專利名稱：一種建立巨桉四倍體植株的誘導(dǎo)及培育體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于林業(yè)生物技術(shù)育種領(lǐng)域或植物細(xì)胞工程領(lǐng)域，特別涉及提出了一種建 立巨桉無性系Eg5多倍體誘導(dǎo)及培育體系的方法。
背景技術(shù)：
巨桉(Eucalyptus grandis)是桉屬雙蒴蓋亞屬橫脈組柳桉系中的高大喬木，原分 布于澳大利亞東海岸。它生長(zhǎng)迅速，造林后10年內(nèi)樹高年生長(zhǎng)量可達(dá)2-3m，干形通直，圓 滿，可廣泛用于造紙、建筑、人造板和薪炭林等用途。因此，它是速生豐產(chǎn)林的最常用的樹種 之一，也是栽培面積最大的桉樹種之一。巨桉現(xiàn)已廣泛種植于我國(guó)南方的福建、四川、云南、 湘南、贛南和兩廣北部亞熱帶地區(qū)。巨桉Eg5 (良種編號(hào)閩S-SC-EG-005-2007)是福建永安林業(yè)集團(tuán)選育的巨桉優(yōu)良 無性系，已通過福建省林木品種審定委員會(huì)審定，由福建省林業(yè)廳予以公告，并受到良種保 護(hù)法規(guī)的保護(hù)。經(jīng)過倍性育種育成的多倍體植物一般具有以下2個(gè)典型特征1)器官的“巨大 性”，如植物莖桿、葉片、花、果實(shí)、細(xì)胞、氣孔等均較大，因此，可以提高作物產(chǎn)量；2)抗逆性 增強(qiáng)，如增強(qiáng)作物的抗病、抗旱、抗寒性，使作物適應(yīng)性變廣。因此，多倍體育種在農(nóng)林業(yè)生 產(chǎn)中有非常積極的意義。桉樹是一種外來物種，并且，根據(jù)胡洲鶴的研究結(jié)果，使用簡(jiǎn)單的秋水仙素處理后 染色體只在原有的22條的基礎(chǔ)上增加了 3 5條，并沒有實(shí)現(xiàn)加倍。使用譚德冠在剛果12 號(hào)桉上的誘導(dǎo)方法，用不同濃度的秋水仙素(其中添加了滲透劑二甲基亞砜)來誘導(dǎo)巨桉 芽的多倍體，只得到20% 30%的誘導(dǎo)率，誘導(dǎo)率過低。

發(fā)明內(nèi)容
為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種建立巨桉四倍 體植株的誘導(dǎo)及培育體系的方法；該方法使誘導(dǎo)率達(dá)到60%以上。并且，針對(duì)在秋水仙素 處理后莖段出現(xiàn)的玻璃化現(xiàn)象，設(shè)計(jì)了專用的培養(yǎng)基，能有效抑制玻璃化現(xiàn)象的出現(xiàn)，獲得 了健壯的大田移栽生根苗。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種建立巨桉四倍體植株的誘導(dǎo)及培育體 系的方法。該方法包括以下操作步驟(1)將巨桉無菌組培苗帶有腋芽或頂芽的莖段置于裝有處理液的容器中，所述處 理液含有質(zhì)量百分比濃度為0. 1 0. 5%的秋水仙素和質(zhì)量百分比濃度為5 12%的助劑 SD ；將容器密閉后置于搖床上以80 120r/min的振蕩速度，在35 40°C條件下加倍處理 12 18小時(shí)；處理完畢后，使用無菌水沖洗莖段，直至完全除去秋水仙素殘留液，得到經(jīng)過 加倍處理的莖段；(2)將經(jīng)過加倍處理的莖段接種到專用增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔15 20天即 轉(zhuǎn)接到新配制的增殖培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接3 5次后再進(jìn)行生根培養(yǎng)；
所述增殖培養(yǎng)基由以下按質(zhì)量體積比計(jì)的組分組成硝酸鈣 (Ca(NO3)2 ·4Η20)537 576mg/L，硝酸鉀(KNO3) 480 520mg/L，硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20)355 390mg/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 150 190mg/L，氯化鈣(CaCl2 · 2H20) 77 116mg/L，硫酸錳 (MnSO4 · 4H20) 20. 2 24. 5mg/L,硫酸鋅(ZnSO4 · 7Η20) 7. 7 11. 6mg/L,硼酸(H3BO3) 5. 4 7. 2mg/L，硫酸銅(CuSO4 ·5Η20)0· 018 0. 029mg/L，鉬酸鈉(Na2MOO4 ·2Η20)0· 19 0. 38mg/ L，硫酸亞鐵(FeSO4 ·7Η20)25. 3 29. 4mg/L,乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA) 35. 3 38. 6mg/ L，根皮苷2 4mg/L，鹽酸硫胺素(νΒ^Ο.ΟΘ〗 0. 112mg/L，鹽酸吡哆辛(VB6)0.41 0. 58mg/L,煙酸(VB5) 0. 39 0. 61mg/L,甘氨酸 1. 5 2. 4mg/L,肌醇 91 112mg/L,核黃 素(VB2) 5. 0 7. Omg/L,激動(dòng)素(KT) 0. 4 0. 6mg/L，萘乙酸(NAA) 0. 15 0. 25mg/L,瓊脂 6100 6800mg/L和蔗糖30000 45000mg/L，余量為蒸餾水。所述步 驟(1)和步驟(2)是在無菌條件下進(jìn)行操作。所述增殖培養(yǎng)基優(yōu)選由以下按質(zhì)量體積比計(jì)的組分組成硝酸鈣556mg/L，硝酸 鉀500mg/L，硫酸鎂370mg/L，磷酸二氫鉀170mg/L，氯化鈣96mg/L、硫酸錳22. 5mg/L、硫酸 鋅 8. 6mg/L,硼酸 6. 2mg/L,硫酸銅 0. 025mg/L,鉬酸鈉 0. 25mg/L,硫酸亞鐵 27. 3mg/L,乙二 胺四乙酸二鈉37. 3mg/L，根皮苷2. 5mg/L，鹽酸硫胺素0. lmg/L，鹽酸吡哆辛0. 5mg/L，煙酸 0. 5mg/L，甘氨酸 2. Omg/L,肌醇 100mg/L，核黃素 6. 0mg/L,激動(dòng)素 0. 5mg/L,萘乙酸 0. 2mg/L, 瓊脂6800mg/L和蔗糖45000mg/L，余量為蒸餾水。步驟(1)所述莖段的長(zhǎng)度為0. 7 1. 3cm。步驟(1)所述處理液的用量為每IOOmL處理液處理20 30枚莖段。步驟(2)所述生根培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基由以下按質(zhì)量體積比計(jì)的組分組成硝酸 鉀(KNO3) 614 654mg/L，硝酸銨(NH4NO3) 530 570mg/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 47 67mg/ L,硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 113 133mg/L，氯化鈣(CaCl2 · 2H20) 137 157mg/L，碘化鉀 (KI) 0. 8 0. 9mg/L,硼酸(H3BO3) 5. 2 7. 2mg/L,硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 20. 3 24. 5mg/ L,硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 7. 6 9. 4mg/L，鉬酸鈉(Na2MoO4 · 2H20) 0. 2 0. 3mg/L，硫酸銅 (CuSO4 ·5Η20)0· 02 0. 03mg/L，氯化鈷(CoCl2 ·6Η20)0· 02 0. 03mg/L,乙二胺四乙酸二鈉 (Na2 'EDTA) 34. 3 40. 3mg/L，硫酸亞鐵(FeSO4 ·7Η20)25· 8 29. 8mg/L，肌醇 90 IlOmg/ L,甘氨酸1. 6 2. 6mg/L,鹽酸硫胺素(VB1)O. 08 0. 12mg/L,鹽酸吡哆醇(VB6)O. 4 0. 6mg/L,煙酸(VB5) 0. 4 0. 6mg/L,吲哚丁酸(IBA) 0. 42 0. 62mg/L, ABT 生根粉 0. 39 0. 69mg/L，蔗糖25000 40000mg/L和瓊脂6100 6800mg/L，余量為蒸餾水。步驟(1)所述巨桉為審定品種Eg5無性系。本發(fā)明以巨桉無性系組培苗的腋芽和頂芽為處理材料，用秋水仙素處理，進(jìn)行染 色體加倍；然后將處理后的腋芽及頂芽著生的莖段置入特制專用培養(yǎng)基中，使其健康的生 長(zhǎng)發(fā)育，生根后轉(zhuǎn)入大田移栽，煉苗后即可出圃造林。在巨桉使用秋水仙素的誘導(dǎo)過程中，如果想獲得較高的誘導(dǎo)率，就需要提高秋水 仙素的濃度或延長(zhǎng)秋水仙素溶液的浸泡時(shí)間；但是，這樣做會(huì)導(dǎo)致待處理的嫩芽死亡，而嫩 芽的死亡又會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)率的降低；并且，單一使用秋水仙素溶液會(huì)導(dǎo)致在誘導(dǎo)處理后有較 多嵌合體的出現(xiàn)。所以，需要在處理時(shí)加入滲透劑。在滲透劑和秋水仙素溶液混用的情況 下，可以使用較低的秋水仙素溶液或縮短處理時(shí)間，從而降低死亡率，同時(shí)，這也有效地減 少了嵌合體的出現(xiàn)。但是，現(xiàn)有的二甲基亞砜、二甲基乙酰胺或氮酮等滲透劑，作用效果不理想，在誘導(dǎo)率上并沒有顯著的提高。結(jié)合國(guó)內(nèi)外最新研究成果，本發(fā)明創(chuàng)新性的把原來用作除草劑助劑的SD助劑(其 有效成分是一種三萜甙類化合物)作為滲透劑，達(dá)到了滿意的效果。與使用二甲基亞砜相 比，使用助劑SD，誘導(dǎo)率可以從35%顯著地提升到60% ；而使用二甲基亞砜時(shí)，達(dá)到最高 誘導(dǎo)率時(shí)的秋水仙素溶液濃度為0. 25%，但如果使用SD，達(dá)到最高誘導(dǎo)率時(shí)使用的秋水仙 素溶液的濃度僅為0. 15% ；不管是在小規(guī)模實(shí)驗(yàn)過程中，還是為了滿足大規(guī)模工廠化生產(chǎn) 需要而實(shí)施的誘導(dǎo)過程，往往需要大量芽的誘導(dǎo)，這就需要使用較多的秋水仙素，但秋水仙 素價(jià)格昂貴一般為350 400元/克。因此，為了達(dá)到最大誘導(dǎo)率，秋水仙素使用濃度從 0. 25%降到0. 15%，且明顯地節(jié)省了生產(chǎn)成本。與現(xiàn)已公開報(bào)道的秋水仙素四倍體誘導(dǎo)方法相比，本發(fā)明方法還有以下創(chuàng)新處 理時(shí)的溫度不采用常溫，而是35 40°C的高溫。因?yàn)榫掼窦?xì)胞的有絲分裂與溫度關(guān)系較為 密切，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，細(xì)胞的有絲分裂越旺盛，處于分裂前期的細(xì)胞會(huì)增多， 而秋水仙素只對(duì)處于分裂前期的細(xì)胞起作用，產(chǎn)生加倍效果。所以，溫度升高會(huì)使誘導(dǎo)率提 高。另外，溫度適度升高，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜和外界的物質(zhì)交換活躍，細(xì)胞膜透性有一定程度 的增大，促使秋水仙素溶液更容易到達(dá)待處理部位，增強(qiáng)誘導(dǎo)效果。但溫度過高，會(huì)造成高 溫脅迫效應(yīng)，導(dǎo)致植物生理活動(dòng)出現(xiàn)紊亂，酶失活，甚至蛋白質(zhì)變性等不良后果，有可能致 使待誘導(dǎo)的莖段死亡，從而導(dǎo)致了誘導(dǎo)率的降低。因?yàn)榍锼伤靥幚韺?duì)植物而言是一種逆境，所以，即使是加倍成功的誘導(dǎo)芽，往往 也呈現(xiàn)出生長(zhǎng)勢(shì)弱、畸形、玻璃化、不易成活等現(xiàn)象，導(dǎo)致加倍成功的誘導(dǎo)芽不能夠正常的 生長(zhǎng)和發(fā)育，不能夠生存下來。使用巨桉Eg5加倍前可以正常生長(zhǎng)發(fā)育的培養(yǎng)基無法實(shí)現(xiàn) 加倍處理后幼苗的扶壯，所以，需要研制專門培養(yǎng)基用于扶壯處理后的植株。本發(fā)明專用培 養(yǎng)基具有如下優(yōu)點(diǎn)⑴加入了 2 4mg/L的根皮苷；(2)不含有NH4+離子，培養(yǎng)基中的氮含 量低；(3)細(xì)胞分裂素使用激動(dòng)素而不是6-芐基腺嘌呤；(4)蔗糖濃度提高到45000mg/L ； (5)不是在Ms或其它培養(yǎng)基基礎(chǔ)上的簡(jiǎn)單的物質(zhì)用量的改變，而是對(duì)Ms培養(yǎng)基中所使用的 化學(xué)試劑進(jìn)行了變換。使用其它培養(yǎng)基，無法將苗的玻璃化率(玻璃化的苗/苗總數(shù))降 低到50%以下，而采用本發(fā)明使用的專用培養(yǎng)基，則可將誘導(dǎo)苗的玻璃化率降低到了 5% 以下；并且，對(duì)誘導(dǎo)苗也有明顯的扶壯效果，使弱苗數(shù)量從30%降低到5%以下。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下的優(yōu)勢(shì)(1)本發(fā)明創(chuàng)新性的將一種除草劑助劑SD用到了秋水仙素的誘導(dǎo)過程中，可以使 用較低的秋水仙素濃度達(dá)到最大誘導(dǎo)率，節(jié)省用量；另外，使用SD替代了氮酮、二甲基亞砜 等傳統(tǒng)滲透劑，誘導(dǎo)率達(dá)到60 65%。(2)本發(fā)明的技術(shù)方案構(gòu)成了一個(gè)誘導(dǎo)和組培快繁合為一體的技術(shù)體系，使具有 生長(zhǎng)速度顯著加快的多倍體苗不僅能夠產(chǎn)生，而且能夠培育成活，形成一棵健壯的小苗，用 于林業(yè)生產(chǎn)。(3)在加倍處理時(shí)，使用的莖段長(zhǎng)度為0. 7 1. 3cm，然后，經(jīng)過3 5次轉(zhuǎn)接，進(jìn) 行了生根培養(yǎng)和大田移栽后，已經(jīng)長(zhǎng)成20 30cm高的植株，取其新生的幼嫩根尖和頂端的 莖生長(zhǎng)點(diǎn)，檢測(cè)其染色體數(shù)均為4x，非嵌合體和二倍體——此時(shí)，進(jìn)行誘導(dǎo)率的統(tǒng)計(jì)，所以， 本發(fā)明方法的染色體加倍效果好、且穩(wěn)定可靠。


圖1為莖尖染色體計(jì)數(shù)的顯微鏡觀察圖，其中a為未經(jīng)誘導(dǎo)處理的植株，b為經(jīng)本 發(fā)明誘導(dǎo)處理的植株。圖2 為根尖染色體計(jì)數(shù)的顯微鏡觀察圖，其中a為未經(jīng)誘導(dǎo)處理的植株，b為經(jīng)本 發(fā)明誘導(dǎo)處理的植株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)例與附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的敘述，但本發(fā)明的實(shí)施方法 靈活，不僅僅限于此例所述的具體操作方式。實(shí)施例1(1)將20枚巨桉Eg5無菌組培苗的帶有腋芽或頂芽的莖段(莖段長(zhǎng)度為0. 7 1. 3cm)置于裝有IOOmL處理液的容器中，所述處理液含有質(zhì)量百分比濃度為0. 的秋水 仙素和質(zhì)量百分比濃度為5%的助劑SD (南通飛天化學(xué)實(shí)驗(yàn)有限公司生產(chǎn))；將容器密閉后 置于搖床上以lOOr/min的振蕩速度，在40°C條件下加倍處理12小時(shí)；處理完畢后，使用無 菌水沖洗莖段，直至完全除去秋水仙素殘留液，得到經(jīng)過加倍處理的莖段；(2)將經(jīng)過加倍處理的莖段接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔18天即轉(zhuǎn)接到新 配制的增殖培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接3次后再進(jìn)行生根培養(yǎng)；所述增殖培養(yǎng)基由以下按質(zhì)量體積比計(jì)的組分組成硝酸鈣556mg/L，硝酸鉀 500mg/L,硫酸鎂370mg/L，磷酸二氫鉀170mg/L，氯化鈣96mg/L、硫酸錳22. 5mg/L、硫酸鋅 8. 6mg/L，硼酸 6. 2mg/L,硫酸銅 0. 025mg/L,鉬酸鈉 0. 25mg/L,硫酸亞鐵 27. 3mg/L,乙二胺 四乙酸二鈉37. 3mg/L,根皮苷2. 5mg/L,鹽酸硫胺素0. lmg/L,鹽酸吡哆辛0. 5mg/L,煙酸 0. 5mg/L，甘氨酸 2. Omg/L，肌醇 100mg/L，核黃素 6. Omg/L，激動(dòng)素 0. 5mg/L，萘乙酸 0. 2mg/L, 瓊脂6800mg/L和蔗糖45000mg/L，余量為蒸餾水。所述生根培養(yǎng)基由以下按質(zhì)量體積比計(jì)的組分組成硝酸鉀634mg/L，硝酸銨 550mg/L,磷酸二氫鉀57mg/L，硫酸鎂123mg/L，氯化鈣147mg/L，碘化鉀0. 83mg/L,硼酸 6. 2mg/L，硫酸錳22. 3mg/L,硫酸鋅8. 6mg/L,鉬酸鈉0. 25mg/L,硫酸銅0. 025mg/L,氯化鈷
0.025mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37. 3mg/L，硫酸亞鐵27. 8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/ L,鹽酸硫胺素0. lmg/L,鹽酸吡哆醇0. 5mg/L,煙酸0. 5mg/L,吲哚丁酸0. 5mg/L，ABT生根粉 (北京艾比蒂研究開發(fā)中心生產(chǎn))0. 5mg/L，蔗糖30000mg/L和瓊脂6500mg/L，余量為蒸餾 水；以上操作均是在無菌條件下進(jìn)行的，以防止待處理組培苗的污染。實(shí)施例2(1)將30枚巨桉Eg5無菌組培苗的帶有腋芽或頂芽的莖段(莖段長(zhǎng)度為0. 7
1.3cm)置于裝有IOOmL處理液的容器中，所述處理液含有質(zhì)量百分比濃度為0. 3%的秋水 仙素和質(zhì)量百分比濃度為8%的助劑SD (南通飛天化學(xué)實(shí)驗(yàn)有限公司生產(chǎn))；將容器密閉后 置于搖床上以80r/min的振蕩速度，在35°C條件下加倍處理18小時(shí)；處理完畢后，使用無 菌水沖洗莖段，直至完全除去秋水仙素殘留液，得到經(jīng)過加倍處理的莖段；(2)將經(jīng)過加倍處理的莖段接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔20天即轉(zhuǎn)接到新 配制的增殖培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接4次后再進(jìn)行生根培養(yǎng)；
所述增殖培養(yǎng)基由以下按質(zhì)量體積比計(jì)的組分組成硝酸鈣537mg/L，硝酸鉀 480mg/L,硫酸鎂355mg/L，磷酸二氫鉀150mg/L，氯化鈣77mg/L，硫酸錳20. 2mg/L,硫酸鋅 7. 7mg/L，硼酸 5. 4mg/L,硫酸銅 0. 018mg/L,鉬酸鈉 0. 19mg/L,硫酸亞鐵 25. 3mg/L,乙二胺 四乙酸二鈉35. 3mg/L,根皮苷2mg/L，鹽酸硫胺素0. 092mg/L,鹽酸吡哆辛0. 41mg/L,煙酸 0. 39mg/L，甘氨酸 1. 5mg/L，肌醇 91mg/L，核黃素 5. Omg/L，激動(dòng)素 0. 4mg/L，萘乙酸 0. 15mg/ L，瓊脂6100mg/L和蔗糖30000mg/L，余量為蒸餾水；所述生根培養(yǎng)采用的生根培養(yǎng)基由以下按質(zhì)量體積比計(jì)的組分組成硝酸鉀 614mg/L,硝酸銨530mg/L，磷酸二氫鉀47mg/L，硫酸鎂113mg/L，氯化鈣137mg/L，碘化鉀
0.8mg/L，硼酸 5. 2mg/L,硫酸錳 20. 3mg/L,硫酸鋅 7. 6mg/L,鉬酸鈉 0. 2mg/L,硫酸銅 0. 02mg/ L，氯化鈷0. 02mg/L,乙二胺四乙酸二鈉34. 3mg/L，硫酸亞鐵25. 8mg/L，肌醇90mg/L，甘氨酸
1.6mg/L，鹽酸硫胺素0. 08mg/L,鹽酸吡哆醇0. 4mg/L,煙酸0. 4mg/L,吲哚丁酸0. 42mg/L, ABT生根粉(北京艾比蒂研究開發(fā)中心生產(chǎn))0. 39mg/L，蔗糖25000mg/L和瓊脂6100mg/L， 余量為蒸餾水；以上操作均是在無菌條件下進(jìn)行的，以防止待處理組培苗的污染。實(shí)施例3(1)將25枚巨桉Eg5無菌組培苗的帶有腋芽或頂芽的莖段(莖段長(zhǎng)度為0. 7
I.3cm)置于裝有IOOmL處理液的容器中，所述處理液含有質(zhì)量百分比濃度為0. 5%的秋水 仙素和質(zhì)量百分比濃度為12%的助劑SD(南通飛天化學(xué)實(shí)驗(yàn)有限公司生產(chǎn))；將容器密閉 后置于搖床上以120r/min的振蕩速度，在38°C條件下加倍處理15小時(shí)；處理完畢后，使用 無菌水沖洗莖段，直至完全除去秋水仙素殘留液，得到經(jīng)過加倍處理的莖段；(2)將經(jīng)過加倍處理的莖段接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔15天即轉(zhuǎn)接到新 配制的增殖培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接5次后再進(jìn)行生根培養(yǎng)；所述增殖培養(yǎng)基由以下按質(zhì)量體積比計(jì)的組分組成硝酸鈣576mg/L，硝酸鉀 520mg/L，硫酸鎂390mg/L，磷酸二氫鉀190mg/L，氯化鈣116mg/L，硫酸錳24. 5mg/L，硫酸鋅
II.6mg/L,硼酸 7. 2mg/L,硫酸銅 0. 029mg/L,鉬酸鈉 0. 38mg/L,硫酸亞鐵 29. 4mg/L,乙二胺 四乙酸二鈉38. 6mg/L,根皮苷4mg/L，鹽酸硫胺素0. 112mg/L,鹽酸吡哆辛0. 58mg/L,煙酸 0. 61mg/L,甘氨酸 2. 4mg/L,肌醇 112mg/L，核黃素 7. Omg/L,激動(dòng)素 0. 6mg/L，萘乙酸 0. 25mg/ L，瓊脂6800mg/L和蔗糖45000mg/L，余量為蒸餾水；所述生根培養(yǎng)采用的生根培養(yǎng)基由以下按質(zhì)量體積比計(jì)的組分組成硝酸鉀 654mg/L,硝酸銨570mg/L，磷酸二氫鉀67mg/L，硫酸鎂133mg/L，氯化鈣157mg/L，碘化鉀 0. 9mg/L，硼酸 7. 2mg/L,硫酸錳 24. 5mg/L,硫酸鋅 9. 4mg/L,鉬酸鈉 0. 3mg/L,硫酸銅 0. 03mg/ L，氯化鈷0. 03mg/L,乙二胺四乙酸二鈉40. 3mg/L，硫酸亞鐵29. 8mg/L，肌醇110mg/L，甘氨 酸2. 6mg/L，鹽酸硫胺素0. 12mg/L，鹽酸吡哆醇0. 6mg/L，煙酸0. 6mg/L，吲哚丁酸0. 62mg/L, ABT生根粉(北京艾比蒂研究開發(fā)中心生產(chǎn))0. 69mg/L，蔗糖40000mg/L和瓊脂6800mg/L， 余量為蒸餾水；以上操作均是在無菌條件下進(jìn)行的，以防止待處理組培苗的污染。實(shí)施例4將實(shí)施例1所得的生根培養(yǎng)后的巨桉苗進(jìn)行大田移栽，長(zhǎng)成20 30cm高的植株 后，觀察形態(tài)發(fā)生變異(這種形態(tài)上的變異有與未經(jīng)誘導(dǎo)的植株相比，葉面積變大15% 40%，葉色深綠，葉片變厚5% 10%;莖變粗7% 14%，節(jié)間縮短10% 22% )的植株， 取其新生的幼嫩根尖和頂端的莖尖進(jìn)行以下處理和顯微觀察莖尖染色體壓片及計(jì)數(shù)法于上午9:00取下幼嫩莖頂端的生長(zhǎng)點(diǎn)，并立即置于 18°c，0. 002mol/L的8-羥基喹啉溶液中預(yù)處理3小時(shí)，使用蒸餾水清洗3遍，再用乙醇冰 醋酸=3 1體積比的卡諾氏固定液在4°C條件下固定10h，取出后用蒸餾水清洗3遍，置 于lmol/L的鹽酸溶液中在60°C條件下解離12分鐘，使用蒸餾水清洗5 6遍，使用卡寶品 紅染色15分鐘后壓片，使用光學(xué)顯微透鏡觀察染色體數(shù)，結(jié)果如圖1所示，a為未經(jīng)誘導(dǎo)處 理的2倍體植株的莖尖染色體計(jì)數(shù)的顯微鏡觀察圖，b為經(jīng)本發(fā)明誘導(dǎo)處理的植株的莖尖 染色體計(jì)數(shù)的顯微鏡觀察圖，可觀察到染色體增倍，即為4倍體。根尖染色體壓片及計(jì)數(shù)法在 中午12:00取待測(cè)植株的根尖最前端的分生區(qū)部分 使用0. 2%的秋水仙素預(yù)處理2小時(shí)，然后，使用Camoy固定液固定15-18小時(shí)，置于lmol/ L的稀鹽酸溶液中在60°C恒溫水浴中酸化6分鐘，然后，置于載玻片上，滴加改良石碳酸品 紅染液染色30分鐘后，蓋上蓋玻片，使用橡皮擦輕敲蓋片，然后，使用光學(xué)透視顯微鏡放大 1000倍觀察染色體數(shù)目，結(jié)果如圖2所示，a為未經(jīng)誘導(dǎo)處理的2倍體植株的根尖染色體 計(jì)數(shù)的顯微鏡觀察圖，b為經(jīng)本發(fā)明誘導(dǎo)處理的植株的根尖染色體計(jì)數(shù)的顯微鏡觀察圖，可 觀察到染色體增倍，即為4倍體。上文中所述的改良石碳酸品紅溶液的制備方法為1)配 制原液A 取3g堿性品紅溶于IOOmL體積分?jǐn)?shù)70%的酒精中，可長(zhǎng)期保存；2)配制原液B : 取IOmL原液A加入90mL體積分?jǐn)?shù)為5%的石炭酸水溶液；3)配制染色液取45mL原液B 加入6mL冰醋酸和6mL體積分?jǐn)?shù)37%的甲醛；4)配制改良石炭酸品紅溶液取上述染色液 2 101^，加入90 98mL的體積分?jǐn)?shù)45%的醋酸和1. 8g山梨醇；5)所得改良石碳酸品紅 溶液染液放置2周后使用。實(shí)施例5使用流式細(xì)胞儀確認(rèn)染色體加倍操作步驟分為3步(1)細(xì)胞核懸液制備稱取100 500mg實(shí)施例1所得的生根培養(yǎng)后的巨桉苗的嫩 莖及幼葉，在滴有2ml提取緩沖液的培養(yǎng)皿中研碎，260目尼龍網(wǎng)篩過濾，lOOOr/min條件下 離心及漂洗3次，收集沉積細(xì)胞，以備染色。上述提取緩沖液成分15mmol/L Tris-HCl (pH 值為 7. 5)，80mmol/L KCl,20mmol/L NaCl，0. 20mol/L EDTA-Na2,15mmol/L 的巰基乙醇和 0. 05% 的 TritonX-100。(2)染色體的特異性染色制備的核懸液離心后棄去上層清液，加入2mL染色緩 沖液，黑暗常溫條件下染色30min。500目尼龍網(wǎng)篩過濾，濾液用流式細(xì)胞儀專用的標(biāo)準(zhǔn)試 管收集后，隨即上機(jī)測(cè)定。上述染色緩沖液成分提取緩沖液+3000U/mLRNA酶A+lOug/mL PI (溴化乙錠)。(3)使用美國(guó) BECT0N-DICKINS0N 公司，型號(hào)為 Racs vantageSE DIVA 的流式細(xì)胞 儀進(jìn)行倍性測(cè)定。使用二倍體巨桉無性系Eg5的DNA含量為對(duì)照。該流式細(xì)胞儀的激發(fā)光 源可激發(fā)經(jīng)熒光染色的染色體DNA分子發(fā)出熒光，然后，測(cè)定裝置檢測(cè)激發(fā)出的熒光強(qiáng)度， 與測(cè)定裝置相連的計(jì)算機(jī)分析軟件可對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，得出熒光強(qiáng)度和植株DNA相對(duì) 含量間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，待測(cè)四倍體植株中細(xì)胞的DNA相對(duì)含量為對(duì)照植株DNA相對(duì)含量的 2倍。由此可以確認(rèn)待測(cè)的巨桉苗為四倍體植株。
上述實(shí)施例 為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種建立巨桉四倍體植株的誘導(dǎo)及培育體系的方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)將巨桉無菌組培苗帶有腋芽或頂芽的莖段置于裝有處理液的容器中，所述處理液含有質(zhì)量百分比濃度為0.1～0.5％的秋水仙素和質(zhì)量百分比濃度為5～12％的助劑SD；將容器密閉后置于搖床上以80～120r/min的振蕩速度，在35～40℃條件下加倍處理12～18小時(shí)；處理完畢后，使用無菌水沖洗莖段，直至完全除去秋水仙素殘留液，得到經(jīng)過加倍處理的莖段；(2)將經(jīng)過加倍處理的莖段接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔15～20天即轉(zhuǎn)接到新配制的增殖培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接3～5次后再進(jìn)行生根培養(yǎng)；所述增殖培養(yǎng)基由以下按質(zhì)量體積比計(jì)的組分組成硝酸鈣537～576mg/L，硝酸鉀480～520mg/L，硫酸鎂355～390mg/L，磷酸二氫鉀150～190mg/L，氯化鈣77～116mg/L，硫酸錳20.2～24.5mg/L，硫酸鋅7.7～11.6mg/L，硼酸5.4～7.2mg/L，硫酸銅0.018～0.029mg/L，鉬酸鈉0.19～0.38mg/L，硫酸亞鐵25.3～29.4mg/L，乙二胺四乙酸二鈉35.3～38.6mg/L，根皮苷2～4mg/L，鹽酸硫胺素0.092～0.112mg/L，鹽酸吡哆辛0.41～0.58mg/L，煙酸0.39～0.61mg/L，甘氨酸1.5～2.4mg/L，肌醇91～112mg/L，核黃素5.0～7.0mg/L，激動(dòng)素0.4～0.6mg/L，萘乙酸0.15～0.25mg/L，瓊脂6100～6800mg/L和蔗糖30000～45000mg/L，余量為蒸餾水；所述步驟(1)和步驟(2)是在無菌條件下進(jìn)行操作。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種建立巨桉四倍體植株的誘導(dǎo)及培育體系的方法，其特征 在于步驟(1)所述莖段的長(zhǎng)度為0. 7 1. 3cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種建立巨桉四倍體植株的誘導(dǎo)及培育體系的方法，其特征 在于步驟(1)所述處理液的用量為每IOOmL處理液處理20 30枚莖段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種建立巨桉四倍體植株的誘導(dǎo)及培育體系的方法，其特征 在于所述增殖培養(yǎng)基由以下按質(zhì)量體積比計(jì)的組分組成硝酸鈣556mg/L，硝酸鉀500mg/ L，硫酸鎂370mg/L，磷酸二氫鉀170mg/L，氯化鈣96mg/L、硫酸錳22. 5mg/L、硫酸鋅8. 6mg/L, 硼酸6. 2mg/L,硫酸銅0. 025mg/L,鉬酸鈉0. 25mg/L,硫酸亞鐵27. 3mg/L,乙二胺四乙酸二鈉 37. 3mg/L,根皮苷2. 5mg/L,鹽酸硫胺素0. 1 Omg/L,鹽酸吡哆辛0. 5mg/L,煙酸0. 5mg/L,甘氨 酸 2. Omg/L,肌醇 100mg/L，核黃素 6. 0mg/L,激動(dòng)素 0. 5mg/L，萘乙酸 0. 2mg/L,瓊脂 6800mg/ L和蔗糖45000mg/L，余量為蒸餾水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種建立巨桉四倍體植株的誘導(dǎo)及培育體系的方法，其特 征在于步驟(2)所述生根培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基由以下按質(zhì)量體積比計(jì)的組分組成硝酸鉀 614 654mg/L，硝酸銨530 570mg/L，磷酸二氫鉀47 67mg/L，硫酸鎂113 133mg/ L,氯化鈣137 157mg/L，碘化鉀0. 8 0. 9mg/L,硼酸5. 2 7. 2mg/L,硫酸錳20. 3 24. 5mg/L,硫酸鋅 7. 6 9. 4mg/L,鉬酸鈉 0. 2 0. 3mg/L,硫酸銅 0. 02 0. 03mg/L,氯化 鈷0. 02 0. 03mg/L,乙二胺四乙酸二鈉34. 3 40. 3mg/L，硫酸亞鐵25. 8 29. 8mg/L，肌 醇90 110mg/L,甘氨酸1. 6 2. 6mg/L,鹽酸硫胺素0. 08 0. 12mg/L,鹽酸吡哆醇0. 4 0. 6mg/L,煙酸 0. 4 0. 6mg/L,吲哚丁酸 0. 42 0. 62mg/L, ABT 生根粉 0. 39 0. 69mg/L, 蔗糖25000 40000mg/L和瓊脂6100 6800mg/L，余量為蒸餾水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種建立巨桉四倍體植株的誘導(dǎo)及培育體系的方法，其特征 在于步驟(1)所述巨桉為審定品種Eg5無性系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種建立巨桉四倍體植株的誘導(dǎo)及培育體系的方法。該方法的步驟包括(1)將巨桉無菌組培苗的帶有腋芽或頂芽的莖段置于裝有處理液的容器中，所述處理液中含有秋水仙素和助劑SD；將容器密閉后置于搖床上振蕩，在35～40℃條件下加倍處理12～18小時(shí)；然后使用無菌水沖洗莖段，除去秋水仙素殘留液，得到經(jīng)過加倍處理的莖段；(2)將經(jīng)過加倍處理的莖段接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔15～20天即轉(zhuǎn)接到新配制的增殖培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接3～5次后再進(jìn)行生根培養(yǎng)。本發(fā)明創(chuàng)新之處是將助劑SD用到誘導(dǎo)過程，既可使用較低的秋水仙素濃度，節(jié)省用量，降低成本，又能顯著提高誘導(dǎo)率，由現(xiàn)有的20％～30％提高到60～65％。
文檔編號(hào)A01H1/08GK101869052SQ20101017135
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月5日
發(fā)明者徐建民, 李光友, 杜志鵠, 陸釗華, 陳儒香, 韓超 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所