專利名稱：一種快速鑒定楊樹(shù)葉片耐鹽潛力的改良培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)的植物檢測(cè)，特別涉及一種準(zhǔn)確鑒定楊樹(shù)葉片耐鹽潛力的改
良培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
鹽害是影響植物生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量以及森林面積的主要因素，全世界鹽堿地面積為 9. 54億公頃，并且由于次級(jí)鹽漬化，世界鹽堿地面積還在進(jìn)一步擴(kuò)大。林木在維護(hù)和改善生 態(tài)環(huán)境及水土保持方面發(fā)揮著重要的作用，隨著鹽漬化問(wèn)題的進(jìn)一步突出，人們對(duì)林木耐 鹽堿性研究的也越來(lái)越重視，希望能通過(guò)提高林木耐鹽堿性來(lái)改善土壤鹽漬化問(wèn)題。楊樹(shù) 屬于楊柳科落葉喬木，是世界上廣泛栽培的重要造林樹(shù)種和防護(hù)林之一。楊樹(shù)在缺林少木 的鹽堿、干旱、貧瘠和荒漠地區(qū)栽植，可迅速恢復(fù)植被，減少風(fēng)沙危害、降低地下水位、保護(hù) 農(nóng)田、減少地表蒸發(fā)，增加森林覆蓋率，也為紙漿用材林建設(shè)和工業(yè)商品林建設(shè)提供足夠的 原材料。耐鹽楊樹(shù)的選育一直世界各國(guó)的研究重點(diǎn)，通過(guò)雜交技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和耐鹽突變 體篩選，已經(jīng)獲得了許多不同耐鹽性的楊樹(shù)新品種。但由于耐鹽能力容易受植株發(fā)育階段、 生長(zhǎng)狀況、土壤類型和結(jié)構(gòu)、降雨量和蒸發(fā)量等許多不可控因素的影響，篩選出可遺傳變異 的機(jī)會(huì)極少，楊樹(shù)耐鹽能力的改良進(jìn)程極為緩慢。如何準(zhǔn)確地鑒別和篩選耐鹽的優(yōu)良基因 型，成為科學(xué)家苦苦探索的關(guān)鍵技術(shù)。在鹽脅迫環(huán)境中，楊樹(shù)逐漸出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、葉片失綠、葉緣褐化、枝條干稍等特點(diǎn)。 所以，對(duì)楊樹(shù)的耐鹽堿能力主要是通過(guò)比較其存活率、相對(duì)生長(zhǎng)量、鮮干重比等進(jìn)行直接的 鹽堿地篩選鑒定。但是楊樹(shù)生長(zhǎng)期長(zhǎng)，評(píng)價(jià)生長(zhǎng)性狀、物候性狀、生長(zhǎng)期等需要的時(shí)間較長(zhǎng)， 費(fèi)時(shí)費(fèi)力，誤差大，效率低，而且受環(huán)境因素的影響較大，準(zhǔn)確性差。在高鹽溶液環(huán)境中，楊樹(shù)根系吸收的鹽離子隨水份運(yùn)送到地上部分，首先在葉片 中進(jìn)行積累，積累到一定程度后導(dǎo)致葉片代謝紊亂，葉片生長(zhǎng)停止，衰老加劇，最后導(dǎo)致葉 片死亡。把離體葉片接種在添加GA-3的MS基本培養(yǎng)中，葉片明顯伸長(zhǎng)，說(shuō)明離體葉片能從 MS培養(yǎng)基中吸收營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行正常的代謝活動(dòng)。在這種改良培養(yǎng)基中添加高濃度的NaCl后，葉 片細(xì)胞在吸收營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)也會(huì)吸收Na+，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的Na+積累到一定水平后，會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng) 受阻，細(xì)胞形狀發(fā)生不規(guī)則變化，葉片幾乎不伸長(zhǎng)。在相同的鹽脅迫環(huán)境中，耐鹽基因型的 葉片伸長(zhǎng)情況和不耐鹽的基因型應(yīng)該有明顯的區(qū)別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種準(zhǔn)確鑒定楊樹(shù)葉片耐鹽潛力的改良培養(yǎng) 基。能夠準(zhǔn)確判斷基因型的耐鹽潛力，省工省時(shí)，工作效率極高。本發(fā)明的技術(shù)方案是—種快速鑒定楊樹(shù)葉片耐鹽潛力的改良培養(yǎng)基，其特點(diǎn)在于1)在MS培養(yǎng)基添加赤霉素GA-3，2)在添加赤霉素GA-3的MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl，
即在基本培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基中，添加0. 8mg/L GA_3，再添加不同濃度的NaCl，不同 NaCl濃度為0. 8-1. 2%，得到不同NaCl濃度的改良培養(yǎng)基。本發(fā)明效果是利用一種快速鑒定楊樹(shù)葉片耐鹽潛力的改良培養(yǎng)基，能準(zhǔn)確判斷基因型的耐鹽潛 力，省工省時(shí)，重復(fù)性好，對(duì)其他植物耐鹽潛力的快速鑒定具有重要參考價(jià)值，具有廣闊的 應(yīng)用前景。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)1.該技術(shù)體系發(fā)明的改良培養(yǎng)基，以楊樹(shù)葉片伸 長(zhǎng)和葉表皮細(xì)胞形狀、大小變化為依據(jù)，只需少量的楊樹(shù)葉片，就能迅速地鑒定出植株的耐 鹽能力，具有效率高、重復(fù)性好、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)。2.根據(jù)葉片伸長(zhǎng)長(zhǎng)度及葉表皮細(xì)胞的 形狀、大小變化淘汰大量不耐鹽的基因型，可以有效地壓縮田間試驗(yàn)的規(guī)模，節(jié)約時(shí)間和人 力，大幅度提高優(yōu)良耐鹽基因型的篩選效率，加速耐鹽植物育種的步伐。


圖1是培養(yǎng)前和培養(yǎng)后107和18-1離體葉片表皮細(xì)胞的形態(tài)變化情況a 107葉片接種前的表皮細(xì)胞，b 107葉片在含0. 8% NaCl的改良MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)6d后的變化，c 107葉片在含1. 0% NaCl的改良MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)6d后的變化；d 18-1葉片接種前的表皮細(xì)胞，e 18-1葉片在含0. 8% NaCl的改良MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)6d后的變化，f 18-1葉片在含1. 0% NaCl的改良MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)6d后的變化.圖2是在不同濃度NaCl的改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后楊樹(shù)葉片長(zhǎng)度的變化圖片中應(yīng)用改良MS培養(yǎng)基鑒定葉片長(zhǎng)度的試驗(yàn)結(jié)果表明，將葉片接種在含1.0% NaCl的改良培養(yǎng)基中6天后，耐鹽品種18-1楊的葉片明顯伸長(zhǎng)，而普通品種107葉片的伸 長(zhǎng)很少，18-1楊葉表皮細(xì)胞的形狀比107楊葉表皮細(xì)胞的形狀更加規(guī)則，并且細(xì)胞較大； 1. 2% NaCl的改良培養(yǎng)基中6天后，107楊的葉片不再伸長(zhǎng)，耐鹽品種18_1楊的葉片仍能繼 續(xù)伸長(zhǎng)。說(shuō)明楊樹(shù)植株的耐鹽能力和離體葉片以及葉表皮細(xì)胞的耐鹽能力高度相關(guān)，用改 良的培養(yǎng)基添加不同濃度的NaCl進(jìn)行處理，通過(guò)測(cè)定離體葉片伸長(zhǎng)長(zhǎng)度、觀察葉表皮細(xì)胞 的形狀大小變化，能快速、準(zhǔn)確地篩選出耐鹽楊樹(shù)植株。
具體實(shí)施例方式一種快速鑒定楊樹(shù)葉片耐鹽潛力的改良培養(yǎng)基，其特點(diǎn)在于(1)在MS培養(yǎng)基添加赤霉素GA-3，(2)在添加赤霉素GA-3的MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl，即在基本培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基中，添加0. 8mg/L GA-3,再添加不同濃度的NaCl，不同 NaCl濃度為0. 8-1. 2%，得到不同NaCl濃度的改良培養(yǎng)基。本快速鑒定楊樹(shù)葉片耐鹽潛力的改良培養(yǎng)基的使用1)基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加GA-3，離體葉片接種在此培養(yǎng)基中，葉片出現(xiàn)明 顯的伸長(zhǎng)現(xiàn)象。2)在改良培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl，其葉片伸長(zhǎng)的長(zhǎng)度在不同的楊樹(shù)基因 型中存在很大的差異。
3)將葉片接種在高鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定的時(shí)間，葉表皮細(xì)胞的形狀和大小發(fā)生明 顯變化。以對(duì)細(xì)胞無(wú)害的0. 03%活體染料中性紅為指示劑，對(duì)楊樹(shù)葉表皮細(xì)胞染色15分 鐘，在顯微鏡下觀察葉表皮細(xì)胞的形狀和大小變化，能夠快速準(zhǔn)確地判斷基因型的耐鹽能 力。本快速鑒定楊樹(shù)葉片耐鹽潛力的改良培養(yǎng)基使用操作1)將葉片接種在含NaCl的改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間，耐鹽潛力不同的基因型， 其葉片伸長(zhǎng)長(zhǎng)度及葉表皮細(xì)胞的大小有明顯的差異。2)以楊樹(shù)幼嫩葉片為外植體，沿中脈垂直的方向，將葉片剪成0. 5X2. Ocm2大小的 長(zhǎng)方形，葉背向下平放于含有不同濃度NaCl的改良培養(yǎng)基中，6天后測(cè)量葉片的長(zhǎng)度變化 并于顯微鏡下觀察楊樹(shù)表皮細(xì)胞形狀和大小的變化。耐鹽品種葉片長(zhǎng)度增加明顯，其葉表 皮細(xì)胞明顯伸長(zhǎng)，不耐鹽品種葉片幾乎不伸長(zhǎng)，葉表皮細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則收縮。說(shuō)明利用新發(fā) 明的培養(yǎng)基，能夠把耐鹽和不耐鹽的基因型鑒別出來(lái)。針對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)鑒定植物耐鹽潛力所需時(shí)間長(zhǎng)、所需材料多、重復(fù)性差的問(wèn)題，發(fā)明 人進(jìn)行了大量的研究工作，最終建立了利用改良MS培養(yǎng)基準(zhǔn)確鑒定楊樹(shù)耐鹽潛力的新方 法。本發(fā)明旨在提供一種科學(xué)高效的耐鹽性快速鑒定方法，通過(guò)該方法淘汰大量不耐鹽的 基因型，實(shí)現(xiàn)耐鹽基因和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)基因的結(jié)合，加速耐鹽楊樹(shù)新品種的選育。確定能顯著提高楊樹(shù)葉片生長(zhǎng)速度的改良MS培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基是目前使用最普遍的培養(yǎng)基，能夠保證組織生長(zhǎng)所需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，但楊 樹(shù)離體葉片在MS培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度極慢。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的摸索，發(fā)現(xiàn)添加一定數(shù)量的赤 霉素(GA-3)能夠有效地提高楊樹(shù)離體葉片的生長(zhǎng)速度。將葉片接種在含有0.2、0.4、0.6、 0. 8,1. 0,1. 2mg/L GA-3的改良培養(yǎng)基中，6天后觀察葉片伸長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)含有0. 2,0. 4mg/ L GA-3的改良培養(yǎng)基對(duì)葉片伸長(zhǎng)沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用；激素濃度過(guò)高也不利于葉片伸長(zhǎng)。 0. 8mg/L GA-3的改良培養(yǎng)基對(duì)葉片伸長(zhǎng)起到明顯的促進(jìn)作用，葉片接種6天后，其葉片長(zhǎng) 度平均增加0. 8-1. Ocm0因此，我們把含有0. 8mg/L GA-3的改良培養(yǎng)基作為楊樹(shù)葉片伸長(zhǎng) 培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。篩選能夠區(qū)分不同耐鹽能力的改良培養(yǎng)基在改良培養(yǎng)基中添加不同濃度NaCl，將楊樹(shù)葉片接種在含不同濃度NaCl的改良 MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6d后，測(cè)量其葉片的長(zhǎng)度變化；并用刀片輕輕刮葉片，直到刮成透明的薄 層為止，得到下表皮，用0. 03%中性紅溶液染色15min，脫色后于顯微鏡下觀察楊樹(shù)葉片下 表皮細(xì)胞形狀、大小的變化。當(dāng)改良培養(yǎng)基中含有0. 2% -0. 6% NaCl時(shí)，耐鹽楊樹(shù)和不耐 鹽楊樹(shù)的葉片都能正常生長(zhǎng)，只是耐鹽楊樹(shù)葉片的生長(zhǎng)速度明顯較快。在含0. 8% -1. 2% NaCl的改良培養(yǎng)基中，不耐鹽楊樹(shù)的葉片停止生長(zhǎng)甚至縮小，耐鹽楊樹(shù)的葉片則繼續(xù)生長(zhǎng)。 表皮細(xì)胞的伸長(zhǎng)程度和形態(tài)變化與離體葉片長(zhǎng)度的變化完全一致。離體葉片伸長(zhǎng)速度與耐鹽性的相關(guān)性研究楊樹(shù)離體葉片伸長(zhǎng)及葉表皮細(xì)胞形狀、大小變化的試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著改良培養(yǎng) 基中NaCl濃度的增加，107楊葉片長(zhǎng)度的增加也明顯降低；當(dāng)其接種在含有1. 2% NaCl的 改良培養(yǎng)基時(shí)，葉片不再伸長(zhǎng)，葉表皮細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則伸縮。耐鹽品種18-1楊葉片接種在 含有1. 2% NaCl的改良培養(yǎng)基6天后，葉片長(zhǎng)度增加0. 5cm，其葉表皮細(xì)胞的形狀比不耐鹽 品種的更加規(guī)則，且細(xì)胞更大。說(shuō)明楊樹(shù)植株的耐鹽能力和其葉片在含鹽培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度高度相關(guān)，將楊樹(shù)葉片接種在改良培養(yǎng)基中，能夠快速、準(zhǔn)確地篩選出楊樹(shù)的耐鹽植株 和耐鹽新品種。施例1 從中科院引進(jìn)的 107 號(hào)楊(PopulusXeuramericana ‘Neva，)和轉(zhuǎn) NTHKl 基因楊樹(shù)18-1。歐美楊107起源于意大利，是卡薩歹 蒙費(fèi)拉托楊樹(shù)栽培研究所SekaWain博士于 1973年進(jìn)行人工控制雜交選育出來(lái)的。107號(hào)是中國(guó)林科院承擔(dān)的國(guó)家"七五"科技成 果"國(guó)外楊樹(shù)引種及區(qū)域化試驗(yàn)"中重點(diǎn)推出的新品種，又名"美麗天使"楊。該項(xiàng)目曾 獲得1991年能源部科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)，1993年林業(yè)部科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)，1996年國(guó)家科技進(jìn)步 三等獎(jiǎng)殊榮。經(jīng)近十年的苗期、無(wú)性系對(duì)比林測(cè)試和區(qū)域化試驗(yàn)，歐美楊107號(hào)表現(xiàn)良好， 適合我國(guó)黃河流域、淮河流域及遼河以南流域廣泛栽植，成為我國(guó)北方包括西北地區(qū)防護(hù) 林帶、用材林的主要造林樹(shù)種之一。張勁松等(1999)等從煙草中克隆了乙烯受體基因類似物NTHK1，利用pBin438載 體，構(gòu)建了含有煙草乙烯受體基因NTHKl的植物表達(dá)載體，運(yùn)用農(nóng)桿菌法，分別將上述載體 轉(zhuǎn)化受體楊樹(shù)107 (Populus Xeuramericana ‘Neva’ )中，經(jīng)分子鑒定后，獲得轉(zhuǎn)基因植株 30多株。然后，將轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)和受體去葉后分別置于含0. 2%，0. 4%，0. 6%和0. 8% NaCl 中進(jìn)行耐鹽性測(cè)試。篩選出耐0. 8% NaCl的NTHKl (煙草乙烯受體基因)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)新品 系 18-1。取18-1和107楊相同大小枝條，在不同海鹽條件下水培，通過(guò)生長(zhǎng)表現(xiàn)和根系發(fā) 育狀況進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)研究，18-1楊能在0. 8%海鹽條件下，107楊在0. 4%條件下能正常 生長(zhǎng)。以107和18-1 —年生扦插株系為材料，從植株頂端起，取第3、4片全展葉為外植 體，自來(lái)水沖洗30min，10%酒精消毒10s，無(wú)菌水沖洗2次，每次lmin，0. 1 % HgC12浸泡 4min，無(wú)菌水漂洗4遍，每次2min。沿葉片中脈垂直方向，將葉片剪成0. 5X2. Ocm2大小的 長(zhǎng)方形，葉背向下平放于含有不同濃度NaCl的改良培養(yǎng)集中，6天后測(cè)量其葉片的長(zhǎng)度變 化并于顯微鏡下觀察楊樹(shù)下表皮細(xì)胞形狀、大小的變化。耐鹽品種18-1楊葉片接種在含有 1. 2% NaCl的改良培養(yǎng)基6天后，葉片長(zhǎng)度增加0. 5cm，其葉表皮細(xì)胞的形狀比不耐鹽品種 的更加規(guī)則，且更大；普通品種107楊葉片接種在1. 2% NaCl的改良培養(yǎng)基時(shí)，葉片不再伸 長(zhǎng)，葉表皮細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則收縮。說(shuō)明用改良的培養(yǎng)基添加不同濃度的NaCl進(jìn)行處理，通 過(guò)測(cè)定葉片伸長(zhǎng)長(zhǎng)度、觀察葉表皮細(xì)胞的形狀、大小變化，能夠把耐鹽基因型鑒別出來(lái)。
權(quán)利要求
一種快速鑒定楊樹(shù)葉片耐鹽潛力的改良培養(yǎng)基，其特點(diǎn)在于1)在MS培養(yǎng)基添加赤霉素GA-3，2)在添加赤霉素GA-3的MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速鑒定楊樹(shù)葉片耐鹽潛力的改良培養(yǎng)基，其特征在 于在基本培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基中，添加0. 8mg/L GA-3，再添加不同濃度的NaCl，不同NaCl濃 度為0. 8-1. 2%，得到不同NaCl濃度的改良培養(yǎng)基。
全文摘要
一種快速鑒定楊樹(shù)葉片耐鹽潛力的改良培養(yǎng)基，即在基本培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基中，添加0.8mg/L GA-3，再添加不同濃度的NaCl，不同NaCl濃度為0.8-1.2％，得到不同NaCl濃度的改良培養(yǎng)基。使用它在楊樹(shù)葉片接種中，葉片顯著伸長(zhǎng)。以中性紅為染料指示劑，對(duì)楊樹(shù)的葉表皮細(xì)胞進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察葉表皮細(xì)胞的形狀和大小變化，進(jìn)而確定楊樹(shù)不同基因型的耐鹽能力。在含有高鹽濃度的改良培養(yǎng)基中，耐鹽能力不同的楊樹(shù)，其離體葉片的生長(zhǎng)速度和表皮細(xì)胞伸長(zhǎng)程度不同。利用改良培養(yǎng)基測(cè)定離體葉片的伸長(zhǎng)速度及觀察葉表皮細(xì)胞的形狀和大小，能夠準(zhǔn)確判斷基因型的耐鹽潛力，省工省時(shí)，重復(fù)性好，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101878735SQ20101019070
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者劉仲齊, 張穎, 楊迎霞 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心