專利名稱：：一種新三萜皂甙化合物及其在害蟲防治中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的皂甙，具體涉及一種五環(huán)三萜型糖甙的制備方法及其在小菜蛾防治中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：山石CatunaregamspinosaTirveng,屬于菌草禾斗(Rubiaceae)山石^f屬CatunaregamWolf，是海南省的一種常見紅樹伴生植物。在印度(當(dāng)?shù)孛鸐adna，Mainphal)和巴西(當(dāng)?shù)孛鸖acrificiodeCristo)，山石榴是作為傳統(tǒng)草藥被用于催吐、抗腫瘤和抗生育(VarshneyIP,etal.SaponinsfromRandiadumetorumLamk.Fruitpulp[J]·JIndianChemSoc，1978:397_400.)以及驅(qū)蟲和抗痢疾等(DuboisMA,etal.Newbiologicallyactivetriterpene-saponinsfromRandiadumetorum[J].PlantaMedica,1990,56(5)451-455)0山石榴多樣的藥用活性引起了國外研究人員對其化學(xué)成分的研究，從中得到了三萜及其糖甙和香豆素糖甙以及環(huán)烯醚萜等(HamerskiL，etal.IridoidglucosidesfromRandiaspinosa(Rubiaceae)[J].Phytochemistry,2003,63(4)397-400)類型化合物。1986年Sati等對從山石榴中得到的兩個三萜皂甙3_0_[β-D-Glucopyranosyl-(1一2)_α-L-rhamnopyranosyl-(1一6)_β-D-glucopyranoside]oleanolicacid禾口3—0-[β-D-Glucopyranosyl-(1—2)-α-L-rhamnopyranosyl-(1—6)-[β-D-glucopyranosyl-(1—2)]-β-D-glucopyranoside]oleanolicacid進(jìn)行殺螺活性試驗，結(jié)果顯示在15ppm到20ppm的濃度下，兩個化合物對一種載有血吸蟲病的蝸牛Biomphalariaglabrata都是致死的(SatiOP,etal.MolluscicidalSaponinsofXeromphisspinosa[J].PlantaMed,1986，5(1)=381-383)。1989年Kulakkattolickal報道了山石榴果實水提取物的毒魚活性，它在5小時之內(nèi)的LC5tl(半致死濃度)僅為0.0036%(KulakkattolickalA.T.PiscicidalplantsofNepal:ripefruitofCatunaregamspinosa(thunb.)(Rubiaceae)andleavesofPolygonumhydropiperL.(polygonaceae)asfishpoisons[J].Aquaculture,1989,78(3-4)=293-301)02005年華南農(nóng)業(yè)大學(xué)曾東強(qiáng)等對采于廣西省的山石榴進(jìn)行了小菜蛾拒食試驗，結(jié)果表明10mg/ml甲醇提取物對小菜蛾幼蟲的拒食率達(dá)82.49%。并且初步確定活性成分主要存在于極性較大的提取物中(曾東強(qiáng)等.山石榴果實提取物對小菜娥的拒食作用[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，26(4):34-36)，但未對活性化合物進(jìn)行進(jìn)一步的分離和鑒定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是從山石榴中分離出新的具有實用價值三萜皂甙和該化合物的制備方法，及其在防治植物源殺蟲劑，特被是防治小菜蛾中的應(yīng)用。一方面，本發(fā)明的齊墩果烷型三萜皂甙從紅樹伴生植物山石榴中分離得到，其結(jié)構(gòu)式由通式(1)表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，R1為Xyl或Rha;R2為H或Glu。在一個優(yōu)選的方式中，其中當(dāng)R1為Xyl，R2為H或Glu；當(dāng)R1為Rha，R2為Glu。另一方面，本發(fā)明還提供新三萜皂甙的制備方法，包括以下的步驟(1)、山石榴莖枝陰干后粉碎，先用95%乙醇室溫浸泡提取三次，每次2天，然后用50%乙醇加熱回流提取三次，每次6小時，提取液合并，減壓濃縮得浸膏，備用；(2)、將步驟(1)得到的浸膏加適量水溶解，依次用等體積的石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取。(3)、將步驟(2)得到的正丁醇萃取部分經(jīng)大孔吸附樹脂DlOl層析，洗脫液依次為水、30%、60%、95%乙醇水溶液。(4)、步驟(3)中得到95%乙醇水溶液部分洗脫樣品用氯仿-甲醇為洗脫液進(jìn)行正相硅膠柱(100-200目)層析，按照體積比982到5050進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析TLC追蹤合并組分，將在TLC上用體積比73的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)(Iml中加一滴水)展開的組分通過高效液相色譜(0DS柱)以甲醇-水-磷酸(65350.1)洗脫純化得到化合物I；或在步驟(3)中得到60%乙醇水溶液部分洗脫樣品用氯仿-甲醇為洗脫液進(jìn)行正相硅膠柱(100-200目)層析，按照體積比9010到5050進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析TLC追蹤合并組分，將在TLC上用體積比73的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)(Iml中加一滴水)展開的組分通過正相硅膠柱(200-300目)用氯仿甲醇水(80205)洗脫，然后通過高效液相色譜(0DS柱)用甲醇-水-磷酸(65350.1)洗脫純化得到化合物II和化合物III；優(yōu)選的，在步驟(1)中的提取方法包括95%乙醇室溫浸泡提取和50%乙醇加熱回流提取兩種提取方法。優(yōu)選的，在步驟⑷和(5)中的方法中，高效液相色譜儀是Waters-600型配備ffaters-996二極管陣列紫外檢測器，其中ODS柱型號0DS-5-A，尺寸是250X10mm，5μm，日本YMC公司。最佳的，在分析和制備用流動相中加入1%。磷酸。最佳可選的，在TLC層析用展開劑中最好加入一滴水。另一方面，本發(fā)明提供一種植物源殺蟲試劑，包括本發(fā)明的山石榴甙I、II或III式化合物中的一種或幾種。有益效果本發(fā)明操作簡單，所得到的新三萜皂甙化合物屬植物源活性物質(zhì)具有毒性低，易在自然界降解等優(yōu)點，可以作為植物源幼蟲拒食劑藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物，因而具有良好的應(yīng)用前景。特別是作為植物源幼蟲，例如小菜蛾幼蟲的拒食劑藥物。具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對本發(fā)明的限制。實施例1通式⑴化合物的制備以干重9kg的山石榴為原料，粉碎后先用95%乙醇室溫浸泡提取三次，每次2天，然后用50%乙醇加熱回流提取三次，每次6小時，提取液合并，減壓濃縮得浸膏。浸膏懸溶于水得3L溶液后依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各三次，正丁醇萃取液減壓濃縮得到粗提物(170g)。將該提取物進(jìn)行大孔吸附樹脂柱(DlOl)層析，依次用水、30%,60%,95%乙醇水溶液洗脫，分別減壓濃縮60%和95%乙醇水溶液洗脫液得到兩部分樣品35g和IOgo95%乙醇液洗脫部分樣品(IOg)進(jìn)行常規(guī)正相硅膠柱層析(100-200目，200g)，體積比982到5050梯度洗脫，薄層層析TLC追蹤合并組分，將在TLC上用體積比73的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)(Iml中加一滴水)展開的組分通過高效液相色譜(0DS柱)以甲醇-水-磷酸(65350.1)洗脫純化得到通式(1)中的化合物I(96mg)，即山石榴甙I。60%乙醇水溶液部分樣品(35g)用氯仿-甲醇為洗脫液進(jìn)行正相硅膠柱(100-200目，800g)層析，按照體積比9010到5050進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析TLC追蹤合并組分，將在TLC上用體積比73的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)(Iml中加一滴水)展開的組分通過正相硅膠柱(200-300目，IOOg)用氯仿甲醇水(80205)洗脫，然后通過高效液相色譜(0DS柱)用甲醇-水-磷酸(65350.1)洗脫純化得到化合物II(176mg)和化合物III(13mg)，即山石榴甙II和III；實施例2通式(1)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定和數(shù)據(jù)歸屬通式(1)中化合物I的高分辨質(zhì)譜HRESI-MSm/z951.4938[M+Na]+推出它的分子式為C47H76O18；通過鹽酸水解反應(yīng)，TLC薄層層析后用硫酸顯色劑顯色并與標(biāo)準(zhǔn)樣品對照，確定該化合物的糖鏈中含有葡萄糖和木糖；結(jié)合1HNMR和13CNMR可以看到化合物中有3個糖分子的端基碳信號[δΗ4.83(d,J=7.7Hz)，5.37(d，J=7.9Hz)，5.60(d，J=7.7Hz)；5C105.1，104.8，104.6]，由碳譜上亞甲基δc67.2斷定三分子糖中一個是木糖，另外兩個是葡萄糖。氫譜高場區(qū)有7個單峰甲基質(zhì)子信號(δΗ1.28,1.07,0.84,1.03,1.68,1.20,1.12)；碳譜低場區(qū)環(huán)內(nèi)烯鍵(Se123.1和144.9)以及28位游離羧酸的羰基碳(S。180.2)推測化合物甙元可能為五環(huán)三萜，且糖鏈連接在苷元母核的3位碳上。通過碳譜苷元數(shù)據(jù)的歸屬并與文獻(xiàn)對照(MahatoSB,etal.13CNMRspectraofpentacyclictriterpenoids-acomplicationandsomesalientfeatures[J].Phytochemistry，1994，37(6):1517_1575)確定該化合物的苷元為泰國樹脂酸。負(fù)離子ESIMSm/z795.I(M-Xyl)，765.6(M-Glu)，633.3[Μ-(Xyl+Glu)]推出分子中Xyl和一分子的Glu位于糖鏈末端，與化合物Swartziatrioside(Abdel-KaderMS,etal.BioactivesaponinsfromSwartziaschomburgkiifromthesurinamerainforest[J].JournalofNaturalProducts,2000,63(11)1461-1464)的糖分子信號對比確定了化合物I的糖鏈部分的結(jié)構(gòu)，綜合以上分析推出化合物I為泰國樹脂酸-3_0-i3-D-吡喃葡萄糖基-(1—2)-[β-D-吡喃木糖基]-(1—3)-β-D-吡喃葡萄糖試(Siaresinolicacid-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1—2)-[β-D-xylopyranosyl]-(1—3)-β-D-glucopyranoside)。經(jīng)CA檢索確定該化合物為新化合物，我們命名為山石榴甙I。其物理常數(shù)和光譜數(shù)據(jù)為無定型固體；[a]2°d=+10.4(c=0.8，MeOH).IR(KBr)UmaxCnT1=3400,2920,1741，1645，1038；1HNMR(500MHz,pyridine-d5)δ3.25(1H,dd,J=4.5，11.6Hz，H_3)，5.55(1H，m，H-12)，3.63(1H,brs,H-18)，3.60(1H,brs，H-19)，1.28(1H,s，H-23)，1.07(1H,s，H-24)，0.84(1H,s,H-25)，1.03(1H,s,H_26)，1.68(1H,s,H_27)，1.20(1H,s,H_29)，1.12(1H,s,H_30)，4.83(1H,d,J=7.7Hz,H-Glu(3-0)-1)，5.37(1H,d,J=7.9Hz,H-Glu(3)-1)，5.60(1H,d,J=7.7Hz,H-Xly(2)-1)；13CNMR(125MHz,pyridine-d5)數(shù)據(jù)見表1；正離子ESIMS:m/z951[M+Na]+，967[M+K]+；HRESIMS:m/z951.4938[C47H76O18Na]+。化合物III高分辨質(zhì)譜HRESIMSm/z1113.5471[M+Na]+推出它的分子式為C53H86O23；酸水解反應(yīng)顯示該化合物糖鏈中含有葡萄糖和木糖單元；化合物的氫譜和碳譜顯示四個糖分子信號[δΗ4.82(d，J=7.5Hz),5.37(d,J=7.5Hz)，5.60(d，J=7.5Hz)，6.38(d,J=8.0Hz)；δc105.0，104.7，104.6,95.9]，其中δc95.9是與母核三萜的28位羧基碳相連的糖的端基碳信號。結(jié)合化合物I的核磁共振光譜信號確定化合物III為泰國樹脂酸-3-0-β-D-吡喃葡萄糖基-α—2)-D-吡喃木糖基]-α—3)-β-D-吡喃葡萄糖甙-28-0-β-D-吡喃葡萄糖酯(Siaresinolicacid-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1—2)-[β-D-xylopyranosyl]-(1—3)-β-D-glucopyranoside-28-0-β-D-glucopyranosylester)，CA檢索后我們命名該新化合物為山石榴甙III。其物理常數(shù)和光譜數(shù)據(jù)為無定型固體；[a]2°d=+68.5(c=0.15，MeOH)·IR(KBr)UmaxCnT1:3408，2929，1741，1645，1038；1HNMR(500MHz,pyridine-d5)δ3.25(1Η,dd,J=3.5,11.5Hz,H-3),5.50(1H,brs,H-12)，3.52(1H,brs,H-18)，3.58(1H,brs,H-19)，1.28(1H,s,H-23)，1.09(1H,s,H-24)，0.87(1H,s,H-25)，1.13(1H,s,H_26)，1.65(1H,s,H_27)，1.14(1H，s,H_29)，0.98(1H,s,H-30)，4.82(1H,d,J=7.5Hz,H-Glu(3-0)-1),5.37(1H,d,J=7.5Hz,H-Glu(3)-1)，5.60(lH，d，J=7.5Hz,H-Xly(2)-l),6.38(lH，d，J=8.OHz，H-Glu(28-0)-1)；13CNMR(125MHz,pyridine-d5)數(shù)據(jù)見表1；正離子ESIMS:m/zlll4[M+Na]+,1127[M+K]+；HRESIMS:m/z1113.5471[C53H86O23Na]+。化合物II高分辨質(zhì)譜HRESIMSm/z1127.5562[M+Na]+推出它的分子式為C54H88O23；酸水解反應(yīng)顯示該化合物的糖鏈中含有鼠李糖和葡萄糖；氫譜和碳譜顯示四個糖的端基碳信號[Sh4.85(d，J=7.5Hz)，5.13(d，J=7.5Hz)，6.49(d，J=7.5Hz)，6.37(d，J=8.5Hz)；δc104.9，103.9，101.7，95.9]，其中5C95.9是與母核三萜的28位羧基碳相連的糖的端基碳信號。氫譜高場區(qū)Sh1.69(3H，d，J=6.OHz)為鼠李糖6位的甲基氫信號，同樣證明了鼠李糖的存在。通過與化合物I和III苷元的碳譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該化合物的苷元也是泰國樹脂酸。負(fù)離子ESIMSm/z958.2(M-Rha)，941.7(M-Glu)，795.7[M-(Rha+Glu)],779.7[M-Glu-Glu]提示鼠李糖在糖鏈的末端，結(jié)合已報道的化合物3β,20S,21-trihydroxydammar-24-ene3-0-{[α-L-rhamnopyranosyl(1—2)][β-D-glucopyranosyl(1—3)]-β-D-glucopyranosyl}-21-0-β-D-glucopyranoside的數(shù)據(jù)(YinF,etal.Dammarane-typeglycosidesfromGynostemmapentaphy1Ium[J].JNatProd，2004，67:942-952)確定了該化合物糖鏈的連接位置和順序。綜合以上信息推出化合物II為泰國樹脂酸-3-0-β-D-吡喃葡萄糖基-(1—2)-[a-L-吡喃鼠李糖基]_(1—3)-β-D-吡喃葡萄糖甙-28-0-β-D-吡喃葡萄糖酯(Siaresinolicacid-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1一2)-[α-L-rhamnopuranosyl]-(1一3)-β-D-glucopyranoside-28-Ο-β-D-glucopyranosylester)，CA檢索后確定是一新化合物命名為山石榴甙II。其物理常數(shù)和光譜數(shù)據(jù)為無定型固體；[a]2°d=+37.5(c=0.4,MeOH).IR(KBr)UmaxCnT1:3408，2926,1743,1644,1035；1HNMR(500MHz,pyridine-d5)δ3.38(1Η,dd，J=3.8，11.5Hz，H-3)，5.50(1H,brs,H-12)，3.52(1H,brs,H-18)，3.57(1H,brs，H-19)，1.25(1H,s，H-23)，1.18(1H,s,H-24)，0.88(1H,s,H_25)，1.13(1H,s,H_26)，1.62(1H,s,H_27)，1.14(1H,s,H-29)，0.98(1H,s,H_30)，4.85(1H,d,J=7.5Hz,H-Glu(3-0)-1)，5.13(1H,d,J=7.5Hz,H-Glu(3)-1)，6.49(1H,s,H-Rha(2)-1)，1.69(3H,d,J=6.OHz,H-Rha_6Me)，6.37(1H,d,J=8.5Hz,H-Glu(28-0)-1)；13CNMR(125MHz,pyridine-d5)數(shù)據(jù)見表1；正離子ESIMS:m/z1127[M+Na]+；HRESIMS:m/z1127.5562[C54H88O23Na]+。表1山石榴甙I-III的13C-NMR數(shù)據(jù)(125MHz，氘代吡啶)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例3山石榴甙I-III對小菜蛾的拒食活性試驗三種化合物的結(jié)構(gòu)分別為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>本試驗用小菜蛾種群飼養(yǎng)于人工氣候室(溫度25士1°C，濕度75士10%，光周期14:10h(L:D))，甘藍(lán)菜(Brassicaoleraceae)種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所的溫室中，未噴施任何殺蟲劑。拒食活性測試采用葉碟法樣品化合物用0.05%的吐溫-80水溶液溶解，配制成濃度梯度為0.1、1、10、100和IOOOppm的水溶液，空白對照用0.05%的吐溫-80水溶液。用打孔器(直徑1.5cm)制備甘藍(lán)菜圓形葉碟，在配制好的樣品溶液和對照溶液中浸漬IOs后于室溫下晾干3h。將處理好的葉碟呈十字交叉排列放置于直徑9cm、襯有濕濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，然后接入已饑餓2h的三齡小菜蛾幼蟲5頭，每個處理設(shè)6次重復(fù)。然后將培養(yǎng)皿置于生化培養(yǎng)箱(溫度25士1°C，濕度75士10%，光周期14:10h(L:D))中，48h后用坐標(biāo)紙測量被取食的葉碟面積，并計算拒食率和拒食中濃度AFC5tlt5拒食率(％)=[(對照組取食面積_處理組取食面積)/對照組取食面積X100將拒食率轉(zhuǎn)化為幾率值、濃度轉(zhuǎn)化成對數(shù)值后進(jìn)行線性回歸，然后根據(jù)回歸方程計算拒食中濃度afc5q。按照上述方法進(jìn)行測試發(fā)現(xiàn)山石榴甙I-III對小菜蛾具有不同程度的抑制作用，結(jié)果見表2。表2山石榴甙I-III對小菜蛾的拒食作用樣品毒力回歸方程(二ffiIf山石播試Y=4.67262+0.13^22680.985yγπI721χ山石榴試Υ=4.29979+0.23術(shù)丄扮請^II529χ山石榴甙Υ=4·67262+0·13TTT^01608.41680.9518_ΠΙ_72Ix_權(quán)利要求通式為的三萜皂甙類化合物其中，R1為Xyl或Rha；R2為H或Glu。FSA00000105862200011.tif2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中當(dāng)R1為Xyl，R2為H或Glu；當(dāng)R1為Rha,R2為Glu。3.制備權(quán)利要求2的三萜皂甙化合物的方法，其特征包括以下的步驟(1)、山石榴材料陰干后粉碎，先用95%乙醇室溫浸泡提取三次，每次2天，然后用50%乙醇加熱回流提取三次，每次6小時，提取液合并，減壓濃縮得浸膏，備用；(2)、將步驟(1)得到的浸膏加適量水溶解，依次用等體積的石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取分部。(3)、將步驟(2)得到的正丁醇萃取部分經(jīng)大孔吸附樹脂DlOl層析，洗脫液依次用水、30%,60%,95%乙醇水溶液。(4)、步驟(3)中得到95%乙醇水溶液部分洗脫樣品用氯仿-甲醇為洗脫液進(jìn)行正相硅膠柱(100-200目)層析，按照體積比982到5050進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析TLC追蹤合并組分，將在TLC上用體積比73的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)(Iml中加一滴水)展開的組分通過高效液相色譜(0DS柱)以甲醇-水-磷酸(65350.1)洗脫純化得到化合物I；或者，在步驟(3)中得到60%乙醇水溶液部分洗脫樣品用氯仿-甲醇為洗脫液進(jìn)行正相硅膠柱(100-200目)層析，按照體積比9010到5050進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析TLC追蹤合并組分，將在TLC上用體積比73的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)(Iml中加一滴水)展開的組分通過正相硅膠柱(200-300目)用氯仿甲醇水(80205)洗脫，然后通過高效液相色譜(0DS柱)用甲醇-水-磷酸(65350.1)洗脫純化得到化合物II和化合物III。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是步驟(1)中所述提取方法包括95%乙醇室溫浸泡提取和50%乙醇加熱回流提取兩種提取方法；步驟(4)和(5)中高效液相色譜儀是Waters-600型配備Waters-996二極管陣列紫外檢測器，其中ODS柱型號0DS-5-A，尺寸是250XIOmmjym；在分析和制備用流動相中加入1%。磷酸。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其中TLC層析用的展開劑中加入一滴水。6.一種植物源殺蟲試劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的新三萜皂甙化合物。7.根據(jù)權(quán)利要求所述的殺蟲試劑，包括權(quán)利要求2所述的新三萜皂甙化合物中的一種或幾種。8.根據(jù)權(quán)利要求所述的殺蟲試劑，其中所述的蟲為小菜蛾幼蟲。全文摘要本發(fā)明涉及一種新三萜皂甙化合物的制備方法及其在防治小菜蛾方面的應(yīng)用。本發(fā)明的三萜皂甙是從紅樹伴生植物山石榴(Catunaregamspinosa)中經(jīng)有機(jī)溶劑提取、萃取分部后經(jīng)各種常規(guī)柱色譜和高效液相色譜分離得到，它對農(nóng)業(yè)害蟲具有一定的拒食作用，因此可以用于制備植物源殺蟲劑。文檔編號A01N45/00GK101817866SQ20101016406公開日2010年9月1日申請日期2010年5月5日優(yōu)先權(quán)日2010年5月5日發(fā)明者呂仲賢,張偲,徐紅星,鄭許松,高廣春申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院