專利名稱：一種水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHL1的啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及克隆水稻OsRHLKrice roothairless 1)基因編碼區(qū)的上游啟動(dòng)子序列，以及該上游啟動(dòng)子的用途。
背景技術(shù)：
根系是植物吸收水分、養(yǎng)分的重要器官，而根毛又是植物根系功能區(qū)段生理活性 界面的重要組成部分。植物根尖的結(jié)構(gòu)包括四部分根冠、分生區(qū)、伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)。在分 生區(qū)根毛細(xì)胞與非根毛細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)形態(tài)差異；到了伸長(zhǎng)區(qū)根毛開(kāi)始形成；在成熟區(qū)生毛 細(xì)胞成熟并完全分化，根毛生長(zhǎng)并達(dá)到成熟(Dolan et al.，1993)。根毛是根表皮細(xì)胞上的 一些管狀突起，根毛發(fā)育過(guò)程大致可以劃分為表皮細(xì)胞特異化、起始、尖端生長(zhǎng)和成熟4個(gè) 階段(Gilroy and Jones，2000)。根毛的存在可有效擴(kuò)大表皮細(xì)胞與根際土壤的接觸面積，有利于提高根系吸收 土壤中水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的效率以及與土壤微生物的互作(Grierson and Schiefelbein, 2002)。近年來(lái)植物根毛發(fā)生發(fā)育及養(yǎng)分吸收的研究取得了較大的進(jìn)展。目前的研究主要 是基于雙子葉模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)的根毛相關(guān)突變體展開(kāi)的，而以水 稻(Oryzasativa)為模式植物的禾本科作物的根毛發(fā)生機(jī)制研究較少。采用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是利用優(yōu)良基因(尤其是外源基因)改良物種的一條重要途 徑。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)改良物種除需要優(yōu)良基因資源外，還需要適用于目標(biāo)基因在最佳狀 態(tài)下發(fā)揮功能的啟動(dòng)子。國(guó)際國(guó)內(nèi)可供選擇用于農(nóng)作物性狀改良的功能基因的數(shù)量逐漸在 增加。但是與之相比，可供選擇的啟動(dòng)子數(shù)量和種類卻非常有限，尤其缺乏適用于改良農(nóng) 作物性狀的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子已經(jīng)成為采用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)改良物種的瓶頸之一。目前國(guó)際 國(guó)內(nèi)用于農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化的啟動(dòng)子主要是玉米泛素(ubiquitin)基因啟動(dòng)子、水稻肌動(dòng)蛋 白(actin)基因啟動(dòng)子、病毒35S等組成型表達(dá)啟動(dòng)子。它們調(diào)控目標(biāo)基因在所有組織中 都表達(dá)，而且沒(méi)有時(shí)空限制。用這些啟動(dòng)子調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)時(shí)，由于大量目標(biāo)蛋白在不需 要的細(xì)胞中出現(xiàn)，往往容易造成物種形態(tài)和生理功能異常。雖然國(guó)際上也有少量特異啟動(dòng) 子分離克隆的報(bào)道，但是涉及的農(nóng)作物的種類很少，數(shù)量非常有限，而且我們不具有知識(shí)產(chǎn) 權(quán)，將受限于生產(chǎn)應(yīng)用。OsRHLl (Wona Ding et al.，2009)在專利申請(qǐng)?zhí)枮?200910095888. 0 的發(fā)明《一種 水稻根毛控制基因OsRH Li》曾明確告知該基因編碼的蛋白在根毛發(fā)育調(diào)控上的功能。上文中的參考文件具體如下1、Dolan, L. , Janmaat, K. , ffillemsen, V. , Linstead, P. , Poethig, S. , Roberts, K.，Scheres, B. (1993).擬南芥的根細(xì)胞組織體系?！栋l(fā)育》119 :71_842,Gilroy, S. ,and Jones,D. L. (2000).從根毛發(fā)育的形態(tài)到養(yǎng)分吸收的功能?！吨?物科學(xué)發(fā)展趨勢(shì)》5，56-60.3、Grierson，C.，and Schiefelbein, J. (2002).根毛?！稊M南芥》4、Hiei, Y.，Ohta, S.，Komari, T. and Kumashiro, Τ. (1994)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以及T-DNA邊界序列的分析。《植物雜志》6，271-282.5、Terada R. and Shimamoto K. (1990). CaMV35S_GUS 基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表 達(dá)。《分子與普通遺傳學(xué)》220 :389-392.6、Wona Ding, Zhiming Yul, Yanli Tong, Wei Huang, Hanmin Chen, Ping Wu (2009). 一個(gè)水稻bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控根毛發(fā)育?！都?xì)胞研究》1309-1311.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHLl的啟動(dòng)子， 利用該啟動(dòng)子(OsRHLl基因啟動(dòng)子)能進(jìn)行高效的根毛細(xì)胞表達(dá)的植物轉(zhuǎn)化。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHLl的啟動(dòng) 子，該啟動(dòng)子為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。作為本發(fā)明的水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHLl的啟動(dòng)子的改進(jìn)啟動(dòng)子還包括在 SEQ IDNO :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸生成的突變體、 等位基因和衍生物。作為本發(fā)明的水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHLl的啟動(dòng)子的進(jìn)一步改進(jìn)啟動(dòng)子還 包括是在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列雜交、且具有相同功能的核苷 酸序列。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了上述水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHLl的啟動(dòng)子的用途用于 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻。作為本發(fā)明的水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHLl的啟動(dòng)子的用途的改進(jìn)該啟動(dòng)子 的功能在于能啟動(dòng)下游編碼基因在水稻根毛細(xì)胞中的特異表達(dá)。本發(fā)明的啟動(dòng)子是水稻根毛發(fā)育調(diào)控基因OsRHLl的基因編碼區(qū)的上游序列。通 過(guò)構(gòu)建含有該啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化到轉(zhuǎn)基因水稻中，對(duì)轉(zhuǎn)基因材料的普通葉、 劍葉、花和根等多種不同組織進(jìn)行了 GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)了該啟動(dòng)子在根毛 細(xì)胞中的特異性表達(dá)。根毛是根系吸收土壤中水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)以及與土壤微生物互作的重 要組織部位。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)改良物種除需要優(yōu)良基因資源外，還需要適用于目標(biāo)基因 在最佳狀態(tài)下發(fā)揮功能的啟動(dòng)子。水稻根毛特異性啟動(dòng)子可應(yīng)用于農(nóng)作物養(yǎng)分吸收改良， 這對(duì)于提高作物產(chǎn)量及降低施肥造成的污染都具有較大實(shí)際意義。利用本發(fā)明的啟動(dòng)子構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻，具有如下優(yōu)點(diǎn)可以啟動(dòng)下游相應(yīng)基因特 異性地高效表達(dá)于根毛，而不啟動(dòng)該相應(yīng)基因在其它部位的表達(dá)。根毛是植物吸收土壤中 水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的重要組織，對(duì)根毛這一特異組織進(jìn)行改良的方法可以應(yīng)用于未來(lái)改良根 毛對(duì)土壤中養(yǎng)分的吸收能力，同時(shí)又不會(huì)對(duì)其它器官組織產(chǎn)生不利的影響。在本發(fā)明中我 們?cè)贠sRHLl啟動(dòng)子的下游擺了一個(gè)報(bào)告基因(GUS)，由于該GUS基因在表達(dá)的部位可被染 成藍(lán)色，所以可以直觀顯示出啟動(dòng)子的組織特異性。而該報(bào)告基因(GUS)如果接在傳統(tǒng)的 組成型表達(dá)啟動(dòng)子(如35S啟動(dòng)子等)下時(shí)，則會(huì)調(diào)控GUS基因在莖、葉、花、種子等所有器 官中都表達(dá)，并且在根中的表達(dá)也不會(huì)僅局限于根毛組織(Terada and Shimamoto 1990) 0 用這些組成型表達(dá)啟動(dòng)子調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)時(shí)，由于大量目標(biāo)蛋白在不需要的細(xì)胞中出 現(xiàn)，往往容易造成物種形態(tài)和生理功能異常。而本發(fā)明的應(yīng)用旨在將來(lái)啟動(dòng)子下游接上特 定的養(yǎng)分吸收基因，使之特異增強(qiáng)表達(dá)于根毛中，這種僅針對(duì)根毛的靶向性遺傳改良具有
4很大的應(yīng)用價(jià)值。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖 1 是 pBIlOl. I-GUS plus 載體示意圖。圖2是OsRHLl啟動(dòng)子融合⑶S基因轉(zhuǎn)基因材料的染色結(jié)果；a、主根分生區(qū)以上；b，根毛區(qū)；c，根毛；d，根毛區(qū)的石蠟縱切圖；bar = 100 μ m(b)bars = 40 μ m(c, d)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以下實(shí)施例所使用分子生物學(xué)的方法均為已知的技術(shù)。在Ausubel編 寫(xiě)白勺 JohnWiley and Sons 公司出片反的 Current Protocols in Molecular Biology，禾口 J· Sambrook 等編寫(xiě) Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)出片反白勺 Molecular Cloning :A Labortory Manual, 3rd ED.等文獻(xiàn)均有詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1、根據(jù)OsRHLl基因的起始密碼子ATG前面的序列設(shè)計(jì)兩端分別含HindIII和KpnI 酶切識(shí)別位點(diǎn)(下劃線)的引物，以野生型Kasalath的根基因組DNA為模板，擴(kuò)增出全長(zhǎng) 2443bp的OsRHLl基因啟動(dòng)子，其核苷酸序列為SEQ ID NO=I所示。引物序列如下上游弓丨物:AACGGTACCTGGCACTGATATTCTAATGGT下游弓丨物:AACGTCGACGCTTAGCTTAGCTTAGCTGAAG利用LA Taq DNA Polymerase把整個(gè)啟動(dòng)子DNA序列擴(kuò)增出來(lái)，PCR條件是94°C 變性4min，然后進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)即94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 2. 5min,循環(huán)數(shù)為30，最后再延伸 7min結(jié)束。PCR產(chǎn)物在0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳并割膠回收目的條帶，連接pMD19_T載體， 連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，劃板挑陽(yáng)性單克隆測(cè)序。鑒定出的正確克 隆與實(shí)驗(yàn)室改造的pBIlOl. I-GUS plus載體(圖1)分別用HindIII和KpnI雙酶切，回收 后連接，連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，劃板挑陽(yáng)性單克隆。酶切鑒定為陽(yáng) 性的單克隆菌液擴(kuò)繁后抽質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌ΕΗΑ105感受態(tài)細(xì)胞。該農(nóng)桿菌菌株用于 水稻轉(zhuǎn)基因。pBIlOl. I-GUS plus 載體改造方法具體如下將 pCAMBIA1305. 1 上的 GUS plus 序 列用PCR的方法擴(kuò)增出，上游引物5’端頭加了 BamH I和Kpn I酶切接頭，下游引物5’端 頭加了 Sac I酶切接頭。PCR產(chǎn)物用BamH I和Sac I酶切后連入用相同酶切的pBIlOl. 3 中。經(jīng)過(guò)改造后的載體統(tǒng)一稱為pBIlOl. I-GUS plus載體。其多克隆位點(diǎn)與⑶S plus讀 碼框之間經(jīng)測(cè)序鑒定。所用引物序列為GUS plus-up AACGGATCCACGGTACCATGGTAGATCTGAGGGTAAATTTCGUS plus-low ACGGAGCTCTCACACGTGATGGTGATGGTGATGG。水稻愈傷經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、篩選具有卡那霉素抗性的愈傷、分化、 生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌(EHA105)介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用Hiei等人(1994)報(bào)道的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。獲得的轉(zhuǎn)基因苗后代用GUS染液染色后見(jiàn) 圖2所示，表明OsRHLl基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS在根的伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)的根毛中表達(dá)。由于根毛著生部位是在根的根毛區(qū)，所以在圖2a中可見(jiàn)在根伸長(zhǎng)區(qū)域以上才出 現(xiàn)⑶S (藍(lán)色)的表達(dá)，進(jìn)一步放大看到圖2b及圖2c中所示根毛中的⑶S表達(dá)，從圖2d 的縱向石蠟切片可以看到只有表皮的根毛細(xì)胞處有GUS表達(dá)，根內(nèi)部的皮層細(xì)胞則沒(méi)有表 達(dá)。雖然在石蠟切片的過(guò)程中伸展在外的根毛細(xì)胞已不是保留得很完整，但是根表皮細(xì)胞 及內(nèi)部的皮層細(xì)胞均是完整的。根毛細(xì)胞與根部的其它細(xì)胞層之間GUS表達(dá)的差異是很明 顯的。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHL1的啟動(dòng)子，其特征在于該啟動(dòng)子為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHLl的啟動(dòng)子，其特征是所述啟 動(dòng)子還包括在SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸 生成的突變體、等位基因和衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHLl的啟動(dòng)子，其特征是所述啟 動(dòng)子還包括是在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列雜交、且具有相同功能 的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHLl的啟動(dòng)子的用途用于 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHLl的啟動(dòng)子的用途啟動(dòng)下游 編碼基因在水稻根毛細(xì)胞中的特異表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHL1的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了上述水稻根毛發(fā)育控制基因OsRHL1的啟動(dòng)子的用途用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻；該啟動(dòng)子能用于啟動(dòng)下游編碼基因在水稻根毛細(xì)胞中的特異表達(dá)。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101880665SQ201010141029
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日
發(fā)明者丁沃娜, 俞志明, 吳平, 莫肖蓉 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)