專利名稱：一種側(cè)柏葉提取液及其制備方法、應(yīng)用及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物誘導(dǎo)劑，具體地，涉及一種作為植物誘導(dǎo)劑的側(cè)柏葉提取液及其制備方法、在抗葫蘆科作物霜霉病上的應(yīng)用及使用方法。
背景技術(shù)：
目前在蔬菜病蟲害防治中，使用化學(xué)農(nóng)藥防治的占80%以上，長期以來，大量農(nóng)藥的不合理使用造成了水體、土壤、大氣污染和農(nóng)產(chǎn)品有毒物質(zhì)殘留，嚴重危及農(nóng)村生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和人類健康；并使病原生理小種產(chǎn)生抗藥性，從而導(dǎo)致本已控制的病害再度猖獗，已成為制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素。隨著人們生活質(zhì)量的提高和環(huán)保意識的增強，人們正致力于利用誘導(dǎo)制劑替代農(nóng)藥進行農(nóng)作物保護的研究，向著綠色、安全、無公害方向發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。植物誘導(dǎo)抗病性是利用植物本身的防衛(wèi)體系，借助于誘導(dǎo)因子激發(fā)植物整體抗性水平，提高抵抗病害的能力，是植物病害防治的一種新思路。這種利用生物的、物理的、或者化學(xué)的因子處理植物，將會改變植物病害反應(yīng)，可使原來表現(xiàn)感病反應(yīng)的植物產(chǎn)生抗性反應(yīng)。誘導(dǎo)抗性是發(fā)掘植物內(nèi)在抗性機制的一種新的病害治理對策，在實際應(yīng)用中，誘抗劑的使用濃度非常底，一般為農(nóng)藥使用量的十分之一到五分之一左右。另外，在使用次數(shù)方面， 誘抗劑的使用次數(shù)少，在植物整個生長期使用2-3次即可。而使用農(nóng)藥防治病蟲害時，一般 15-30天就得噴施一次?？梢源蟠鬁p輕化學(xué)防治的壓力，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)的穩(wěn)定性與可持續(xù)性，且對環(huán)境無不良影響，根據(jù)誘抗效果，誘抗劑甚至可以部分的代替農(nóng)藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)農(nóng)藥在防治病蟲害中的缺陷，提出一種新的植物誘導(dǎo)劑——側(cè)柏葉提取液及其制備方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種側(cè)柏葉提取液作為植物誘導(dǎo)劑的應(yīng)用及其使用方法。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下—種側(cè)柏葉提取液，其制備方法包括原料稱重——洗凈——烘干——粉碎——過篩——丙酮浸泡提取——過濾——合并濾液——濃縮——冷藏，其具體步驟如下(1)取多年生側(cè)柏葉片，稱重、洗凈、烘干、粉碎、過100 120目篩；(2)將步驟(1)得到的過篩物質(zhì)均分成三份，分別加入重量體積比為2 1 1， 合計體積> 200ml的分析專用丙酮，進行密封浸泡提取，浸泡時間分別為72h、48h、Mh ；(3)將步驟O)中經(jīng)浸泡后的三份浸泡提取液分別過濾，后合并濾液；(4)將步驟(3)中得到的濾液分別濃縮后于0 4°C冷藏。進一步地，所述的烘干溫度為60°C。進一步地，所述的濃縮過程是采用恒溫箱在40°C進行濃縮。進一步地，所述的過濾過程是采用4層醫(yī)用紗布進行過濾。
本發(fā)明的側(cè)柏葉提取液還可作為植物誘導(dǎo)劑在葫蘆科作物，如西瓜，甜瓜，黃瓜， 西葫蘆等中使用，可用于防治霜霉病、白粉病、炭疽病、蔓枯病等。尤其是可以用在在抗甜瓜霜霉病上。本發(fā)明的側(cè)柏葉提取液的使用方法為在葫蘆科作物的幼苗期、伸蔓期、初花期以及幼果期對植株進行全株噴霧處理，在不同生育期各噴1 2次，使用濃度分別為0. 3mg/ ml,0. 5mg/ml,0. 7mg/ml，1. Omg/ml，優(yōu)選 0. 5mg/ml0本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點1、作為植物誘導(dǎo)劑，側(cè)柏葉提取液的效果基本等同于苯并噻重氮(BTH)、水楊酸 (SA)、草酸(OAA)、硅酸鈉(Na2SiO;3)等化學(xué)藥劑，但來源廣泛，取材方便，不受時間、空間和地域的限制，隨時隨地可以摘取，價格低廉。2、側(cè)柏葉提取液的制備過程中所需設(shè)備較少，操作簡單易行。3、它能部分替代農(nóng)藥，使用濃度非常低，使用次數(shù)大大減少，無污染無公害，對植物沒有不良影響且對環(huán)境無不良影響。


附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中圖1為幾種誘導(dǎo)劑處理后接菌對甜瓜幼苗葉片MDA含量的影響2為幾種誘導(dǎo)劑處理+接菌后甜瓜幼苗葉片木質(zhì)素含量的變化3為幾種誘導(dǎo)劑處理+接菌后甜瓜幼苗葉片HRGP的變化4為幾種誘導(dǎo)劑處理+接菌后甜瓜幼苗葉片POD活性的變化5為幾種誘導(dǎo)劑處理+接菌后甜瓜幼苗葉片PAL活性的變化6為幾種誘導(dǎo)劑處理+接菌后甜瓜幼苗葉片PPO活性的變化7為幾種誘導(dǎo)劑處理+接菌后甜瓜幼苗葉片CHI活性的變化8為幾種誘導(dǎo)劑處理+接菌后甜瓜幼苗葉片GLU活性的變化9為苗期幾種誘導(dǎo)劑處理和霜霉菌接種后葉綠素總量的變化10為苗期幾種誘導(dǎo)劑處理和霜霉菌接種后葉綠素a/b的變化11為幾種誘導(dǎo)劑處理和霜霉菌接種后甜瓜幼苗Car的變化12為誘導(dǎo)劑處理和霜霉菌接種后對葉片凈光合速率的影響13為幾種誘導(dǎo)劑處理和霜霉菌接種后對葉片氣孔導(dǎo)度的影響14為幾種誘導(dǎo)劑處理和霜霉菌接種后對葉片胞間CO2濃度的影響15為不同時期誘導(dǎo)劑處理對甜瓜果實膨大期凈光合速率的影響圖
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應(yīng)當理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1一種側(cè)柏提取液，括原料稱重——洗凈——烘干——粉碎——過篩——丙酮浸泡提取——過濾——合并濾液——濃縮——冷藏，其具體步驟如下
(1)取甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)多年生側(cè)柏葉片，用感量為0.001的電子天平秤取20g，先用自來水沖洗干凈后再用蒸餾水(自制)沖洗，用上海博迅實業(yè)公司生產(chǎn)的 GZX-9070MBE烘箱在60°C下烘干，用天津華鑫儀器廠FW100粉碎機粉碎后，過100-120目普通尼龍網(wǎng)篩；(2)將步驟(1)得到的過篩物質(zhì)均分成三份，分別加入裝有100ml、50ml、50ml分析專用丙酮(天津光復(fù)化學(xué)有限公司生產(chǎn))的燒杯中，進行(塑料薄膜密封)浸泡提取，浸泡時間分別為72h.48h.24h ；(3)將步驟( 中經(jīng)浸泡后的三份浸泡提取液分別用4層醫(yī)用紗布過濾，后合并濾液并密封存放在300ml容量瓶中；(4)將步驟(3)中得到的濾液用恒溫箱在40°C下濃縮至0. 3mg/ml，0. 5mg/ml， 0. 7mg/ml，1. Omg/ml，存放在O 4°C普通冰箱內(nèi)冷藏備用。上述側(cè)柏葉提取液在抗葫蘆科作物霜霉病中的使用方法為，在幼苗期、伸蔓期、初花期以及幼果期對植株進行全株噴霧處理，在不同生育期各噴1 2次，使用濃度分別為 0. 3mg/ml,0. 5mg/ml,0. 7mg/ml, 1. Omg/ml,其中 0. 5mg/ml 效果最好。下面以葫蘆科作物甜瓜為例，來進一步說明本發(fā)明的側(cè)柏葉提取液作為植物誘導(dǎo)劑在抗甜瓜霜霉病方面的應(yīng)用，并通過多種不同誘導(dǎo)劑的對比試驗進一步來說明其有益效果。1. 1 材料供試甜瓜品種為銀帝和卡拉克賽，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)瓜類研究所提供?？ɡ速愑置煿?，是我國著名哈密瓜品種，易感霜霉??；銀帝是近年西北地區(qū)的主栽品種，高抗霜霉病。供試菌種甜瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)，由甘肅省農(nóng)科院提供。供試藥劑BTH(澳大利亞悉尼大學(xué)提供)；SA、OAA(天津光復(fù)化學(xué)有限公司生產(chǎn))；側(cè)柏(采自農(nóng)大校園)，番茄莖葉(采自甘肅省農(nóng)科院溫室)；洋蔥、大蒜、韭菜(購于蘭州市安寧區(qū)桃海市場)；中草藥丁香、連翹、細辛、硫磺、明礬、苦參、蛇床子、花椒、蒼耳、 黃柏(購于蘭州市安寧黃河醫(yī)藥公司)。1. 2 方法1. 2. 1孢子懸浮液的制備采摘田間新鮮的甜瓜霜霉病葉片，用自來水沖洗掉上面的老孢子，在18 19°C下保濕Mh，促使新鮮孢子囊的產(chǎn)生。用毛筆蘸蒸餾水將新鮮孢子沖洗到燒杯中，再將其稀釋成濃度為IOX顯微鏡下每個視野含有10 15個孢子的懸浮液。1. 2. 2試驗處理1. 2. 2. 1誘導(dǎo)劑種類及濃度的篩選以卡拉克賽為試材，待幼苗長至五葉一心期時，采用下列濃度的藥劑處理 BTH (0.3mmol/L、0. 5mmol/L、0. 7mmol/L)、SA (0.5mmoL/L、1. OmmoL/L、1. 5mmoL/L)、 0AA(15mmol/L、30mmol/L、45mmol/L)、側(cè)柏(0. 5mg/ml、lmg/ml)、番茄莖葉(0. 5mg/ml、lmg/ ml)、蔥蒜類(0.5mg/ml、lmg/ml)、中草藥I (硫磺、明礬、苦參、蛇床子、花椒0. 5mg/ml、 lmg/ml)、中草藥II (丁香、連翹、細辛:0. 5mg/ml、lmg/ml)、中草藥III (苦參、蒼耳、黃柏 0.5mg/ml、lmg/ml)。處理方法為用不同濃度的誘導(dǎo)劑分別涂抹處理幼苗第三片真葉，以Tween 80為助吸劑，葉面濕潤為準，對照用TweenSO涂抹。3d后全株噴霧接種霜霉菌，接菌后5d、7d、9d統(tǒng)計病情指數(shù)。每處理種植15株，重復(fù)3次。1.2. 2.2盆栽試驗處理以甜瓜銀帝和卡拉克賽為試材，選取籽粒飽滿、大小一致的甜瓜種子浸種催芽，露白后播種于盛有蛭石和珍珠巖(3 1)混合基質(zhì)的塑料花盆(21CmX16CmX13Cm)中，幼苗至兩葉一心時，每盆間留1株。定期澆灌l(xiāng)/2H0agland營養(yǎng)液，培養(yǎng)基質(zhì)濕度維持在最大持水量的75%左右。待幼苗長到五葉一心時用BTH(0. 5mmol/L)、側(cè)柏葉片提取液(0. 5mg/ ml)、中草藥II制劑(lmg/ml)噴霧處理第3片真葉(葉面噴濕為止)，3d后全株接種霜霉菌，接種時用噴壺將霜霉菌孢子懸浮液均勻噴在甜瓜幼苗上。實驗設(shè)5個處理=Tween 80 (CKl)、Tween 80+ 霜霉菌(CK2)、Tween 80+BTH+ 霜霉菌(BTH)、Tween 80+ 側(cè)柏 + 霜霉菌 (側(cè)柏)、Tween 80+中草藥II +霜霉菌(中草藥II )。分別在處理后(接菌后)3(0)、5 (2)、 8(5),11 (8)、14 (11) d對各指標進行測定，每測定三次重復(fù)。1. 2. 2. 3田間試驗處理本試驗于2008年5月至8月中旬在甘肅民勤縣進行，以厚皮甜瓜銀帝(抗病品種)和卡拉克賽(感病品種)為試材。選擇土壤質(zhì)地、肥力基本一致的土地鋪膜種植，行距 1. 2米，株距0. 5米。在伸蔓期、初花期以及幼果期對甜瓜植株進行全株噴施藥劑處理，試驗設(shè) 6 個處理Tween 80 (CK)、Tween 80+ 伸蔓期 BTH、Tween 80+ 初花期 BTH、Tween 80+ 初花期側(cè)柏、Tween80+初花期中草藥II、Tween 80+伸蔓期+幼果期BTH、Tween 80+幼果期 BTH0在生育后期開始發(fā)病時對各種病害的發(fā)生進行統(tǒng)計，在果實發(fā)育期進行光合測定，果實成熟期進行果實品質(zhì)測定。1.3指標測定方法1. 3. 1甜瓜抗霜霉病處理效果測定1. 3. 1. 1盆栽試驗病害統(tǒng)計在接種后7d統(tǒng)計病情指數(shù)。每個處理每個重復(fù)隨機調(diào)查5株，三次重復(fù)。按葉片感病面積根據(jù)GB/T農(nóng)藥田間藥效試驗準則(一)分9級記載，計算病情指數(shù)。分級標準如下0級葉片無病斑；1級病斑面積占葉面積5 %以下3級病斑面積占葉面積6 % 10 %5級病斑面積占葉面積11 % 25 %7級病斑面積占葉面積沈％ 50 %9級病斑面積占葉面積50 %以上結(jié)果統(tǒng)計方法病情指數(shù)=Σ (病級數(shù)X該級病株數(shù))/(最高級數(shù)X各病級總株數(shù))XlOO相對防效=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)X 100%1. 3. 1. 2田間病害調(diào)查按照方中達等的方法，待田間開始發(fā)病時每7d調(diào)查一次病株率=發(fā)病株樹/調(diào)查總株樹X 100%病情指數(shù)=Σ (病級株數(shù)X代表數(shù)值)/(株數(shù)總和X發(fā)病最重級的代表值)X 100%
防效(<% )=(對照組平均病情指數(shù)-處理組平均病情指數(shù))/對照組平均病情指數(shù) XlOO1. 3. 2MDA 的測定硫代巴比妥酸法測定。取葉片0. 5g加5%^^(三氯乙酸)51111研磨成漿，1000\8 離心lOmin，取上清液2ml，加0. 67 % TBA (硫代巴比妥酸)2ml，沸水浴中加熱30min，冷卻后再離心一次，上清液在450nm、532nm、6(K)nm波長下比色，根據(jù)下式計算MDA含量MDA 的濃度(μ mol/L) = 6. 45* (0D532-0D600) -0. 56*0D450MDA的含量(μ mol/g FW) = MDA的濃度*反應(yīng)體系體積(mL) *10_、提取液體積 (mL) /反應(yīng)液體積(mL) /樣品重量1. 3. 3抗病相關(guān)物質(zhì)的測定1. 3. 3. 1木質(zhì)素的測定參照X.H.波欽諾克的方法，取細胞壁干樣50mg，用10%醋酸、丙酮等分離出可溶性和脂溶性化合物，用72%硫酸水解除去纖維素和半纖維素，沉淀用蒸餾水洗滌后，再向沖洗過的木質(zhì)素沉淀中加IOml質(zhì)量分數(shù)為10%的硫酸和0. lmol/L重鉻酸鉀溶液，將試管放入沸水浴中15min，并不時的攪拌，冷卻后將所有物質(zhì)轉(zhuǎn)入燒杯中作滴定用，并用15-20ml 蒸餾水洗滌殘余部分。然后向燒杯中加入5ml質(zhì)量分數(shù)為20% KI溶液和Iml質(zhì)量分數(shù) 0. 5%淀粉液，用硫代硫酸鈉滴定，綠色時為終點，單獨滴定加入了 IOml質(zhì)量分數(shù)10%硫酸的0. ImoL/L的重鉻酸鉀溶液IOml作為空白對照。木質(zhì)素的含量按下式計算X = K (a-b) / (n*48)式中48為ImolC11H12O4相當于硫代硫酸鈉的當量數(shù)；K為硫代硫酸鈉的濃度(moL/ L)，a為空白滴定所耗硫代硫酸鈉體積(ml)，b為滴定溶液所耗硫代硫酸鈉體積(ml)，η為甜瓜葉片細胞壁物質(zhì)質(zhì)量(g)。1. 3. 3. 2HRGP 的測定細胞壁的制備按李建華等所述的方法，取待測愈傷組織8. 0g，W lmol/L NaCl于研缽中充分研磨勻漿(鏡檢無完整細胞)，加lmol/L NaCl至30ml，4°C下靜置過夜，用耐酸漏斗抽濾，殘渣用lmol/L NaCl反復(fù)抽濾洗滌細胞殘渣，直至濾液無蛋白為止(用考馬斯亮藍G-250法檢測)。最后用蒸餾水反復(fù)抽濾洗滌，除去NaCl，所得殘渣經(jīng)60°C烘干即為細胞壁制品。細胞壁中HRGP(Hydroxyproline-rich glycoprotein)含量與羥脯氨酸(Hyp)含量成正相關(guān)，因此本研究以Hyp含量代表HRGP的相對含量，Hyp測定參照Kivirikko的方法，取細胞壁制品20mg，懸浮于5ml 6mol/LHCl中，110°C酸解18h。取酸解液2ml，用KOH 調(diào)PH值至7.0，加Iml pH8. 7硼酸緩沖液(0. 8mol/L)和2ml 0. 2mol/L氯胺T (用乙二醇甲醚配制)，室溫下反應(yīng)25min, 2ml 3. 6mo VLNa2S2O3終止反應(yīng)，加2g KCl飽和后用3ml甲苯萃取，靜置后吸去甲苯層，于沸水浴中加熱30min，冷卻后加細1甲苯充分混勻萃取，取甲苯層萃取液2ml與Iml對二甲氨基苯甲醛(DMAB)試劑(12g DMAB溶于20ml無水乙醇，再加 20ml無水乙醇與濃硫酸混合液(V/V = 100 13. 7)微熱溶解)室溫顯色20min，A56(1nm測定OD值，根據(jù)標準曲線計算Hyp含量，即代表樣品中HRGP的相對含量(mg/g)。標準曲線繪制分別取蒸餾水(對照)和不同濃度的羥脯氨酸標準液0.5ml，使每個測定體系中含HpyO 20g，加入Iml NaBrO4稀釋液，室溫下反應(yīng)5min后，加入6mol/LHCl 0. 5ml，搖勻，再加入對二甲氨基苯甲醛正丙醇溶液1ml，混勻，于70°C恒溫水浴中保溫 15min，取出冷卻至室溫，在560nm測光密度值。以光密度值(OD)為縱坐標，羥脯氨酸含量為橫坐標，繪制標準曲線。1. 3. 4抗病相關(guān)酶活性的測定1. 3. 4. 1過氧化物酶(POD)活性的測定愈創(chuàng)木酚法測定。每品種每處理各取鮮葉lg，冰浴研磨，分3次加入IOmL重蒸餾水，以lOOOOr/min離心20min，取上清液測定活性。試管中加入5mL磷酸緩沖液，0. 028mL H2O2，0. 019mL愈創(chuàng)木酚，配成反應(yīng)液，每3mL反應(yīng)液中加入10 μ L酶提取液，在752分光光度計上測0，l,2min的OD42tl值，以每克鮮重每分鐘增加0. 01 0D·為一個酶活性單位計算酶活性。1. 3. 4. 2苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定參照李合生方法略有所改動。取甜瓜葉片0. 2克，加5mL (含5mol/Li3-巰基乙醇、 0. IgPVP)的硼酸緩沖液，將勻漿全部轉(zhuǎn)入離心管中。于6000r/min下離心20min，上清液即為粗酶提取液。取上清液1. OmL,加入1. OmLO. 02mol/L苯丙氨酸，2. OmL蒸餾水，總體積為 4mL，對照以LOmL蒸餾水代替底物，在^K)nm下測定一次后，反應(yīng)液置恒溫(30°C )水浴保溫，30min后再測一次，以每小時在^Onm處吸光度變化0. 01所需酶量為一個活性單位。1. 3. 4. 3多酚氧化酶(PPO)活性的測定參照李合生方法測定。粗酶液的提取同POD酶液提取活性測定取上清液0. ImL加入1. 5mL0. 02mol/L鄰苯二酚，1. 4mL磷酸緩沖液(PH =6. 8)，以磷酸緩沖液代替酶液作為對照，30°C反應(yīng)2min，在398nm下測定吸光值，連續(xù)記錄5min，以每克鮮重每分鐘增加0. 01 OD470為一個酶活性單位計算酶活性。1. 3. 4. 4幾丁質(zhì)酶(CHI)活性測定參照史益敏方法，略有改動。膠狀幾丁質(zhì)的制備稱取Ig幾丁質(zhì)，加入丙酮研磨成糊狀，在4°C下加入40mlHCL，用玻璃棉過濾，將過濾液加入到200ml50%乙醇中，使膠狀幾丁質(zhì)沉淀析出并收集，用蒸餾水沖洗后，置透析袋中在4°C下透析過夜后保存于冰箱中酶液的提取取甜瓜葉片0. 2g，加入3ml 0. ImoL/L乙酸緩沖液(PH = 5. 0)，研磨后于4°C下1000 Xg離心lOmin，取上清液在4°C下透析過夜后置于冰箱中備用。酶活性的測定吸取膠狀幾丁質(zhì)溶液1.5ml，加入0. ImoL/L的乙酸緩沖液 0. 5ml (PH = 4. 5)，酶液0. 4ml，75umol/L的疊氮鈉溶液0. Iml，于37°C下保溫2h后加入0. 8N 的硼酸緩沖液(PH = 9. 1)0. 5ml，在1000 Xg條件下離心5min，取上清液1. 5ml加入2ml高鐵氰化鉀溶液，100°C水浴15min，以蒸餾水為空白對照，于420nm下測定吸光值。根據(jù)標準曲線求出N-乙酰氨基葡萄糖量，以每小時分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生IugN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個單位(U)。標準曲線的制作將N-乙酰氨基葡萄糖配成0、6. 25、12. 5、25、50、100ug/ml標準溶液，取不同濃度的標準溶液各1. 5ml，分別加入2ml高鐵氰化鉀，置于100°C水浴15min，冷卻后于420nm下比色(蒸餾水作為空白對照)，以吸光值為縱坐標，N-乙酰氨基葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。1.3.4. 5 β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性的測定
參照李合生方法有所改進。取Ig葉片組織，加入0. lmol/L的檸檬酸_0. 2mol/L 磷酸氫二鈉緩沖液(PH5. 0) 5ml，在冰浴中研磨成勻漿，4°C下6000r/min離心30min，上清液為粗酶提取液。取粗酶提取液1ml，加0. lmol/L的檸檬酸-0. 2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液 (PH4. 8)2. 5ml，的昆布多糖0. 5ml，30°C水浴中保溫lhr，蒽酮法測糖生成量，以每小時形成Img葡萄糖為1個酶活單位。標準方程:y= 0. 0075x(R2 = 0. 9995) ；χ 蔗糖濃度(μ g) ；y 吸光度可溶性糖含量(mg/g) = [CX (V/a) Xn]/(WX 103) :C_標準方程求得糖量(μ g)； a_吸取樣品液體積(ml) ；V-提取液量(ml) ；n-稀釋倍數(shù)；W-組織重量。1.3. 5光合作用的測定1.3. 5. 1葉綠素含量的測定參照張憲政的方法，稱取剪碎混合的新鮮葉片0.5克，放入試管中并加入 10ml80%丙酮，封口后移入暗處保存浸提，待葉肉組織呈白色時則表明浸提完全。以80%丙酮為空白對照，分別在波長665、649、470下測定吸光度，按下列公式計算葉綠素 a 濃度(Ca) = 13. 95A665-6. 88A649葉綠素 b 濃度=(Cb) 24. 96A649-7. 32A665類胡蘿卜素濃度(Ccar)= (1000A470-2· 05Ca_114. 8Cb)/245葉綠素含量(mg/g)=(色素濃度X提取液體積X稀釋倍數(shù))/樣品鮮重1. 3. 5. 2氣體交換參數(shù)的測定用便攜式光合測定系統(tǒng)(CID-310，美國)進行，于處理(接菌)后11 (8) d測定第 3片真葉的瞬時凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2 (Ci)濃度。每個處理3個重復(fù)， 每次重復(fù)測定3株，每葉記錄3-5組穩(wěn)定讀數(shù)。1. 3. 6甜瓜果實大小及品質(zhì)的測定果實成熟時測定單果重、果實肉厚、果肉硬度、可溶性固形物含量，重復(fù)三次，每次重復(fù)測定5個瓜。1.4數(shù)據(jù)分析用SPSS (16. 0)和 Excel (Office 2003)進行數(shù)據(jù)分析。2. 1不同誘導(dǎo)劑及其濃度的篩選結(jié)果表1不同濃度的各誘導(dǎo)劑對霜霉菌孢子萌發(fā)及預(yù)防效果
權(quán)利要求
1.一種側(cè)柏葉提取液，其特征在于，由如下方法制備(1)取多年生側(cè)柏葉片，稱重、洗凈、烘干、粉碎、過100 120目篩；(2)將步驟(1)得到的過篩物質(zhì)均分成三份，分別加入體積比為2 1 1，合計體積 ^ 200ml的分析專用丙酮，進行密封浸泡提取，浸泡時間分別為72h、48h、Mh ；(3)將步驟O)中經(jīng)浸泡后的三份浸泡提取液分別過濾，后合并濾液；(4)將步驟(3)中得到的濾液分別濃縮后于0 4°C冷藏。
2.一種側(cè)柏葉提取液的制備方法，其特征在于，包括原料稱重——洗凈——烘干—— 粉碎——過篩——丙酮浸泡提取——過濾——合并濾液——濃縮——冷藏，其具體步驟如下(1)取多年生側(cè)柏葉片，稱重、洗凈、烘干、粉碎、過100 120目篩；(2)將步驟(1)得到的過篩物質(zhì)均分成三份，分別加入重量體積比為2 1 1，合計體積> 200ml的分析專用丙酮，進行密封浸泡提取，浸泡時間分別為72h、48h、Mh ；(3)將步驟O)中經(jīng)浸泡后的三份浸泡提取液分別過濾，后合并濾液；(4)將步驟(3)中得到的濾液分別濃縮后于0 4°C冷藏。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種側(cè)柏葉提取液的制備方法，其特征在于，所述的烘干溫度為60°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種側(cè)柏葉提取液的制備方法，其特征在于，所述的濃縮過程是采用恒溫箱在40°C進行濃縮。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種側(cè)柏葉提取液的制備方法，其特征在于，所述的過濾過程是采用4層醫(yī)用紗布進行過濾。
6.一種側(cè)柏葉提取液作為植物誘導(dǎo)劑在葫蘆科作物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種側(cè)柏葉提取液作為植物誘導(dǎo)劑在葫蘆科作物中的應(yīng)用， 其特征在于，主要用于抗葫蘆科作物霜霉病。
8.一種側(cè)柏葉提取液在抗葫蘆科作物霜霉病中的使用方法，其特征在于，在幼苗期、伸蔓期、初花期以及幼果期對植株進行全株噴霧處理，在不同生育期各噴1 2次，使用濃度分另 1J 為 0. 3mg/ml，0· 5mg/ml，0· 7mg/ml，1. 0mg/mlo
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種側(cè)柏葉提取液在抗葫蘆科作物霜霉病中的使用方法，其特征在于，使用濃度為0. 5mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種側(cè)柏葉提取液及其制備方法、應(yīng)用及使用方法，其中側(cè)柏葉提取液的制備方法包括原料稱重—洗凈—烘干—粉碎—過篩—丙酮浸泡提取—過濾—合并濾液—濃縮—冷藏；該側(cè)柏葉提取液可作為植物誘導(dǎo)劑在葫蘆科作物中應(yīng)用，尤其是在抗葫蘆科作物霜霉病中的應(yīng)用；使用時，可在不同生育期進行1～2次的全株噴施處理。本發(fā)明的側(cè)柏葉提取液制備方法簡便易行，作為植物誘導(dǎo)劑可部分代替化學(xué)農(nóng)藥，具有藥效好、取材方便、無污染等特點。
文檔編號A01N65/06GK102258060SQ201010181979
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者喬昌萍, 唐瑞永, 康恩祥, 張建農(nóng), 張玉鑫, 王春林, 陳年來, 陳菁菁, 韓國君 申請人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)