專利名稱：：水稻品種對黑條矮縮病的敏感生育期及其在減輕病害危害上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及水稻品種對黑條矮縮病的敏感生育期及其在減輕病害危害上的應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：當(dāng)嚴重影響長江下游稻區(qū)的水稻條紋葉枯病基本被控制之際，同為灰飛虱傳播的另一種水稻病毒病——水稻黑條矮縮病又發(fā)生流行危害，該病害是由水稻黑條矮縮病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus，RBSDV)侵染水稻引發(fā)的，水稻一旦感病便無收獲。據(jù)統(tǒng)計，2007年水稻黑條矮縮病僅在江蘇省局部地區(qū)發(fā)生，危害面積30.8萬畝，至2008年已迅速在淮北、沿海和里下河地區(qū)蔓延開，全省發(fā)病面積上升至400萬畝，其中僅病株率80%以上的絕收田塊面積就達3萬畝，按平均畝產(chǎn)500公斤初步估算約損失稻谷1.5億公斤，造成了糧食減產(chǎn)、農(nóng)民減收，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的損失，同時也嚴重挫傷了農(nóng)民的種糧積極性。從植物病害流行學(xué)角度考察，水稻黑條矮縮病流行所需四大基本條件(豐富的毒源、大量的介體、大面積種植的感病品種和適宜的環(huán)境條件)已經(jīng)具備，這與2001年水稻條紋葉枯病大爆發(fā)前夕所出現(xiàn)的征兆十分相似，可以預(yù)見江蘇省乃至整個長江下游稻區(qū)水稻黑條矮縮病在未來一段時間內(nèi)具有特大爆發(fā)流行的風(fēng)險性，這將對全國的糧食安全構(gòu)成巨大威脅。在同為RBSDV引發(fā)的玉米粗縮病的綜合防治中，玉米對病害的成株期抗性的得到了很好的應(yīng)用效果(采用調(diào)整播期方法使灰飛虱發(fā)生期避開玉米敏感期的農(nóng)業(yè)措施已取得非常好的防治效果)，這啟發(fā)我們在水稻黑條矮縮病的防治中同樣可以利用寄主對病原的成株期抗性，來減輕病害造成的危害。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了水稻品種對黑條矮縮病的敏感生育期及其在減輕病害危害上的應(yīng)用方法。本發(fā)明的原理是在明確水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期的基礎(chǔ)上，在敏感生育期內(nèi)通過防治減少病原的侵染概率，而在非敏感生育期則主要利用水稻品種對病原的成株期抗性，以達到更少的防治投入獲得更好防治效果的目的。在水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期內(nèi)采用減少病原的侵染概率，而在非敏感生育期則主要利用水稻品種對病原的成株期抗性。在上述方法中，“水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期”是指水稻10葉齡之前；“物理、化學(xué)或栽培措施”是指秧苗期防蟲網(wǎng)覆蓋和適期防治灰飛虱等防治手段；“利用水稻品種對病原的成株期抗性”是指在非敏感生育期不采取針對病原的防治措施。本發(fā)明提供了水稻品種對黑條矮縮病的敏感生育期及其在減輕病害危害上的應(yīng)用方法。運用該方法在水稻黑條矮縮病的防治中，能夠以更少的防治投入獲得更好防治效果。具體實施方法實施例1，水稻品種對水稻黑條矮縮病敏感生育期①攜帶水稻黑條矮縮病毒的植株的獲得。2009年5月于江蘇邳州小麥重病區(qū)采集具有典型“綠矮”癥狀的小麥。參照Trizol(Reagent)說明書方法提取小麥總RNA。根據(jù)已發(fā)表的RBSDV的S9序列設(shè)計引物(引物由上海英俊生物技術(shù)公司合成)R5'-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3‘Fl5'-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3‘。采用RT-PCR檢測確定病株是否攜帶水稻黑條矮縮病毒。反轉(zhuǎn)錄按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)說明書進行。PCR擴增體系為cDNA模板3.OμL，Taqplus酶0.5yL，dNTP(每份10mmol.L-l)0.5yL，10XPCR緩沖液(含Mg2+)2.5μL，5，端引物(lOpmol.L-l)1.0yL，3，端引物(lOpmol.L-l)1.0μL,ddH2016.5μL，合計25μL。反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min；94°C變性Imin；51°C退火Imin；72°C延伸Imin；35個循環(huán)；最后72°C延伸10min，4°C保存，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增的目的條帶(1118bp)。同時采用斑點免疫結(jié)合法(DIBA)確定病株不攜帶水稻條紋病毒(Ricestripevirus,RSV)0挑選出6株僅含有水稻黑條矮縮病毒的小麥植株備用。②飼毒用灰飛虱的獲得2008年4-5月從江蘇農(nóng)科院小麥田中采集灰飛虱若蟲，在感病品種武育粳3號上進行飼養(yǎng)，交配后單頭雌蟲單獨產(chǎn)卵，隨機抽取群體中10%的灰飛虱采用斑點免疫結(jié)合法檢測雌蟲帶毒情況，保留不帶毒雌蟲的后代，以后每代次隨機抽取群體中10%的灰飛虱采用斑點免疫結(jié)合法檢測確保不帶毒，即獲得不攜帶RSV的灰飛虱。為避免傳毒介體污染，每次飼毒前取100只DIBA法檢測確定為無毒蟲(不攜帶RSV的灰飛虱)。③灰飛虱獲得病毒將篩選得到的病苗種于大燒杯中，土面覆蓋濾紙，將適量1-2齡無毒若蟲移入其中，并用紗布封口。飼毒2天后將蟲移入燒杯(中飼養(yǎng)預(yù)先育有武育粳3號秧苗)，13天后每批隨機取出30頭灰飛虱，提取總RNA，方法如下取單頭灰飛虱于2.OmL離心管，加300μLTrizol液搖動勻漿，室溫下放置lOmin，加入70μL的氯仿，按住管蓋劇烈搖蕩15sec，室溫放置2-3min，12000rpm離心15min，取上清液于一新離心管中，加入200μL的異丙醇(與上清等體積)，顛倒數(shù)次混勻；室溫放置lOmin，12000rpm離心lOmin，棄去上清液，再加入ImL75%酒精輕洗RNA沉淀，7500rpm離心5min，去上清，室溫干燥5-lOmin，最后溶解在于10μLDEPC預(yù)處理的水中，保存于-20°C冰箱中。再采用①所述RT-PCR方法測定灰飛虱帶毒率。④水稻品種對水稻黑條矮縮病敏感生育期的確定以水稻品種特特普和感病品種華粳6號為研究對象，將供試品種分期播種于試驗田育秧盤中，以便同時接種各個生育期水稻，待長至3-5葉齡后移栽于試驗田中，正常水肥管理，獲得葉齡期分別為2，4，6，8，10的健壯植株用于接蟲試驗(為保證秧苗不帶毒，接蟲前用無紡布罩于水稻苗上)。2-8葉齡的苗用兩頭開口玻璃管(直徑8cm，高45cm)罩住，10葉齡的苗用鐵圈支撐的紗網(wǎng)袋罩住，按8頭/苗的有效接種蟲量接入帶毒灰飛虱(有效接種蟲量=接種蟲量X帶毒率)，用尼龍紗布將玻璃管頂端封閉，48小時后向玻璃管及紗網(wǎng)袋內(nèi)噴適當(dāng)濃度的吡蟲啉水溶劑滅蟲，3小時后取走玻璃管，鐵圈及紗網(wǎng)袋，每個處理5株苗，每個處理2個重復(fù)。正常水肥管理，30天后開始病害調(diào)查，每4天調(diào)查1次，直至完全顯癥。癥狀主要表現(xiàn)為植株矮化，葉片短闊、僵直，葉色深綠，葉背的葉脈和莖稈上初現(xiàn)蠟白色，后變褐色的短條瘤狀隆起。不同葉齡期水稻接種RBSDV后發(fā)病情況如表1，結(jié)果表明在本研究的接種強度下感病品種華粳6號8葉齡以內(nèi)是其對RBSDV最敏感的時期，發(fā)病率明顯高于其他生育期。特特普6葉齡以內(nèi)是其對RBSDV最敏感的時期，發(fā)病率也明顯高于其他生育期。華粳6號與特特普10葉齡均沒有發(fā)病。兩個品種都呈現(xiàn)出隨著接種葉齡增力口，對RBSDV敏感性降低的趨勢。接種水稻完全顯癥后(2個月)，隨機選取12株水稻采用RT-PCR方法進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有典型發(fā)病癥狀的植株均能擴增到目的條帶，無發(fā)病癥狀的植株均不能擴增到目的條帶。上述結(jié)果表明水稻品種對水稻黑條矮縮病敏感生育期為水稻10葉齡以內(nèi)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例2，水稻品種對水稻黑條矮縮病敏感生育期在減輕病害危害上的應(yīng)用以水稻品種特特普和感病品種華粳6號為研究對象，將供試品種播種于試驗田育秧盤中，3-5葉齡移栽，10葉齡前用無紡布罩于水稻苗上防止灰飛虱傳播RBSDV。10葉齡時用鐵圈支撐的紗網(wǎng)袋罩住，按8頭/苗的有效接種蟲量接入帶毒灰飛虱，用尼龍紗布將玻璃管頂端封閉，48小時后向玻璃管及紗網(wǎng)袋內(nèi)噴適當(dāng)濃度的吡蟲啉水溶劑滅蟲，3小時后取走玻璃管，鐵圈及紗網(wǎng)袋，每個處理5株苗，每個處理2個重復(fù)。正常水肥管理，30天后開始病害調(diào)查，每4天調(diào)查1次，直至完全顯癥。癥狀同實施例①。結(jié)果顯示特特普和華粳6號均未表現(xiàn)出水稻黑條矮縮病的癥狀，隨機選取3株水稻采用RT-PCR方法進行檢測，均不能擴增到目的條帶。這表明在水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期覆蓋防蟲網(wǎng)可以降低病害的發(fā)生和危害；而在非敏感生育期，較高的接種強度仍然不能使水稻發(fā)病，可以利用水稻自身的成株期抗性。本發(fā)明主要服務(wù)于水稻黑條矮縮病的防治，能夠以更少的防治投入獲得更好防治效果。上述實施不以任何形式限定本發(fā)明。權(quán)利要求水稻品種對黑條矮縮病的敏感生育期及其在減輕病害危害上的應(yīng)用，其特征在于在水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期內(nèi)采用物理、化學(xué)或栽培手段減少病原的侵染概率，而在非敏感生育期則主要利用水稻品種對病原的成株期抗性。2.1中所述“水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期”是指水稻10葉齡之前；“物理、化學(xué)或栽培措施”是指秧苗期防蟲網(wǎng)覆蓋和適期防治灰飛虱等防治手段。全文摘要本發(fā)明提供了水稻品種對黑條矮縮病的敏感生育期及其在減輕病害危害上的應(yīng)用方法。在明確水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期的基礎(chǔ)上，在敏感生育期內(nèi)通過防治減少病原的侵染概率，而在非敏感生育期則主要利用水稻品種對病原的成株期抗性，以達到更少的防治投入獲得更好防治效果的目的。將本發(fā)明應(yīng)用于水稻黑條矮縮病的防治，既可以節(jié)省防治成本，又可以提高防治效率，還可以減少過度化學(xué)防治帶來的環(huán)境污染。文檔編號A01G16/00GK101822188SQ201010164250公開日2010年9月8日申請日期2010年5月6日優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日發(fā)明者吳麗娟,周彤,周益軍,程兆榜申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院