專利名稱：以幼嫩花葶作為中國水仙快繁和轉(zhuǎn)基因的外植體的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及以幼嫩花葶作為中國水仙快繁和轉(zhuǎn)基因的外植體，屬于生物技術(shù)領 域。
背景技術(shù)：
中國水仙是我國的傳統(tǒng)名花，又是出口創(chuàng)匯的一種重要花卉，以其清香、秀麗、多花而著稱，中國水仙花期正值春節(jié)時期，適水養(yǎng)雕刻，有著造型的獨特觀賞價值，以及清雅 多姿的神韻，在水仙屬花卉中獨樹一幟，馳名中外。中國水仙為三倍體，很難自然或人工雜交產(chǎn)生新品種，生產(chǎn)上存在品種單一、繁 殖速度有限、病毒積累引起品質(zhì)下降、品種退化等問題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)將是中國水仙品種改良 和新品種培育的有效手段，但目前由于主要采用鱗莖盤為轉(zhuǎn)基因外植體材料，存在消毒困 難、轉(zhuǎn)化率低，難以獲得轉(zhuǎn)基因植株等問題，制約中國水仙利用基因工程技術(shù)進行品種改良 的進程。以幼嫩花葶作為中國水仙離體快繁和轉(zhuǎn)基因的外植體還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了以幼嫩花葶作為中國水仙離體快繁和轉(zhuǎn)基因的外植體，幼嫩花葶這 一良好外植體的發(fā)現(xiàn)和利用將有效克服上述難題，成為中國水仙轉(zhuǎn)基因技術(shù)突破的關鍵。本發(fā)明使用中國水仙鱗莖中未抽蕾的幼嫩花葶作為離體快繁和轉(zhuǎn)基因的外植 體材料；所述中國水仙為未抽蕾的花球，其中花葶(連接花苞和鱗莖的總花梗)發(fā)育長于 1. 5cm ；所述外植體材料的培養(yǎng)的取材部位為幼嫩花葶下半部白色部分。培養(yǎng)方式如下
(1)取材時間花葶發(fā)育長于1.5cm的未抽蕾的花球；
(2)取材部位幼嫩花葶下半部白色部分；
(3)培養(yǎng)方式將花葶切成1-1.5mm左右薄片，形態(tài)學上端朝上放置于不定芽誘導培養(yǎng) 基中；光照培養(yǎng)，光照時間12_16h · cf1，培養(yǎng)溫度23 - 25°C，每隔IOd觀察其生長狀態(tài)，直 至誘導出不定芽；所述光照的強度為2000-3000LX。培養(yǎng)30天后不定芽分化率達95%以上，分化系數(shù)超過8。分化率=分化出不定芽的外植體/接種總外植體X 100%,
分化系數(shù)=分化不定芽的總數(shù)/分化出不定芽的外植體數(shù)X 100% ； 所述不定芽誘導固體培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基附加3 — 5mg · L-1BA^O. 3 一 0. 5mg · I^1NAA 和 3% 蔗糖。上述誘導出不定芽后，可以采用兩步法進行壯苗；所述兩步法，第一次繼代，在 無菌條件下，將有芽分化的外植體切成小塊，每塊帶2-3個芽，接到降低細胞分裂素的 培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，在第一步壯苗形成完整的小鱗莖后，將形成的完整小鱗莖轉(zhuǎn)接到完 全除去分裂素的壯苗培養(yǎng)基上進一步壯苗和生根；所述降低細胞分裂素的培養(yǎng)基配制為MS+0. 5mg · L^BA+O. 3 一 O. 5mg · L^1NAA ；所述完全除去分裂素的壯苗培養(yǎng)基為添加 0. 5mg · L^1NAA 的 MS 培養(yǎng)基。本發(fā)明利用花葶進行離體快繁，具有繁殖系數(shù)高等特點，可用于優(yōu)良種球的快速繁殖。本發(fā)明的顯著優(yōu)點本發(fā)明取材方便，材料來源多，消毒建立無菌系容易，外植體具有高頻率的再生能力，培養(yǎng)30天后不定芽分化率達95%以上，分化系數(shù)超過8，能替代目 前使用的鱗莖盤作為轉(zhuǎn)基因和快繁的外植體，克服使用鱗莖盤存在的消毒困難，轉(zhuǎn)基因效 率低的問題。
具體實施例方式以下為本發(fā)明的具體實施案例，進一步描述本發(fā)明。實施例1 1. 1材料
供試材料為3年生福建漳州水仙花花球。以花葶(連接花苞和鱗莖的總花梗)為研究材料。1.2 方法
1. 2. 1花葶不同發(fā)育時期的劃分與取材
不同發(fā)育時期的劃分中國水仙花芽分化是在7月上旬開始，8月下旬花芽花序原基 分化完成，這段時間要求較高的溫度(30°C _32°C)處理有利于花序的健壯和數(shù)目的增多。 之后是花序原基的進一步分化和發(fā)育，到11月中下旬整個鱗莖的花芽分化完成，接下來的 時期相對較低的溫度(22°C左右)利于花芽的發(fā)育。如果溫度下降到5°C以下，花芽將停滯 發(fā)育?；ㄑ糠只麄€過程在鱗莖內(nèi)完成，花芽分化完成之后花葶開始伸長生長(李文儀等， 1987 ；欒愛業(yè)，2008 ；葉季波等，1999 ；王蓮英等，1984)。根據(jù)水仙的生理生長和花芽分化的時期，將花葶分為三個時期12月份、1月份、2 月份。不同時期的花葶長度不同，取各時期花葶的幼嫩部位，12月份花葶較幼嫩可以取材 Icm左右，1月份花葶由于上部呈淺黃色取下部1-1. 5cm，2月份的花葶較長，根據(jù)幼嫩程度 取材1. 5cm左右。1.2. 2花葶的消毒和接種
取要接種的水仙鱗莖，剝除外層干枯的鱗片，切除枯根，剝外層鱗片直至還剩2-3層鱗 片包裹的花苞，在超凈工作臺先用75%的酒精中消毒30s，接著在15%-20%的NaClO中消毒 8-12min,再用無菌水漂洗3_5次。在超凈工作臺上，用鑷子和刀子刨開花苞，切除其余部位取所需花葶，橫切成 1-1. 5mm薄片，接種在準備好的培養(yǎng)基上，每隔7d觀察一次。1. 2. 3不同放置方法對花葶不定芽誘導的影響
比較橫切花葶不同放置方法對不定芽誘導的影響，形態(tài)學上端朝上放置稱為正面，形 態(tài)學下端朝上放置稱為反面。取材為1月份的花葶為外植體，接于培養(yǎng)基MS+5mg · L^BA+O. 5mg · L^1NAA上。每 個方法接種30個外植體，每隔7d左右觀察其生長狀態(tài)，60d后觀察結(jié)果。1. 2. 4不同培養(yǎng)基、不同時期對花葶不定芽誘導的影響取材為不同時期12月份、1月份、2月份的花葶作為外植體，分別接于以下培養(yǎng)基 上。12 月份和1 月份 Ml :MS+5mg · L_1BA+0. 5mg · L,AA，M2 :MS+5mg · L_1BA+0. 5mg · L ,AA+500mg · L-1 酸水解酪蛋白 +IOOmg · L-1 肌醇，M3 :MS+5mg · L_1BA+0. 3mg · L,AA， M4 :MS + 3mg · L_1BA + 0. 5mg · IZ1NAA, M5 :MS+lmg · L_1BA + 0. 5mg · IZ1NAA, M6 MS+8mg · L_1BA+0. 5mg · L,AA，M7 :MS+5mg · L_1BA+0. 5mg · L,AA+0. Img · 4_D。每個配 方接種30個外植體，每隔7d左右觀察其生長狀態(tài)，60d后觀察統(tǒng)計分化率和分化系數(shù)。1.2. 5壯苗和生根培養(yǎng)
由于花葶誘導出來的鱗莖芽較小，生長相對較慢，需要繼代2-3次才能達到生根所需 大小，本實驗采取了兩步壯苗法(欒愛業(yè)，2008)?；ㄝ憧梢婘[莖芽的形態(tài)后即進行第一次繼 代，在無菌條件下，將有芽分化的外植體切成小塊(每塊帶2-3個芽)接到降低細胞分裂素 的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，設計四種壯苗培養(yǎng)基為(I)MS+0. 5mg · L^BA+O. 3mg · L^1NAA, (II) MS+0. 5mg 'L^1NAA, (III)MS+0. 5mg I71BA+0. 5mg 'L^1NAA, (IV)MS+lmg L—BA+O. 5mg 'L-1NAA0 等分化出的芽長大后將鱗莖苗轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基MS+0. 5mg · L-1NAA上進行進一步壯苗和生根。以上培養(yǎng)基均加30g -Γ1蔗糖和7. Og-Γ1瓊脂，ρΗ=5. 8。每隔7d觀察記載1次， 60d后觀察統(tǒng)計直徑增大率。1.2.6培養(yǎng)條件
花葶直接誘導芽分化均為光照培養(yǎng)，光照16h · cf1，培養(yǎng)室溫度為(25士2) °C。1. 2. 7數(shù)據(jù)計算和處理
分化率=分化出芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)X100% ； 分化系數(shù)=分化芽總數(shù)/分化出芽的外植體數(shù)；
直徑增大率=壯苗后小球直徑-壯苗前小球直徑/壯苗前小球直徑X100%。2結(jié)果與分析
2. 1不同放置方法對花葶不定芽誘導的影響 表2. 1不同放置方法對花葶不定芽誘導的影響
據(jù)表2. 1顯示，正面接種花葶，首先與培養(yǎng)基接觸面膨大，膨大端向外翻變白漸漸長 出小突起，之后突起分化成芽，小芽變長基部膨大形成球狀小鱗莖。反面底部接觸培養(yǎng)基 處沒有膨大變白但會變褐，上端部分一些漸漸的膨大變白會有小突起，再將其正面放置突 起會分化出芽，但長勢很慢，一些頂端稍有膨大長有白色絨絨愈傷。花葶再生過程的分化 生長與花葶自身生長方向一致，正面或反面放置的花葶都是與鱗莖盤相連方向的一端分 化芽，這可能與植物生長素的極性運輸有關，由形態(tài)學的上端向形態(tài)學的下端運輸。極性 (polarity)是指植物體或植物體的一部分(如器官、組織或細胞)在形態(tài)學的兩端具有不同形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特性的現(xiàn)象。 2. 2不同激素、不同時期花葶不定芽誘導的影響
從表2. 3顯示，配方M3和M4比較，加入酸水解酪蛋白和肌醇沒有提高分化率，酸水解 酪蛋白和肌醇分別提高培養(yǎng)基氨基酸和維生素B1含量，但對于幼嫩的花葶過多的有機物質(zhì) 起著抑制作用，而且容易引起污染，12月份的花葶誘導率下降最明顯。12月份的花葶比較 配方M3和M5，隨著NAA濃度的降低，分化率沒有明顯變化都在96%以上，分化系數(shù)由8. 79 降到6. 38，但試驗過程觀察到，分化系數(shù)太高每個外植體分化出的芽比較弱，相對低一點分 化出的小球較壯。1月份的花葶分化率從80%提高到90%以上，分化系數(shù)沒有大的變化。2 月份的材料隨著NAA的下降分化率在86%以上，分化系數(shù)在4-5之間。 表2. 3不同培養(yǎng)基對12月份花葶不定芽誘導的影響
表2. 4不同培養(yǎng)基對1月份花葶不定芽誘導的影響____
表2. 5不同培養(yǎng)基對2月份花葶不定芽誘導的影響
從表2. 3、2. 4、2. 5比較12月份、1月份和2月份之間細胞分裂素的變化。12月份可以 看出隨著細胞分裂素的升高分化率和分化系數(shù)明顯增加。1月份的花葶隨著細胞分裂素的 升高分化率都在80%以上，分化系數(shù)沒有明顯變化，但有下降趨勢。2月份表明相對低濃度 的細胞分裂素有助于芽的分化。根據(jù)前面分析說明得出，隨著水仙花葶在外放置時間的延 長，花葶在不斷的生長，同時體內(nèi)的細胞分裂素將不斷地積累，所以隨著花葶的生長所需的 外界的細胞分裂素BA降低。要適當調(diào)節(jié)細胞分裂素的濃度，提高分化率和分化系數(shù)。從以上試驗看出，加入2，4-D不利于花葶不定芽的誘導，分化率和分化系數(shù)明顯 呈下降趨勢。培養(yǎng)基中加入2，4-D，花葶整個膨大松松的，整個外植體呈淺黃色，很難誘導出 不定芽，分化率大大降低。因此加入2，4-D不利于花葶不定芽的誘導。以上試驗結(jié)果表明，不同時期的花葶幼嫩程度所含激素濃度比例不同，相同激素 配比對不同時期的花葶影響不同，同一時期不同激素濃度對外植體的分化有很大影響。12 月份總的分化率和分化系數(shù)較1月份和2月份高，但12月份花葶長度較短，可取材的范 圍小，1月份和2月份的花葶長度適中，是取材的較好時期。12月份花葶以MS基本培養(yǎng) 基附加5mg · L1BA和0. 3mg · L,AA誘導不定芽較好，1月份花葶用MS附加5mg · L1BA和 0. 3mg · L-1NAA培養(yǎng)基或附加3mg · L^1BA和0. 5mg · L^1NAA培養(yǎng)基較好，而2月份花葶以MS 培養(yǎng)基附加3mg · L^1BA禾口 0. 5mg · L^1NAA較好。2. 4壯苗培養(yǎng)
外植體分化出不定芽之后，同一個外植體誘導出來的芽比較密集，每個芽都需要養(yǎng)分， 這樣芽之間養(yǎng)分競爭比較激烈，所以觀察到外植體分化出有芽的形態(tài)后即需要進行轉(zhuǎn)接繼 代?；ㄝ銊倓傉T導出來的芽還沒有完全發(fā)育成完整的小鱗莖，所以采用兩步法進行壯苗。第 一步觀察到外植體分化出白色突起鱗莖芽時，轉(zhuǎn)接時將外植體切成小塊(因分化出的不定 芽小沒有發(fā)育完全不能獨立生長，于是將外植體切成幾塊，每塊帶2-3個芽)。 表2. 6壯苗培養(yǎng)
從表2. 6看出，加入細胞分裂素小鱗莖明顯增大。第一步壯苗時誘導出的芽較弱小，轉(zhuǎn) 接到不加BA只含有一定濃度NAA的培養(yǎng)基中，易長根且小鱗莖不容易長大。1和3比較降 低生長素濃度有助于小鱗莖的膨大，但膨大不明顯。由4配方可知，高濃度的細胞分裂素不 能促進小鱗莖的增大。實驗觀察發(fā)現(xiàn)，在第一步壯苗形成完整的小鱗莖后，將形成的完整小 鱗莖轉(zhuǎn)接到完全除去分裂素的壯苗培養(yǎng)基上MS+0. 5mg · L-1NAA,在該培養(yǎng)基上，小鱗莖能夠 繼續(xù)膨大，繼續(xù)抽出新葉，當小鱗莖膨大到一定大小會生根。
權(quán)利要求
以幼嫩花葶作為中國水仙離體快繁和轉(zhuǎn)基因的外植體，其特征在于使用中國水仙鱗莖中未抽蕾的幼嫩花葶作為離體快繁和轉(zhuǎn)基因的外植體材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以幼嫩花葶作為中國水仙離體快繁和轉(zhuǎn)基因的外植體，其 特征在于所述中國水仙為未抽蕾的花球，其中花葶為連接花苞和鱗莖的總花梗，發(fā)育長于 1. 5cm0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以幼嫩花葶作為中國水仙快繁和轉(zhuǎn)基因的外植體，其特征在 于所述外植體材料的培養(yǎng)的取材部位為幼嫩花葶下半部白色部分。
4.一種如權(quán)利要求1、2或3所述的外植體的培養(yǎng)，其特征在于培養(yǎng)方式如下(1)取材時間花葶發(fā)育長于1.5cm的未抽蕾的花球；(2)取材部位幼嫩花葶下半部白色部分；(3)培養(yǎng)方式將花葶切成1-1.5mm薄片，形態(tài)學上端朝上放置于不定芽誘導培養(yǎng)基 中；光照培養(yǎng)，光照時間12_16h · cf1，培養(yǎng)溫度23 - 25°C，每隔IOd觀察其生長狀態(tài)，直至 誘導出不定芽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的外植體的培養(yǎng)，其特征在于步驟(3)所述光照的強度為 2000-3000Lx。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的外植體的培養(yǎng)，其特征在于所述不定芽誘導固體培養(yǎng)基成 分為MS基本培養(yǎng)基附加3 — 5mg · L-1BAj. 3 — 0. 5mg · L^1NAA和3%蔗糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了以幼嫩花葶作為中國水仙離體快繁和轉(zhuǎn)基因的外植體，使用中國水仙鱗莖中未抽蕾的幼嫩花葶作為離體快繁和轉(zhuǎn)基因的外植體材料。本發(fā)明的培養(yǎng)方式為取花葶發(fā)育長于1.5cm的未抽蕾的花球；將幼嫩花葶下半部白色部分切成1-1.5mm薄片，形態(tài)學上端朝上放置于不定芽誘導培養(yǎng)基中；光照培養(yǎng)，光照時間12-16h·d-1，培養(yǎng)溫度23－25℃。本發(fā)明利用花葶進行離體快繁，具有繁殖系數(shù)高等特點，可用于優(yōu)良種球的快速繁殖。本發(fā)明取材方便，材料來源多，消毒建立無菌系容易，外植體具有高頻率的再生能力，培養(yǎng)30天后不定芽分化率達95％以上，分化系數(shù)超過8，能替代目前使用的鱗莖盤作為轉(zhuǎn)基因和快繁的外植體，克服使用鱗莖盤存在的消毒困難，轉(zhuǎn)基因效率低的問題。
文檔編號A01H4/00GK101843219SQ201010164410
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者曾黎輝 申請人:福建農(nóng)林大學