(diào)控技術(shù))及開發(fā)安全且被小腸吸收利用的飼料。尤其是農(nóng)藥，占農(nóng)藥總 量50%左右的乳油每年要消耗大約25萬噸的工業(yè)級二甲苯等有機溶劑對多種組織器官產(chǎn) 生強烈的毒性作用，破壞造血功能，給水體和大氣帶來嚴(yán)重污染，因此，農(nóng)藥劑型正朝著以 水為介質(zhì)的微乳劑、水乳劑和懸乳劑等劑型發(fā)展，力求發(fā)展高效、安全、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境相容的 新劑型，這將是21世紀(jì)農(nóng)藥劑型發(fā)展的主流。在這些新型農(nóng)藥、肥料及飼料新劑型中，共同 存在的助劑是表面活性劑，其作用主要是分散、滲透、潤濕和促吸收等。蚜蟲對于農(nóng)作物危害很大，蟑螂也經(jīng)常出沒于家庭居室。常規(guī)的殺昆蟲劑多數(shù)毒 性較大，經(jīng)常使用不利于人體健康和環(huán)境保護(hù)，鼠李糖脂作為一種生物殺蟲劑，殺蟲效果顯 著，國內(nèi)外還未見將鼠李糖脂用作生物殺蟲劑的相關(guān)報道。另外，石化企業(yè)含油污泥中有機物復(fù)雜且成分各異，氣味難聞，易污染環(huán)境，易和 泥沙等多種雜質(zhì)形成懸浮乳濁液，粘度很大，難以沉降，造成處理工作量極大。現(xiàn)有的廢水 和污泥處理方法無法有效處理含油污泥，使之環(huán)境造成嚴(yán)重污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鼠李糖脂的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種鼠李糖脂的制備方法，采用廢棄油脂為碳源和發(fā)酵過程中采用乙醇進(jìn)行消 泡，步驟如下(1)菌種培養(yǎng)將銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa ZJU-211菌種接種到搖 瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度為32-38°C，搖床轉(zhuǎn)速120-200rpm，培養(yǎng)24_48h得到搖瓶菌種。(2)發(fā)酵將搖瓶菌種接種到發(fā)酵罐中，利用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種體積分率為 3_10%，發(fā)酵過程溫度控制在32-38°C，通氣量為0. 2-1. 5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速200_500rpm，發(fā)酵 周期3-5天。在發(fā)酵的中、后期，溢出泡沫回收器的泡沫采用乙醇消泡后返回發(fā)酵罐。發(fā)酵 結(jié)束后得含菌體的發(fā)酵液。(3)超濾除菌體發(fā)酵液通過中空纖維膜過濾去除菌體，得到去菌體發(fā)酵液，其含 有鼠李糖脂35-50g/L。(4)濃縮分離在去菌體發(fā)酵液中加入酸，調(diào)節(jié)溶液pH至3. 0 4. 0，靜置1 12h，傾去上清液，收集底部酸沉降物，得到含糖脂70 90%的濃縮鼠李糖脂產(chǎn)品。所述步驟(2)中，所述搖瓶種子培養(yǎng)基組成如下廢棄油脂，30 40g/L ；NaN03, 2 4g/L ；NaCl，0. 5 1. 5g/L ；KC1，0. 5 1. 5g/L ；CaCl2 2H20，0. 05 0. 2g/L ；KH2P04, 2 4 ；Na2HP04 12H20，2 4g/L ；MgS04,0. 1 0. 3g/L ；微量元素，1. 5 2. 5mL/L，余量為 水。所述微量元素組成如下:FeCl3 6H200. 01 0. 08g/L，ZnS04 7H20 0. 1 0. 75g/L， CuS04 5H20 0. 01 0. 075g/L, MnS04 H20 0. 1 0. 75g/L, H3B03，0. 01 0. 15g/L，余量為 水。所述步驟(3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下廢棄油脂，30 100g/L :NaN03，4 8g/L ；NaCl，0. 5 1. 5g/L ；KC1，0. 5 1. 5g/L ；CaCl2 2H20，0. 05 0. 2g/L ；KH2P04，2 4g/L ；Na2HP04 12H20，2 4g/L ；MgS04,0. 1 0. 3g/L ；微量元素，1. 5 2. 5mL/L，余量為水。所述微量元素組成如下=FeCl3 · 6Η200· Ol 0. 08g/L，ZnSO4 · 7Η20 0· 1 0. 75g/L， CuSO4 · 5H20 0. 01 0. 075g/L, MnSO4 · H2O 0· 1 0. 75g/L, H3BO3 0. 01 0. 15g/L，余量為 水。一種鼠李糖脂發(fā)酵液作為生物農(nóng)藥的應(yīng)用。
進(jìn)一步地，所述鼠李糖脂作為抑制或殺滅植物真菌病害的生物農(nóng)藥。一種鼠李糖脂作為農(nóng)藥助劑的應(yīng)用，所述農(nóng)藥助劑兼有乳化、分散和表面潤濕作用。一種鼠李糖脂作為鼠李糖脂作為肥料助劑的應(yīng)用，所述肥料助劑具有表面潤濕作 用，促進(jìn)肥料被植物表面吸收。一種鼠李糖脂作為飼料助劑的應(yīng)用，所述飼料助劑具有表面活性作用，促飼料營 養(yǎng)物易被小腸吸收。一種鼠李糖脂作為生物殺蟲劑的應(yīng)用，所述蟲為蟑螂、蚜蟲等。一種鼠李糖脂作為污泥脫水劑的應(yīng)用。本發(fā)明具有的有益效果是1、本發(fā)明以油脂加工下腳料或餐飲廢油等廢棄油脂為碳源，利用銅綠假單胞菌發(fā) 酵生產(chǎn)鼠李糖脂，變廢為寶，保護(hù)了環(huán)境，降低了鼠李糖脂的生產(chǎn)成本；結(jié)合乙醇的消泡和 同時易被作為碳源利用的雙重作用，產(chǎn)量可達(dá)35-50g/L，使得成本比傳統(tǒng)方法低25-40%
左右ο2、本發(fā)明利用含20_500mg/L鼠李糖脂溶液處理植物中常見真菌孢子，使菌絲體 生長的抑制率和孢子萌發(fā)率達(dá)40-90%，有效抑制植物真菌病害。鼠李糖脂作為生物農(nóng)藥， 減輕了化學(xué)農(nóng)藥對于環(huán)境的危害。3、本發(fā)明利用去菌體的鼠李糖脂作為生物殺蟲劑，大大降低了常規(guī)化學(xué)殺蟲劑對 于人體和環(huán)境的危害，含20-500mg/L鼠李糖脂溶液對于蟑螂和蚜蟲等昆蟲的殺蟲效果明
Mo4、將鼠李糖脂作為農(nóng)藥、肥料和飼料助劑，其表面活性比化學(xué)表面活性劑更好且 具有多種表面活性劑合用才有的綜合效果，并具有環(huán)境和生物友好特性。5、鼠李糖脂用于含油污泥脫水，大幅度降低污泥處理量，效果顯著。本發(fā)明涉及的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa ZJU-211菌種已在中國專 利局指定的保藏單位“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”保藏，保藏日期為2009年10月23日，保 藏編號為CCTCC No :M209237。


圖1為鼠李糖脂對疫霉的菌落生長抑制效果圖；圖2為鼠李糖脂對疫霉的菌絲體生長抑制效果圖；圖3為鼠李糖脂對灰霉的菌落生長抑制效果圖；圖4為鼠李糖脂對灰霉的菌絲體生長抑制效果圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種以鼠李糖脂為主要成分的去菌體發(fā)酵液或酸沉濃縮液，其中，去菌體發(fā)酵液中含鼠李糖脂35 50g/L，余量為鹽分、海藻酸鈉、蛋白和大量的水；濃縮鼠 李糖脂含700 900g/L鼠李糖脂，余量為少量的鹽分、海藻酸鈉、蛋白和水。該鼠李糖脂的制備方法，具體步驟如下1.菌種培養(yǎng)將Pseudomonas aeruginosa ZJU-211菌種接種到搖瓶種子培養(yǎng)基 培養(yǎng)，溫度為32 38°C，搖床轉(zhuǎn)速120 200rpm，培養(yǎng)24 48h得到搖瓶菌種。所述搖瓶種子培養(yǎng)基組成(g/L)廢棄油脂，30 40 :NaN03，2 4 ；NaCl, 0. 5 1. 5 ；KC1，0. 5 1. 5 ；CaCl2 ·2Η20，0· 05 0. 2 ；KH2PO4, 2 4 ；Na2HPO4 · 12Η20，2 4 ；MgSO4, 0. 1 0. 3 ；微量元素，1. 5 2. 5mL/L，余量為水。微量元素組成(g/L)=FeCl3 · 6Η20 0· 01 0· 08，ZnSO4 · 7Η20 0· 1 0· 75， CuSO4 · 5H20 0. 01 0. 075，MnSO4 · H2O 0. 1 0. 75，H3BO3,0. 01 0. 15，余量為水。2.發(fā)酵將搖瓶菌種接種到IOL或其整數(shù)倍的發(fā)酵罐中，利用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，接 種量3 10% (v/v)，發(fā)酵過程溫度控制在32 38°C，通氣量為0. 2 1.5VVm，攪拌轉(zhuǎn)速 200 500rpm，發(fā)酵周期3 5天。發(fā)酵裝置主體為發(fā)酵罐，由于表面活性劑中期以后發(fā)酵 過程中產(chǎn)生大量的泡沫，發(fā)酵罐(反應(yīng)器)還需連接一個泡沫回收器。一般，在發(fā)酵過程的 中后期(2 5天)，溢出發(fā)酵罐的泡沫收集在泡沫回收器中，當(dāng)泡沫又溢到回收器頂部而接 觸到泡沫感應(yīng)噴霧裝置時，由泡沫感應(yīng)產(chǎn)生的電信號隨即打開電動乙醇噴霧器，噴出的體 積濃度為75% 99. 5%的乙醇霧沫迅即消除泡沫，沉降下來的發(fā)酵液通過蠕動泵被循環(huán) 回發(fā)酵罐。每次乙醇體積加量不會超過泡沫體積的1 %，乙醇隨沉降發(fā)酵液返回發(fā)酵罐中并 可被微生物作為底物利用。發(fā)酵終點時，得到含鼠李糖脂35 50g/L的帶菌體發(fā)酵液。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)廢棄油脂，30 100 =NaNO3,4 ~ 8 ；NaCl, 0. 5 1. 5 ； KCl，0.5 1.5 ；CaCl2 ·2Η20，0· 05 0. 2 ；KH2PO4, 2 — 4 ；Na2HPO4 · 12Η20，2 4 ；MgSO4,0. 1 0. 3 ；微量元素，1. 5 2. 5mL/L，余量為水。組成(g/L)=FeCl3 · 6Η20 0· 01 0· 08，ZnSO4 · 7Η20 0· 1 0· 75，CuSO4 · 5H20 0. 01 0. 075，MnSO4 · H2O 0. 1 0. 75，H3BO3 0. 01 0. 15，余量為水。3.膜分離除菌體步驟2得到的含菌體發(fā)酵液通過中空纖維膜過濾去除菌體，得 到去菌體發(fā)酵液，其含鼠李糖脂35-50g/L。含菌體發(fā)酵液通過截留分子量30kDa以上的超 濾膜到0. 22微米下的微濾膜去除菌體，膜材料為聚砜、丙烯腈、尼龍、聚丙烯、醋酸纖維或 無機類材料。4.酸沉濃縮糖脂在步驟3得到的去菌體發(fā)酵液中加入酸(如鹽酸或硫酸)，調(diào) 節(jié)溶液pH至3. 0 4. 0，靜置1 12h，傾去上清液，收集底部酸沉降物，得到含糖脂70 90%的濃縮鼠李糖脂產(chǎn)品。下面介紹幾個實驗過程1、菌落生長抑制實驗將不同稀釋度的鼠李糖脂發(fā)酵液與馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)混合均勻后，在其中央接入培養(yǎng)5天的番茄疫霉/赤霉/灰霉菌塊，25-28°C，恒定濕 度，黑暗培養(yǎng)，2天后測定各組菌落半徑，計算抑制率。所述馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)組成 (g/L)馬鈴薯，200 ；蔗糖，20 ；瓊脂，17。2、液體培養(yǎng)抑菌實驗將不同稀釋度的鼠李糖脂發(fā)酵液與馬鈴薯培養(yǎng)液(PDB)混 合均勻后，接入一定濃度的真菌孢子(番茄疫霉/赤霉/灰霉)懸浮液，25-28°C，搖床培養(yǎng)， 轉(zhuǎn)速120rpm，2天后測定各組菌絲體增重。所述馬鈴薯培養(yǎng)液(PDB)組成(g/L)馬鈴薯，200 ；蔗糖，20。3、番茄植株體內(nèi)實驗選取健康的生長30天的番茄苗，噴灑不同稀釋度的鼠李糖脂發(fā)酵液后接種疫霉孢子懸浮液，10天后，觀察各組抑菌效果。4、農(nóng)藥評價方法(以水懸浮劑為例)分散性的測定于25mL量筒中，裝入249mL水，用注射器取ImL待測懸浮劑，從距 量筒水面5cm處滴入水中，觀察其分散狀況。按其分散狀況的好壞分為優(yōu)、良、劣三級。熱貯穩(wěn)定性將待測懸浮劑每只安瓿瓶分裝10g，密封后放入恒溫(54士2) °C的烘 箱中，靜止熱貯30天后取出，分別檢測記錄外觀、流動性、分散性、粒徑、有效含量、懸浮率 等各項指標(biāo)有無變化。然后判斷是否合格。冷貯穩(wěn)定性將待測懸浮劑每只安瓿瓶分裝10g，密封后在_25°C低溫下冷貯24h 后取出，取出觀察結(jié)凍情況。然后置于室溫條件下靜止融化，并分別檢測記錄外觀、流動性、 分散性、粒徑、有效含量、懸浮率等各項指標(biāo)有無變化。然后判斷是否合格。下面結(jié)合附圖和具體實施例詳述本發(fā)明具體內(nèi)容及其所帶來的顯著效果。實施例1 去菌體鼠李糖脂的制備1、菌種發(fā)酵菌種為銅綠假單胞菌 ZJU-211 (Pseudomonas aeruginosaZJU-211)2、將菌種接種于種子培養(yǎng)基，溫度為35°C，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)48h得到搖瓶菌 種。種子培養(yǎng)基組成如下(g/L)麥當(dāng)勞廢棄油月旨，30=NaNO3, 2 ；NaCl, 0. 5 ；KC1，0. 5 ；CaCl2 · 2Η20，0· 05 ；KH2PO4, 2 ；Na2HPO4 · 12H20，2 ;MgS04，0. 1 ；微量元素，1. 5mL/L，余量為水。所述微量元素組成如下 FeCl3 · 6H20 0. 01，ZnSO4 · 7H20 0. 1，CuSO4 · 5H20 0. 01，MnSO4 · H2O 0. lg/L, H3BO3,0. 01，余 量為水。3、IOL發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂 將搖瓶菌種接種到IOL發(fā)酵罐中，接種量5 % (ν/ν)，發(fā)酵過程溫度控制在32°C，通 氣量為1. Ovvm,攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，發(fā)酵周期4天。發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下(g/L)麥當(dāng)勞廢棄油脂，60 =NaNO3,4NaCl,0. 5 ；KC1,0. 5 ； CaCl2 · 2Η20，0· 05 ；KH2PO4, 2 ；Na2HPO4 · 12Η20，2 ;MgS04，0. 1 ；微量元素，1. 5，余量為水。所述 微量元素組成如下FeCl3 · 6H20 0. 01，ZnSO4 · 7H20 0. 1，CuSO4 · 5H20 0. 01，MnSO4 · H2O 0. 1，H3BO3 0. 01，余量為水。發(fā)酵罐培養(yǎng)約3天時，泡沫開始溢滿回收器頂部而觸發(fā)泡沫感應(yīng)噴霧裝置，通過 75 %的乙醇霧沫進(jìn)行高效消泡，至發(fā)酵結(jié)束時(5天)，乙醇累計使用量是發(fā)酵液體積的 5. 2%。4、將發(fā)酵液滅菌后，通過30kDa的聚砜中空纖維超濾組件去除菌體，獲得去菌體 鼠李糖脂。用本實施例得到發(fā)酵液中鼠李糖脂的產(chǎn)量達(dá)到31. 8g/L。據(jù)估計，由于采用價格低 廉的廢棄油脂為主要碳源和同時可作為底物利用的乙醇為高效消泡，降低了發(fā)酵的原料成 本，又克服了發(fā)酵中大量形成泡沫的問題，提高了產(chǎn)量，使鼠李糖脂的生產(chǎn)成本比傳統(tǒng)方法 低25-40%左右。實施例2 鼠李糖脂濃縮液的制備
1、菌種發(fā)酵菌種為銅綠假單胞菌 ZJU_211(Pseudomonas aeruginosaZJU-211)2、將菌種接種于種子培養(yǎng)基，溫度為38°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)48h得到搖瓶菌 種。種子培養(yǎng)基組成如下菜籽油加工下腳油|4,40g/L =NaNO3,4g/L ；NaCl, 1. 5g/L ；KCl, 1. 5g/L ； CaCl2 ·2Η20，0· 2g/L ；KH2PO4,4g/L ；Na2HPO4 · 12H20，4g/L ；MgSO4,0. 3g/L ；微量元素，2. 5mL/L, 余量為水。所述微量元素組成如下=FeCl3 ·6Η20 0. 08g/L,ZnSO4 ·7Η20 0. 75g/L,CuSO4 ·5Η20 0. 075g/L, MnSO4 · H2O 0. 75g/L, H3BO3,0. 15g/L，余量為水。3、50L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂將搖瓶菌種接種到50L發(fā)酵罐中，接種量5% (ν/ν)，碳源濃度為5%，發(fā)酵過程溫 度控制在38°C，通氣量為1. Ovvm,攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，發(fā)酵周期4天。發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下菜籽油加工下腳油料，70g/L ；NaN03,8g/L ；NaCl, 1. 5g/L ； KCl，1. 5g/L ；CaCl2 · 2H20，0. 2g/L ；KH2PO4,4g/L ；Na2HPO4 · 12H20，4g/L ；MgSO4,0. 3g/L ；微量 元素，2. 5mL/L，余量為水。發(fā)酵罐培養(yǎng)2天多時，泡沫開始溢滿回收器頂部而觸發(fā)泡沫感應(yīng)噴霧裝置，通過 95 %的乙醇霧沫進(jìn)行高效消泡，至發(fā)酵結(jié)束時(3. 5天)，每次噴霧所用乙醇體積用量小于 發(fā)酵液體積的0. 5%，累計用量不超過4. 5%。4、將發(fā)酵液滅菌后，通過30kDa的聚砜中空纖維超濾組件去除菌體，獲得去菌體 鼠李糖脂發(fā)酵液。5、濃縮鼠李糖脂的制備在去菌體發(fā)酵液中加入酸(鹽酸或硫酸)，調(diào)節(jié)溶液Ph 至3. 5，靜置4h，傾去上清液，收集底部酸沉降物，得到含糖脂78%的濃縮鼠李糖脂產(chǎn)品。6、用本實施例得到的濃縮產(chǎn)品的鼠李糖脂含量達(dá)到780g/L。實施例3、鼠李糖脂作為生物農(nóng)藥的應(yīng)用1、鼠李糖脂對番茄疫霉的菌落與菌絲體生長具有抑制效果所用的真菌孢子為番茄晚疫病疫霉菌，所用的鼠李糖脂發(fā)酵液經(jīng)300 1000倍數(shù) 稀釋后成為含20 200ppm(mg/L)的鼠李糖脂溶液。將濃度為0 200ppm的鼠李糖脂發(fā) 酵液配制馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，并在75mm培養(yǎng)皿內(nèi)混合均勻、凝固后，在其中央接入培 養(yǎng)5天的番茄疫霉菌餅，25 27°C，恒定濕度，黑暗培養(yǎng)，2天后測定各組菌落半徑，計算抑 制率。如附圖1所示，濃度為150ppm的鼠李糖脂發(fā)酵液對于疫霉孢子的菌落生長抑制率達(dá) 到 54%。將去菌體鼠李糖脂發(fā)酵液配制馬鈴薯液體培養(yǎng)液(PDB)，并接入一定濃度的番茄 疫霉孢子懸浮液，25 27°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120rpm，2天后測定各組菌絲體增重。如附圖 2所示，濃度為150ppm的鼠李糖脂發(fā)酵液對于疫霉的菌絲生長抑制率達(dá)到78%。2 鼠李糖脂發(fā)酵液對灰霉的菌落與菌絲體生長抑制效果所用的真菌孢子為灰霉菌，采用配制馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)中添加濃縮鼠李糖 月旨，使鼠李糖脂有效濃度達(dá)50-150ppm，兩者在75mm培養(yǎng)皿內(nèi)混合均勻、凝固后，在其中央 接入培養(yǎng)5天的灰霉菌餅，25 28°C，恒定濕度，黑暗培養(yǎng)，2天后測定各組菌落半徑，計算 抑制率。如附圖3所示，濃度為150ppm的鼠李糖脂發(fā)酵液對于灰霉孢子的菌落生長抑制率 達(dá)到49%。
將馬鈴薯培養(yǎng)液(PDB)加入不同量的濃縮鼠李糖脂，混合均勻后，接入一定濃度 的灰霉孢子懸浮液，25 28°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120rpm，2天后測定各組菌絲體增重。如附 圖4所示，濃度為150ppm的鼠李糖脂發(fā)酵液對于灰霉的菌絲生長抑制率達(dá)到90%。3、鼠李糖脂發(fā)酵液對于感染晚疫病的番茄植株抑菌效果選取健康生長30天的番茄苗，噴灑不同稀釋度的去菌體鼠李糖脂發(fā)酵液(50 150ppm)后接種番茄晚疫霉孢子懸浮液，10天后，觀察到150ppm用量下能夠明顯抑制番茄 晚疫病菌的發(fā)生。
實施例4 鼠李糖脂作為農(nóng)藥助劑發(fā)酵得到的鼠李糖脂兼有分散、潤濕、增溶和乳化性，表面活性明顯好于化學(xué)表面 活性劑，且在親水性方面顯著改善，溫度與化學(xué)環(huán)境穩(wěn)定性也較好。該助劑完全符合綠色 化學(xué)品標(biāo)準(zhǔn)，可廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)藥助劑，例如草甘膦、麥草畏、阿維菌素、甲維鹽和莠去津 等。其中具體例子如下1.阿維菌素水乳劑的助劑阿維菌素是一種大環(huán)內(nèi)酯抗生素類殺蟲螨劑，生物活性較高，具有觸殺和胃毒作 用，殺蟲譜廣。目前國內(nèi)大部分產(chǎn)品都是原藥含量很低的乳油，使用了大量的甲苯、二甲苯 有機溶劑助劑，揮發(fā)性極強，污染環(huán)境，對人的健康有害。將乳油配成水乳劑可以不用或減 少這類溶劑用量。本發(fā)明將20%阿維菌素原油(即阿維菌素的二甲苯溶液)、占3%體積分 率的食用油、大量的水及鼠李糖脂(2g/L)在攪拌下進(jìn)行混合，形成均勻呈乳狀的1.8%阿 維菌素水乳劑。其外觀為乳白色溶液，乳化分散性和穩(wěn)定性試驗按GB/1603進(jìn)行，該水乳劑 入水后能迅速、均勻分散于水中，上無浮油，下無沉淀，乳液穩(wěn)定性合格。該劑型以水作主要 溶劑，有機溶劑含量不超過8%，與同類阿維菌素乳油相比，具有不燃不爆、對人畜及環(huán)境溫 和的優(yōu)點，是無公害瓜果蔬菜生產(chǎn)的首選用藥。2.用作除草劑莠去津水懸浮制劑的助劑采用含45g/L鼠李糖脂去菌體發(fā)酵液作為生物表面活性劑助劑添加到莠去津原 藥中，當(dāng)鼠李糖脂含量為lg/L時，可以制備得到均勻懸浮的48%莠去凈水懸浮劑，該懸浮 劑在30min內(nèi)未出現(xiàn)明顯沉降的莠去津水懸浮劑。進(jìn)一步加入2g/L的甲基纖維素，懸浮性 更好，在45分鐘內(nèi)未出現(xiàn)底部沉積，并具有良好的熱貯穩(wěn)定性和冷貯穩(wěn)定性。采用上述配制的莠去津水懸浮劑用于玉米地除草，發(fā)現(xiàn)除草效果比市場上可售的 莠去津水懸浮劑具有更好，可以在降低30%的用量下達(dá)到類似的除草效果。實施例4鼠李糖脂作為肥料助劑供試品種為番茄苗。種子播于湖州青銅橋底下的運河邊土表，用細(xì)砂土覆蓋，留苗 50株，基肥用量為N 0. 15g/kg、K2HP04 0. 3g/kg.出苗20天后進(jìn)行葉面噴施處理，此后每星 期噴施1次，共噴施3次，至出苗41天觀察番茄苗的表觀營養(yǎng)狀態(tài)及測定每株生物質(zhì)量。每 株噴施混合液10ml。共設(shè)5個處理1)葉面噴施蒸餾水；2)葉面噴施基肥，3)葉面噴施含 鼠李糖脂lg/L的基肥混合液；4)葉面噴施含鼠李糖脂2. 5g/L的基肥混合液；5)葉面噴施 含鼠李糖脂4g/L的基肥混合液。各處理組設(shè)10株作為平行試驗。噴施液均稀釋300倍。 噴施基肥的各組，其葉片數(shù)目、面積和光澤度均好于對照組(蒸餾水)，而添加了鼠李糖脂 的基肥噴施組又明顯好于僅噴施基肥組，至于不同鼠李糖脂濃度的各組間無明顯差別。通 過測定每株生物量可知，噴施葉面肥較對照促進(jìn)了番茄苗期的生物量提高，而加入表面活性劑后葉面肥的肥效又得到進(jìn)一步提高。比較有鼠李糖脂的處理組3、處理組4和對照組 2，發(fā)現(xiàn)前兩者的苗重(番茄苗鮮重)分別比后者增加15. 2和19.9%，說明加入表面活性劑 后的葉面肥具有明顯促進(jìn)養(yǎng)分吸收和植物生長的效果。實施例5在飼料添加劑中的應(yīng)用 飼料工業(yè)是利用動物營養(yǎng)技術(shù)使糧食及其副產(chǎn)物更有效地轉(zhuǎn)化為畜產(chǎn)品，最大限 度地緩解人口、生活質(zhì)量增長與土地、糧食資源匱乏間的矛盾。鼠李糖脂是一種天然的表面 活性劑，能促進(jìn)食物中各種營養(yǎng)物質(zhì)的乳化和小腸的營養(yǎng)吸收的雙重功能。Caco-2細(xì)胞源 自人結(jié)腸癌細(xì)胞，體外培養(yǎng)時能自發(fā)地進(jìn)行類似腸道細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生化學(xué)上的分化，具 有小腸的形態(tài)與吸收特征，如形成微絨毛結(jié)構(gòu)、良好的刷狀緣及細(xì)胞間緊密連接和具有轉(zhuǎn) 運糖和氨基酸等的載體轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，因此成為體外評價小腸吸收功能的有效且易于操作的經(jīng) 典實驗手段。本發(fā)明專利采用該體系評價了鼠李糖脂促小腸吸收的作用。具體實現(xiàn)方法如 下所述。Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)48孔跨膜池的微孔濾膜上，培養(yǎng)條件為37°C、5% C02、培養(yǎng)基 采用含丁酸、非必需氨基酸的DMEM高糖培養(yǎng)基。經(jīng)培養(yǎng)一周，Caco-2細(xì)胞的跨膜電阻 (TER)值在500-800 Ω/cm2，即已達(dá)到體內(nèi)小腸上皮細(xì)胞層的緊密連接，然后更換上下層培 養(yǎng)基為基礎(chǔ)鹽溶液(HBSS)，上層培養(yǎng)基添加2mM谷氨酰胺或IOmM葡萄糖，迅速收集下層培 養(yǎng)基樣品用于高效液相色譜(HPLC)法分析葡萄糖(或谷氨酰胺)用，同時分析溶液中乳酸 脫氫酶濃度表征細(xì)胞損傷程度。經(jīng)綜合評價發(fā)現(xiàn)，小于2g/L的鼠李糖脂加量可以提高19% 以上的氨基酸和葡萄糖吸收率且對細(xì)胞本身無損傷。實施例6 在生物殺蟲劑方面的應(yīng)用市售殺蟲劑的刺激性強、毒性大，鼠李糖脂溶液為水基型除蟲劑，可以殺滅蟑螂與 蚜蟲。下面以蟑螂為例介紹其使用效果。采用含鼠李糖脂31. 8g/L的去菌體發(fā)酵液為母液與去離子水以1 300的體積比 配制滅蟑螂溶液。實驗室試驗是在變長為5cm的正方體玻璃方箱內(nèi)進(jìn)行，內(nèi)有軍事醫(yī)學(xué)科 學(xué)院提供的敏感品系德國小蠊20只，按lml/m3劑量直接噴灑，進(jìn)行三次重復(fù)試驗。噴灑一 次，蟑螂一天后密度下降73 %，兩天后無蟑螂幸存?，F(xiàn)場殺滅蟑螂分誘捕和直接噴灑兩種。在蟑螂較多的底層陰濕實驗室地面角落放 置裝有20ml鼠李糖脂滅蟑螂溶液的250ml燒杯，過夜后在燒杯及附近出現(xiàn)十幾個已死亡的 蟑螂?；蛳蛘軇拥捏胫苯訃姙⑹罄钐侵瑴珞肴芤?，連續(xù)噴灑兩次，蟑螂迅即停止運動 而死亡。實施例7 作為污泥脫水劑的應(yīng)用油泥均勻乳化的泥漿污水取自齊魯石化。取5個帶刻度的50ml試管，分別加入 30ml齊魯石化泥漿污水，然后依次加入40g/L鼠李糖脂去菌體發(fā)酵液0、0. 25ml,0. 5ml、lml 和1. 5ml。再置于旋混儀上高速混合2分鐘，于室溫靜置4h，觀察上層水自然分層的高度占 整個測試高度的分率，即破乳率。對0 1. 5ml的去菌體發(fā)酵液的加量，破乳率依次從無糖 脂對照組的28%增加到75%，脫水效果顯著，使污泥處理量可以從72%縮減到25%。可 見，鼠李糖脂發(fā)酵液對石化企業(yè)由油、水和泥乳化較好的泥漿溶液具有較好的破乳作用，通 過提高含油污泥的脫水率來顯著降低泥漿處理量。上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和 權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種鼠李糖脂的制備方法，其特征在于，采用廢棄油脂為碳源和發(fā)酵過程中采用乙醇進(jìn)行消泡，步驟如下(1)菌種培養(yǎng)將銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa ZJU-211菌種接種到搖瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度為32-38℃，搖床轉(zhuǎn)速120-200rpm，培養(yǎng)24-48h得到搖瓶菌種。(2)發(fā)酵將搖瓶菌種接種到發(fā)酵罐中，利用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種體積分率為3-10％，發(fā)酵過程溫度控制在32-38℃，通氣量為0.2-1.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速200-500rpm，發(fā)酵周期3-5天。在發(fā)酵的中、后期，溢出泡沫回收器的泡沫采用乙醇消泡后返回發(fā)酵罐。發(fā)酵結(jié)束后得含菌體的發(fā)酵液。(3)超濾除菌體發(fā)酵液通過中空纖維膜過濾去除菌體，得到去菌體發(fā)酵液，其含有鼠李糖脂35-50g/L。(4)濃縮分離在去菌體發(fā)酵液中加入酸，調(diào)節(jié)溶液pH至3.0～4.0，靜置1～12h，傾去上清液，收集底部酸沉降物，得到含糖脂70～90％的濃縮鼠李糖脂產(chǎn)品。所述步驟(2)中，所述搖瓶種子培養(yǎng)基組成如下廢棄油脂，30～40g/L；NaNO3，2～4g/L；NaCl，0.5～1.5g/L；KCl，0.5～1.5g/L；CaCl2·2H2O，0.05～0.2g/L；KH2PO4，2～4；Na2HPO4·12H2O，2～4g/L；MgSO4，0.1～0.3g/L；微量元素，1.5～2.5mL/L，余量為水。所述微量元素組成如下FeCl3·6H2O0.01～0.08g/L，ZnSO4·7H2O 0.1～0.75g/L，CuSO4·5H2O 0.01～0.075g/L，MnSO4·H2O 0.1～0.75g/L，H3BO3，0.01～0.15g/L，余量為水。所述步驟(3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下廢棄油脂，30～100g/LNaNO3，4～8g/L；NaCl，0.5～1.5g/L；KCl，0.5～1.5g/L；CaCl2·2H2O，0.05～0.2g/L；KH2PO4，2～4g/L；Na2HPO4·12H2O，2～4g/L；MgSO4，0.1～0.3g/L；微量元素，1.5～2.5mL/L，余量為水。所述微量元素組成如下FeCl3·6H2O0.01～0.08g/L，ZnSO4·7H2O 0.1～0.75g/L，CuSO4·5H2O 0.01～0.075g/L，MnSO4·H2O 0.1～0.75g/L，H3BO3 0.01～0.15g/L，余量為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠李糖脂的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，利用如 油脂加工下腳料或餐飲廢油等廢棄油脂為碳源進(jìn)行鼠李糖脂發(fā)酵。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠李糖脂的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，在發(fā)酵 過程的中、后期，溢到回收器頂部的泡沫因觸發(fā)乙醇噴霧后被消泡并返回發(fā)酵罐。每次乙醇 體積加量不超過泡沫體積的1%，乙醇濃度為75% 99. 5%。
4.一種鼠李糖脂發(fā)酵液作為生物農(nóng)藥的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述鼠李糖脂作為抑制或殺滅植物真菌病 害的生物農(nóng)藥。
6.一種鼠李糖脂作為農(nóng)藥助劑的應(yīng)用，其特征在于，所述農(nóng)藥助劑兼有乳化、分散和表 面潤濕作用。
7.一種鼠李糖脂作為鼠李糖脂作為肥料助劑的應(yīng)用。其特征在于，所述肥料助劑具有 表面潤濕作用，促進(jìn)肥料被植物表面吸收。
8.一種鼠李糖脂作為飼料助劑的應(yīng)用，其特征在于，所述飼料助劑具有表面活性作用， 促飼料營養(yǎng)物易被小腸吸收。
9.一種鼠李糖脂作為生物殺蟲劑的應(yīng)用，其特征在于，所述蟲為蟑螂、蚜蟲等。
10.一種鼠李糖脂作為污泥脫水劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鼠李糖脂的制備方法及其應(yīng)用，本發(fā)明以廢棄油脂為碳源，利用銅綠假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂，結(jié)合乙醇的消泡作用，產(chǎn)量可達(dá)35-50g/L，使成本比傳統(tǒng)方法低25-40％左右。含20-500mg/L鼠李糖脂溶液處理植物病害菌，對病害真菌菌絲體生長和孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)40-90％，有效抑制植物真菌病害。含20-500mg/L鼠李糖脂溶液對蟑螂和蚜蟲的殺蟲效果明顯。此外，將鼠李糖脂代替化學(xué)表面活性劑用作農(nóng)藥、肥料和飼料的助劑及含油污泥脫水劑，效果顯著。
文檔編號A01N43/16GK101845468SQ201010136140
公開日2010年9月29日 申請日期2010年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日
發(fā)明者孟琴, 張國亮 申請人:湖州紫金生物科技有限公司;孟琴