專利名稱：重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子Ⅰ型的化學(xué)偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型的重組制備，缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型的聚乙二醇修飾，以及修飾后的純化和其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
迄今為止，已發(fā)現(xiàn)兩種角質(zhì)細胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)， 即角質(zhì)細胞生長因子I型(KGF-I)和角質(zhì)細胞生長因子II型(KGF-II)。它們分別是成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)家族的成員，又命名為FGF-7和 FGF-10 (Aaronoson SA. et al. J. Annals of the New York Academy of science,1991, 638 :62-77.)。KGF-1 最初由 Rubin 等人(Rubin, J. S.，et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989. 86(3) :p. 802-6.)從人胎肺成纖維細胞的培養(yǎng)上清中分離并純化的，并發(fā)現(xiàn)具有促進小鼠角質(zhì)細胞有絲分裂的作用，故將其定名為角質(zhì)細胞生長因子。KGF-II是Emoto等 (Emoto H Tagashira S MatteiMG,Journal of biology chemistry,1997(37)) ψ 1997 ^Ξ 從肺中分離出編碼人KGF-II的cDNA。人角質(zhì)細胞生長因子 I 型(human keratinocyte growth factor, hKGF-I)位于 15號染色體，其cDNA編碼194個氨基酸殘基，包括一段21個氨基酸的分泌信號肽。成熟的hKGF-I為一含163個氨基酸殘基的單鏈多肽。臨床前研究和臨床研究顯示，人角質(zhì)細胞生長因子I型是一種多功能的生長因子，通過促進細胞的增殖、遷移、分化、存活、DNA修復(fù)以及誘導(dǎo)對活性氧具有解毒功能的酶的表達來加強上皮功能，從而保護上皮免于毒性物質(zhì)的損傷(Finch, P. W.，et al.，Science, 1989. 245(4919) :ρ· 752-5. ； Rub in, J. S.，et al. V ；Farrel 1, C. L. , et al. ,Int J Radiat Biol, 1999. 75(5) :ρ· 609—20· ；Farrel 1, C. L., et al. , Cancer Res,1998. 58(5) :ρ·933-9. ；Ellison CA, et al. , J Clin Immunol,2008, 28(5) :600-615.)。由Amgen公司開發(fā)的重組人角質(zhì)形成細胞生長因子hi if ermin (商品名 Kepivance)是缺失人角質(zhì)形成細胞生長因子I型的N末端23個氨基酸(Δ 23hKGF) (Eric Hsu et al. ,ProteinEngineering,Design & Selection vol.19 no. 4 pp. 147-153,2006), 于2004年被美國FDA批準(zhǔn)用于治療血液腫瘤患者高劑量化療或者聯(lián)合放療導(dǎo)致的嚴重口腔粘膜損傷。Δ 23hKGF在體內(nèi)的半衰期僅為》ir，臨床給藥劑量大(60 μ g/kg/日)，需連續(xù)給藥7天(1次/天)。在治療用蛋白質(zhì)藥物的研究中，解決蛋白類藥物在機體內(nèi)半衰期短的方法眾多。 其中最有效的方法之一是將蛋白質(zhì)與水溶性聚合物共價結(jié)合成偶聯(lián)物。而所使用的水溶性聚合物包括聚乙二醇、聚乳糖、聚合氨基酸等，其中聚乙二醇的使用最為普遍。聚乙二醇-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物具有良好的熱穩(wěn)定性、抗酶解、增加水溶性、延長體內(nèi)半衰期、降低免疫原性和毒性等多重優(yōu)點anada，et al.，J. Bioact. And CompatiblePolymers, 5 :343(1990) ；Delgalo,et al. , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carriersystems,9 :249 (1992) ；katre, Advanced Drug Delivery Systems,10 91(1993)). 1991年第一種用聚乙二醇(PEG)修飾的藥物PEG-ADA上市，近幾年上市的產(chǎn)品有PEG-干擾素、PEG-粒細胞集落刺激因子、PEG-天冬酰胺酶、PEG-生長抑素以及PEG-利巴韋林等。此外，尚有數(shù)十種PEG修飾的蛋白藥物處于研究或臨床實驗階段。檢索國內(nèi)外專利和文獻發(fā)現(xiàn)，采用聚乙二醇修飾人角質(zhì)細胞生長因子的公開文■ i又有 Zhifeng Huang 等人(Zhifeng Huang, et al.，Journal of Biotechnology 142(2009)242-249.)針對人角質(zhì)細胞生長因子N末端的聚乙二醇修飾。本專利發(fā)明了馬來酰亞胺活化的單甲氧基聚乙二醇特異性修飾重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型的第17 位半胱氨酸的游離巰基，該修飾方法修飾而成的重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型化學(xué)偶聯(lián)物，具有修飾位點專一、結(jié)構(gòu)均一、易于實施等優(yōu)勢；更為重要的是在保留人角質(zhì)細胞生長因子I型的生物活性下，能有效改善其體內(nèi)代謝動力學(xué)特性，實現(xiàn)延長半衰期，減少給藥頻率，更適用作為一種預(yù)防或治療性藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用聚乙二醇與重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型的半胱氨酸的游離巰基共價連接而形成的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物能有效改善人角質(zhì)形成細胞生長因子在體內(nèi)的藥代動力學(xué)；同時該偶聯(lián)物，可作為一種預(yù)防或治療藥物，或藥物組合物，在有效治療劑量用于治療對放化療引起的消化道粘膜損傷或潰瘍性黏膜炎、急性化學(xué)性肝損傷。天然野生型人角質(zhì)細胞生長因子是一個含163個氨基酸殘基的單鏈多肽，含位于1,15,40,102,106的五個半胱氨酸，其中Cysl_Cysl5、Cysl02_Cysl06形成兩對二硫鍵，Cys40 以游離巰基形式存在(Timothy D. Osslund et al. , prorein Science (1998)，7 1681-1690)。本發(fā)明所述的聚乙二醇與重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型的半胱氨酸的游離巰基共價連接中的半胱氨酸的游離巰基，指的是天然野生型人角質(zhì)細胞生長因子I型 (hKGF) N末端缺失23個氨基酸的人角質(zhì)細胞生長因子突變體(A23hKGF)的第17位半胱氨酸(Cys)，相當(dāng)于天然野生型人角質(zhì)細胞生長因子I型的第40位半胱氨酸。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先界定了缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型的氨基酸序列或組成。所述的缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型是指在天然野生型人角質(zhì)細胞生長因子I型的氨基末端缺失23個氨基酸的突變體，序列特征為(序列為SEQ ID No:l)Ser TyrAspTyr Met Glu GlyGlyAsp lieArgValArgArg LeuPhe
Cys ArgThrGln Trp Tyr LeuArglie AspLysArgGlyLys ValLys
Gly ThrGlnGlu Met Lys AsnAsnTyr AsnlieMetGlulie ArgThr
Val AlaValGly lie Val AlalieLys GlyValGluSerGlu PheTyr
Leu AlaMetAsn Lys Glu GlyLysLeu TyrAlaLysLysGlu CysAsn
Glu AspCysAsn Phe Lys GluLeulie LeuGluAsnHisTyr AsnThr
Tyr AlaSerAla Lys Trp ThrHisAsn GlyGlyGluMetPhe ValAla
Leu AsnGlnLys Gly lie ProValArg GlyLysLysThrLys LysGlu
Gln LysThrAla His Phe LeuProMet AlalieThr 同時包含在SEQ ID No :1序列的基礎(chǔ)上氨基末端增加或減少1_5個氨基酸的變異體。如從SEQ ID No 1序列的N末端增加一個甲硫氨酸(Met)，或增加5個氨基酸序列為Pro-Glu-Arg-Hi s-Thr-Arg 或 Met-Glu-Arg-Hi s-Thr-Arg ；或從 SEQ ID No :1 序列的 N 末端減少一個絲氨酸，或減少5個氨基酸序列為Ser-Tyr-Asp-Tyr-Met，或減少4個氨基酸序列為 Ser-Tyr-Asp-Tyr。所述的重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型，是指通過基因工程重組技術(shù)，經(jīng)大腸桿菌重組表達，表達后經(jīng)層析分離技術(shù)獲得純度大于95%的重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子 I 型(A23hKGF)。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了 A23hKGF的聚乙二醇修飾制備。所述的聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺(Monomethoxy Polyethylene glycolMaleimide, mPEG-MAL)活化分子，或為單甲氧基聚乙二醇鄰二硫吡啶(MonomethoxyPolyethylene glycol Ortho-pyridyldisulfide,mPEG-OPSS)活化分子，或為單甲氧基聚乙二醇乙烯基砜 (Monomethoxy Polyethylene glycol Vinylsufone，mPEG-VS)活化分子，或單甲氧基聚乙二醇巰基(Monomethoxy Polyethylene glycol sulfhydryl，mPEG_SH)活化分子，或為單甲氧基聚乙二醇碘代乙酰胺(Monomethoxy Polyethylene glycol Iodo acetamide,mPEG-IA) 活化分子，優(yōu)選單甲氧基聚乙二醇-馬來酰亞胺基活化分子。聚乙二醇分子可為直鏈型或分枝型，分子量介于5，000-40, 000道爾頓，其中優(yōu)選20，000道爾頓的直鏈型聚乙二醇分子和40，000道爾頓的分枝型聚乙二醇分子。所述的Δ 23hKGF的聚乙二醇修飾，是指重組制備的Δ 23hKGF蛋白濃度為 l-10mg/ml，在IO-IOOmm的磷酸鹽緩沖液，pH值5. 0-8. O下，重組蛋白與聚乙二醇質(zhì)量比在 1 0. 5-6 的條件與 mPEG-MAL，或 mPEG-OPSS，或 mPEG-SH，或 mPEG-IA，經(jīng) 4_37°C，100r/min 攪拌反應(yīng)0.5-Mhr后，調(diào)低pH終止反應(yīng)。再采用層析分離技術(shù)除去未被修飾的A23hKGF 和游離PEG分子，獲得純度大于95%的聚乙二醇化重組A23hKGF的偶聯(lián)物。其中優(yōu)選的修飾條件為Δ 23hKGF原液用lOOmmol/L磷酸鹽緩沖液，pH6. 5稀釋樣品至ang/mL，按 Δ 23hKGF 與 mPEG-MAL-20KD 或與 mPEG-MAL_40KD 質(zhì)量比為 1 2 稱取 mPEG-MAL_20KD 或 mPEG-MAL-40KD加入Δ 23hKGF溶液中，25°C，100r/min攪拌反應(yīng)2hr后，用鹽酸調(diào)低pH至 3. O終止反應(yīng)。該制備方法經(jīng)實例證明，修飾率高和修飾特異性專一，修飾后產(chǎn)物均一，且利于實施。本專利發(fā)明技術(shù)制備的聚乙二醇化重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型 (PEG-A23KGF)，在試驗動物中，經(jīng)1次體內(nèi)皮下注射，可有效保護由CC14引起的急性肝損傷，保護5氟尿嘧啶引起的急性小腸粘膜損傷。因此，本發(fā)明所述的重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型的化學(xué)偶聯(lián)物，可作為一種預(yù)防或治療藥物，或藥物組合物，在有效治療劑量下用于預(yù)防和治療對放化療引起的消化道粘膜損傷或潰瘍性黏膜炎以及急性化學(xué)性肝損傷。至此已對本發(fā)明進行了詳細的描述，通過參考下列實例，能夠?qū)Ρ景l(fā)明有更清楚地理解，所述實例僅為說明目的而并不旨在對本發(fā)明進行限制。


圖1重組Δ 23hKGF表達和純化后的SDS-PAGE圖譜，A圖中1為大腸桿菌誘導(dǎo)前， 2為誘導(dǎo)后；B圖中1為破菌上清，2為SP柱純化后，3為肝素純化后，M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。圖2 Δ 23hKGF的mPEG-MAL_20k修飾前后和修飾后經(jīng)純化的SDS-PAGE圖譜，其中1為修飾前，2為修飾后，3為修飾后純化的PEG-20K- Δ 23KGF, M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。圖3為Δ 23hKGF的mPEG-MAL_40k修飾前后和修飾后經(jīng)純化的SDS-PAGE圖譜，其中1為修飾前，2為修飾后，3為修飾后純化的PEG-20K- Δ 23KGF, M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。
具體實施例方式實例1、缺失N末端23個氨基酸的人角質(zhì)細胞生長因子I型(A2!3hKGF)的重組表達根據(jù)Δ 23hKGF氨基酸序列(SEQ ID No 1),設(shè)計大腸桿菌偏愛密碼子的對應(yīng)cDNA 序列包含5’端和3’分別設(shè)計限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I位點(SEQ ID No :2)。委托寶生物工程(大連)有限公司全基因人工合成，并嵌入PUC18載體且命名為pUC18-A23hKGF/ DH5a 0質(zhì)粒pUC18_A23hKGF DH5 α和表達載體質(zhì)粒pET_3c用限制性內(nèi)切酶Nde I 和BamH I雙酶切，根據(jù)1 %瓊脂糖電泳結(jié)果，回收pET_3c酶切后約4638bp的片段，回收pUC18- Δ 23hKGF/DH5 α酶切后約450bp的片段，將兩個片段用T4連接酶進行連接，用 LA (胰蛋白胨2g，酵母提取物lg，NaCl 2g，瓊脂3g，加水定溶至200mL，121°C，高壓滅菌 30min,當(dāng)溫度降到50°C左右時加入Amp至終濃度為100ug/mL，取適量倒培養(yǎng)皿，凝固后即成LA瓊脂平板)平板篩選重組子，Nde I和BamH I雙酶切鑒定，陽性克隆。正確質(zhì)粒命名為 pET-3c- Δ 23hKGF。再將質(zhì)粒 pET_3c_ Δ 23hKGF 轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3) plysS 宿主菌中，篩選正確表達的工程菌命名pET-3c-A23hKGF/BL21(DE;3)plySS。用于表達的載體和宿主菌菌購于 Novagen公司，Nde I和BamH I酶購于寶生物工程(大連)有限公司。將上述表達最佳工程菌株劃線接種于LA瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜。從過夜培養(yǎng)的 LA平板上挑取菌苔接種于含LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl IOg,加水定溶至1000mL，121°C，高壓滅菌30min即可)試管中，37°C培養(yǎng)12小時，然后按的比例轉(zhuǎn)接到含200mL LB培養(yǎng)液的IOOOmL三角瓶中，37°C培養(yǎng)過夜即成為上罐種子液。將上罐種子液按5%的比例接種于含20L M9YT培養(yǎng)液的30L發(fā)酵罐中，37°C培養(yǎng)，整過發(fā)酵過程中，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、空氣量、純氧量來保持溶氧在30%以上，用觀％的氨水調(diào)節(jié)pH并保持在 7. 0。至菌液0D600 = 10 14時，加入終濃度為0. lmmol/L的IPTG，28°C繼續(xù)培養(yǎng)6小時后停止發(fā)酵(圖1A)，收集菌液，SOOOrpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體放入_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。實?、Δ 23hKGF的純化制備從_20°C冰箱中取出菌體，按1 15w/v放入細菌裂解液(50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/LEDTA, 10 μ g/mlDNase, 2mm MgCl2, pH 8.5-9.0)中，37°C下攪拌待破菌液不粘稠時加入終濃度0. IM的檸檬酸三鈉，繼續(xù)攪拌0.證。調(diào)節(jié)pH為7. 5，IOOOOrpm離心，15min, 收集上清。上清液上SP-S印harose Fast Flow柱(平衡液50mmpb，ρΗ7· 5)，復(fù)平衡，用 50-500mmNacl線性梯度洗脫，收集洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE檢測，確定含主要目的蛋白的洗脫峰。SP洗脫的目的樣品上H印arin柱(平衡液20_ pb，pH7. 5)，復(fù)平衡，用50_500mm Nacl 線性梯度洗脫，收集洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE和HPLC檢測，獲得純度大于95%的A23hKGF(圖 1B)。實例3、Δ 23hKGF 的 mPEG-MAL_20K 修飾及修飾后(PEG-20K- Δ 23KGF)的純化
純度大于95 %的Δ 23hKGF溶液用lOOmmol/L磷酸鹽緩沖液，pH6. 5，稀釋樣品至ang/mL，按A23hKGF與mPEG-MAL_20KD (直鏈型，購于北京健凱科技有限公司)質(zhì)量比為1 2稱取mPEG-MAL-20KD加入A23hKGF溶液中，25°C，100r/min攪拌反應(yīng)》ir，用鹽酸調(diào)低PH終止反應(yīng)。修飾后的A23hKGF(PEG-20K-A23KGF)溶液透析過夜(透析液 20mmNaAc, ρΗ5· 0)，透析后的 PEG-20K- Δ 23KGF 溶液上 SP-S印harose Fast Flow 柱(平衡液20mmNaAc，pH5. 0)，復(fù)平衡，用50_500mm Nacl線性梯度洗脫，收集洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE 和HPLC檢測，獲得純度大于95 %的PEG-20K- Δ 23KGF (圖2)。實例4、Δ 23hKGF 的 mPEG-MAL_40K 修飾及修飾后(PEG-40K- Δ 23KGF)的純化純度大于95%的A23hKGF溶液用lOOmmol/L磷酸鹽緩沖液，pH6. 5，稀釋樣品至 2mg/mL,按 Δ 23hKGF 與 mPEG-MAL_40KD (分枝型)質(zhì)量比為 1 2 稱取 mPEG-MAL_40KD 加入A23hKGF溶液中，25°C，100r/min攪拌反應(yīng)2hr后，用鹽酸調(diào)低pH至3.0終止反應(yīng)。修飾后的Δ 23hKGF(PEG-40K-A 23KGF)溶液透析過夜(透析液20mmNaAc，pH5. 0)，透析后的 PEG-40K- Δ 23KGF 溶液上 SP-S印harose Fast Flow 柱(平衡液20mmNaAc，ρΗ5· 0)，復(fù)平衡，用50-500mm Nacl線性梯度洗脫，收集洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE和HPLC檢測，獲得純度大于 95 % 的 PEG-40K- Δ 23KGF (圖 3)。實例 5、Δ 23hKGF、PEG-20K- Δ 23KGF 和 PEG-40K- Δ 23KGF 的體外活性檢測樣品Δ 23hKGF, PEG-20K-Δ 23KGF 和 PEG-40K-Δ 23KGF 分別用含 0. 5%胎牛血清的1640培養(yǎng)基稀釋至1 μ g/ml，再按1 4梯度稀釋7個濃度。將NBL-7細胞每孔3 X IO3 接種于96孔細胞培養(yǎng)板，置于37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)過夜，吸凈上清后復(fù)孔加入以上配制的不同稀釋濃度的樣品。置于二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h，每孔加入MTT 10μ1染色， 再培養(yǎng)4 Mi后棄掉培養(yǎng)液，加入100 μ 1的DMS0，振蕩混勻后在570nm波長下測定各孔吸光度OD值。根據(jù)KGF-I的國際活性標(biāo)準(zhǔn)品(來源于NIBSC)計算PEG修飾前后的Δ 23hKGF 的體外生物比活性(IU/mg)。結(jié)果
權(quán)利要求
1.本發(fā)明是對重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型的半胱氨酸的游離巰基的聚乙二醇分子化學(xué)修飾而成的偶聯(lián)物。
2.權(quán)利要求1所述的重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型，指天然含163個氨基酸組成的人角質(zhì)細胞生長因子I型在氨基末端缺失23個氨基酸，氨基酸序列為SEQ ID No=I0 同時包含在SEQ ID No 1序列的基礎(chǔ)上氨基末端增加或減少1-5個氨基酸的變異體。
3.權(quán)利要求1所述的重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型的半胱氨酸的游離巰基，指位于氨基酸序列SEQ ID No 1中的第17位氨基酸。
4.權(quán)利要求1所述的聚乙二醇分子，其特征在于，聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺(Monomethoxy Polyethylene glycol Maleimide，mPEG-MAL)活化分子，或為單甲 ￠1 ^二酉享令P二？！^口比 (Monomethoxy Polyethylene glycolOrtho-pyridyldisulfide, mPEG-OPSS)活化分子，或為單甲氧基聚乙二醇乙烯基砜(Monomethoxy Polyethylene glycol Vinylsufone, mPEG-VS)活化分子，或單甲氧基聚乙二醇巰基(Monomethoxy Polyethylene glycol suIfhydry 1，mPEG-SH)活化分子，或為單甲氧基聚乙二醇碘代乙酰胺(Monomethoxy Polyethylene glycol Iodo acetamide,mPEG_IA)活化分子，優(yōu)選單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺活化分子。
5.權(quán)利要求1、4任一項所述聚乙二醇分子，其特征在于聚二醇分子可為直鏈型或分枝型；
6.權(quán)利要求1、4、5任一項所述聚乙二醇分子，其特征在于聚乙二醇分子分子量為 5，000-40, 000道爾頓，其中優(yōu)選20，000道爾頓的直鏈型聚乙二醇分子和40，000道爾頓的分枝型聚乙二醇分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物可作為一種預(yù)防和治療性藥物，其特征在于，所述藥物為治療有效劑量的聚乙二醇化重組重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型的蛋白。
8.權(quán)利要求7所述作為預(yù)防和治療藥物的偶聯(lián)物，可用于預(yù)防和治療放化療引起的消化道粘膜損傷、急性化學(xué)性肝損傷或潰瘍性黏膜炎的臨床治療。
全文摘要
本發(fā)明公開了應(yīng)用聚乙二醇分子對重組缺失型人角質(zhì)細胞生長因子I型的化學(xué)修飾而成的偶聯(lián)物。其特征是以分子量為5K-40K的活化聚乙二醇分子與N末端缺失23位氨基酸的重組人角質(zhì)細胞生長因子I型(Δ23KGF-I)的第17位半胱氨酸的游離巰基共價化學(xué)偶聯(lián)，再經(jīng)柱層析分離純化制備的聚乙二醇角質(zhì)細胞生長因子。該偶聯(lián)物在保留人角質(zhì)細胞生長因子的生物學(xué)作用下，改變了其體內(nèi)的代謝動力學(xué)特性，對放化療引起的消化道粘膜損傷或潰瘍性黏膜炎，急性化學(xué)性肝損傷有預(yù)防和治療價值。
文檔編號A61P1/00GK102260342SQ201010184240
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者張增濤, 李傲, 范開, 陳勇, 陳海容, 陳清 申請人:重慶富進生物醫(yī)藥有限公司