專利名稱：農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及麻風(fēng)樹的組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域及基因工程領(lǐng)域，尤其是指農(nóng)桿菌介導(dǎo)對 麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。
背景技術(shù)：
麻風(fēng)樹(Jatopha curcas)，又名小桐子、柴油樹，為大戟科麻風(fēng)樹屬，多年生落葉 灌木或小喬木，分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。它為喜光陽性植物，根系粗壯發(fā)達，具有較強的 耐干旱瘠薄能力，可以種植在其他植物不易生長的土地上，是干旱地區(qū)理想的造林樹種。麻 風(fēng)樹種仁含油量高達50% 60%，可以提煉出不含硫、無污染、符合歐四排放標(biāo)準(zhǔn)的生物 柴油，是世界公認(rèn)的生物能源樹；也可作藥用，常用于清熱解毒，消腫散瘀等；近年來的研 究發(fā)現(xiàn)，該植物還具有顯著的抗癌活性。因此麻風(fēng)樹具有廣泛的開發(fā)利用價值。目前，我國在麻風(fēng)樹育種方面的工作才剛剛開始。由于麻風(fēng)樹多為野生狀態(tài)，又為 木本植物，采用常規(guī)育種來改變其遺傳性狀十分困難。因此，采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，如轉(zhuǎn) 基因技術(shù)進行輔助育種成為首選。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的前提是高效的離體再生系統(tǒng)。近些年 來，麻瘋樹組織培養(yǎng)技術(shù)也獲得成功，采用的外植體有種胚、子葉、上胚軸、下胚軸、葉柄、葉 片，胚乳，花藥，甚至老齡樹(20年以上)長出的幼嫩莖段，然而再生頻率有待進一步提高。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)因能主動導(dǎo)入外源基因，定向改造植物性狀日益受到人們的重 視。植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可分為兩大類一類是直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，包括基因槍法、原生質(zhì)體 法、脂質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法等，其中基因槍轉(zhuǎn)化法是代表； 另一類是生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法。以根癌農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化是目前最有效的途徑之一。然而，由于麻風(fēng)樹的遺傳轉(zhuǎn)化研究起步 較晚，因此，對麻風(fēng)樹進行遺傳改良，通過導(dǎo)入外源基因，對其進行定向性狀改造，具有十分 重要的經(jīng)濟價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方 法，解決現(xiàn)有育種技術(shù)無法遺傳改良的問題。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn) 化的方法，包括以下步驟(1)制備麻風(fēng)樹外植體以及農(nóng)桿菌液，外植體經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后進行共培養(yǎng)；(2)共培養(yǎng)后的外植體接入篩選培養(yǎng)基C13PC進行培養(yǎng)，從而獲得抗性愈傷組織， 所述篩選培養(yǎng)基C13PC是含有l(wèi)-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素；(3)分化出不定芽；以及(4)生根培養(yǎng)，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。所述第(1)步驟中，共培養(yǎng)優(yōu)選采用C13A培養(yǎng)基含有50-200 u M乙酰丁酰酮。所述第(1)步驟中，共培養(yǎng)采用優(yōu)選采用C13A固體培養(yǎng)基，其含有1. 0-3. Omg/L6_芐基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，以及50-200 y M乙酰丁酰酮的MS培養(yǎng)基；麻風(fēng)樹 外植體的制備經(jīng)由以下工藝挑選麻風(fēng)樹種子經(jīng)消毒后，取出完整的胚和子葉，于MS培養(yǎng) 基培養(yǎng)，獲得子葉，切制成外植體；農(nóng)桿菌菌液是優(yōu)選采用C13A液體培養(yǎng)基重懸浮離心收 集的農(nóng)桿菌體制得。所述第(1)步驟中，獲得麻風(fēng)樹外植體工藝中，接種于MS培養(yǎng)基萌發(fā)，是將接好的 材料先暗培養(yǎng)2-4天，然后光照培養(yǎng)10-12天，種子萌發(fā)的培養(yǎng)條件是，溫度23-26°C，光照 12-16小時/天，光照強度1800-20001x。所述第(1)步驟中，農(nóng)桿菌菌液的準(zhǔn)備、浸染及共培養(yǎng)，進一步包括以下工藝步 驟(a)挑取農(nóng)桿菌的單克隆于含有抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm震蕩培 養(yǎng)20-24小時，然后按照1 100轉(zhuǎn)接，震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，0D600 = 0.8-1.0，將菌液 轉(zhuǎn)入50ml離心管，常溫，4000rpm離心20分鐘收集菌體，用C13A液體培養(yǎng)基重新懸浮農(nóng)桿 菌，調(diào)至0D600 = 0. 3-0.6，28°C震蕩培養(yǎng)1-2個小時，備用；(b)將切好的葉片放入容器中，加入準(zhǔn)備好的菌液，置于搖床慢速震蕩5-15分鐘； 以及(c)取出浸染過的材料，倒掉菌液，將葉片放在濾紙上，吸去多余的菌液，接入 C13A固體培養(yǎng)基，置于23-26°C黑暗共培養(yǎng)2_4天。所述第(2)步驟的篩選培養(yǎng)基C13PC是優(yōu)選采用含有1. 0-3. Omg/L 6_芐基嘌呤， 0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，l_3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L頭孢噻肟鈉
的MS培養(yǎng)基。所述第(2)步驟進一步包括以下工藝步驟(a)取出共培養(yǎng)后的外植體，放入容器中，加入無菌水洗后，用含250_500mg/L頭 孢霉素的無菌水洗；(b)洗過的愈傷組織放在濾紙上，吸去多余的水，接入篩選培養(yǎng)基C13PC，所述篩 選培養(yǎng)基C13PC較佳采用MS培養(yǎng)基含1. 0-3. Omg/L 6-芐基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁 酸，l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L頭孢噻肟鈉，2-3%蔗糖，0. 7%瓊脂， 以及pH5. 8-6.0)；以及(c)置于23_26°C暗培養(yǎng)14_21天，獲得抗性愈傷組織。所述第(3)步驟，是將獲得的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SR13PC進行培養(yǎng)，該 分化培養(yǎng)基SR13PC優(yōu)選含l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素。所述第(3)步驟的分化培養(yǎng)基SR13PC較佳采用MS培養(yǎng)基含0. 25-2. 0mg/L6-芐 基嘌呤，0. 1-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，0. 01-0. 2mg/L赤霉素，l_3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉 素，250-500mg/L頭孢霉素，20_30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，以及pH5. 8-6. 0 ；接好的抗性愈傷組 織在23-26°C，光照培養(yǎng)10-60天即可得到不定芽，培養(yǎng)條件為，光照12-16小時/天，光照 強度 1800-20001x。所述第(4)步驟進一步包括以下工藝步驟將分化出的不定芽優(yōu)選在0. 1-1. Omg/ L的3-吲哚丁酸溶液中浸泡2-10分鐘后，接種到1/2MS培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，10-60天即 可生根，生根培養(yǎng)條件為，23-26°C，光照12-16小時/天，光照強度1800-20001X，從而獲得
轉(zhuǎn)基因植株。
上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法，農(nóng)桿菌攜帶有目的基因。本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明利用農(nóng)桿菌浸染和共培養(yǎng)，在有效的抗性愈傷組 織篩選和分化體系基礎(chǔ)上，對麻風(fēng)樹進行轉(zhuǎn)基因，使采用轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)入功能基因?qū)β轱L(fēng) 樹進行遺傳改良成為可能，轉(zhuǎn)化效率可達10%左右甚至10%以上。因農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方 法具轉(zhuǎn)化的基因多為單拷貝，且有明確的邊界序列，遺傳穩(wěn)定，多數(shù)符合孟德爾遺傳規(guī)律， 成本低廉，且麻風(fēng)樹離體再生系統(tǒng)穩(wěn)定性好，操作簡便，再生效率高，從愈傷組織的誘導(dǎo)到 再生植株的獲得只需要80-90天。本發(fā)明選擇了合適的篩選劑濃度，建立了有效的抗性愈傷組織篩選體系，既避免 了非轉(zhuǎn)化愈傷的大量逃逸，又獲得了抗性愈傷組織。與其他部位相比，利用麻風(fēng)樹的成熟種子萌發(fā)后的子葉作為外植體不僅愈傷得出 率和愈傷分化率較高，且不受季節(jié)的限制，為大批量進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化奠定了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明在抗性愈傷組織分化階段采用了合適的篩選劑濃度，既對非轉(zhuǎn)化植株進行 了抑制，避免了后期大量的分子檢測工作，又保證了抗性植株的正常生長和分化。本發(fā)明在抗性植株生根階段選用吲哚丁酸溶液浸泡，獲得了較高的生根率。


圖1是本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測圖。
具體實施例方式本發(fā)明農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法主要涉及以下個步驟步驟一種子的消毒及萌發(fā)；步驟二 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)；步驟三農(nóng)桿菌的去除及抗性愈傷組織的誘導(dǎo)；步驟四分化出不定芽；步驟五生根培養(yǎng)；步驟六再生植株的移栽；以及步驟七轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測。下面對各步驟進一步描述。其中步驟一，采集中國本土野生麻風(fēng)樹種子。挑取飽滿的種子，剝?nèi)ネ鈿?，?jīng)消毒 處理后剝?nèi)ヅ呷?，將完整的胚和子葉接種在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，得到無菌苗。MS 培養(yǎng)基含 20_30g/L 蔗糖，7g/L 瓊脂，以及 pH5. 8-6. 0。種子的消毒方法包括以下工藝步驟(1)75% (體積比)乙醇浸泡30秒；(2)無菌水洗2-3次；(3) 0. 1 % g/mL 升汞浸泡 3-5 分鐘；(4)倒出升汞，用無菌水洗4-6次，每次5分鐘；(5)加入無菌水，浸泡2-4小時；(6)剝?nèi)ヅ呷椋⊥暾呐吆妥尤~，接種于MS培養(yǎng)基(20_30g/L蔗糖，7g/L瓊脂， PH5. 8-6. 0)中，每瓶培養(yǎng)基接2-3顆；
(7)接好的材料先在暗培養(yǎng)2-4天，然后光照培養(yǎng)10-12天。種子萌發(fā)的培養(yǎng)條件是，溫度23-26 V，光照12_16小時/天，光照強度 1800-20001x。步驟二中還主要包括以下工藝步驟1、農(nóng)桿菌菌液的準(zhǔn)備，具體為 挑取農(nóng)桿菌的單克隆，如EHA105，LBA4404, GV3101等，分別含有表達載體如 PEV-GUS, pBI-GUS-hyg, pBI-GUS-bar等，或其它攜帶目的基因的載體，于含有相應(yīng)抗生素 的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)20-24小時，然后按照體積比為1 100轉(zhuǎn)接 YEP液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，農(nóng)桿菌的濃度為0D600 = 0. 8-1. 0。將菌液轉(zhuǎn) 入50mL離心管，常溫，4000rpm離心20分鐘收集菌體，用C13A液體培養(yǎng)基重新懸浮農(nóng)桿菌， 調(diào)至0D600 = 0. 3-0. 6，28°C培養(yǎng)1-2個小時，備用。其中，所用YEP液體培養(yǎng)基配方及PH值為10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，IOg/ L氯化鈉，pH7. 0。C13A液體培養(yǎng)基是指MS培養(yǎng)基中含1.0-3.0mg/L 6_芐基嘌呤，0. 25-1. Omg/ L3-吲哚丁酸，50-200 μ M 乙酰丁酰酮，20-30g/L 蔗糖，pH5. 8-6. 0。2、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng)，進一步包括以下工藝(1)取滅菌的盤，中間墊上兩層濾紙；(2)取出無菌苗，用剪刀剪下長勢較好的子葉，放入盤中；(3)然后加入少量水，用刀將其切成0. 5X0. 5cm大?。?4)將切好的葉片放入50或IOOmL三角瓶中，加入準(zhǔn)備好的菌液，置于搖床慢速搖 5-15分鐘；(5)取出浸染過的材料，倒掉菌液，將葉片放在濾紙上，吸去多余的菌液，接 入C13A固體培養(yǎng)基；其中C13A固體培養(yǎng)基是指MS培養(yǎng)基含1. 0-3. Omg/L 6-芐基 嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚 丁酸，50-200 μ M 乙酰丁 酰酮，20_30g/L 蔗糖，7g/L 瓊脂， ρΗ5· 8-6. 0 ；(6)接好的材料在23-26 °C暗培養(yǎng)2-4天。所述步驟三進一步包括以下工藝(1)取出共培養(yǎng)后的材料，放入50或IOOmL三角瓶中；(2)加入無菌水洗2-3次；(3)加入含500mg/L頭孢霉素的無菌水洗2_3次，每次5分鐘；(4)洗過的材料放在濾紙上，吸去多余的水，接入篩選培養(yǎng)基C13PC ；該篩選培 養(yǎng)基C13PC是指MS培養(yǎng)基含1.0-3. Omg/L 6-芐基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸， l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L頭孢噻肟鈉，20_30g/L蔗糖，7g/L瓊脂， ρΗ5· 8-6. 0 ；(5)接好的材料在23-26°C暗培養(yǎng)14-21天，獲得抗性愈傷組織。步驟四進一步包括以下工藝步驟(1)將獲得的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SR13PC ；該分化培養(yǎng)基SR13PC是指 MS培養(yǎng)基含 0. 25-2. Omg/L 6-芐基嘌呤，0. 1-1. 0mg/L 3-吲哚丁酸，0. 01-0. 2mg/L赤霉素， l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L頭孢霉素，20_30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，以及 ρΗ5· 8-6. O ；(2)接好的材料在23-26°C，光照培養(yǎng)10_60天即可得到不定芽。培養(yǎng)條件為，光 照12-16小時/天，光照強度1800-20001x。步驟五中，將分化出的不定芽在0. 1-1. Omg/L的3_吲哚丁酸溶液中浸泡2_10分 鐘后，接種到生根培養(yǎng)基上10-60天即可生根。生根培養(yǎng)基為，1/2MS培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)條件為，23_26°C，光照12-16小時/天，光照強度1800_20001X。步驟六中，待再生苗根長到2 3cm時進行煉苗移栽。步驟七中，用CTAB法提取再生植株的基因組DNA，以目的基因序列設(shè)計引物，進行 PCR擴增，檢測獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過以上的方法可以實現(xiàn)麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化，其以根癌農(nóng)桿菌對植物釋放的化 學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生趨化反應(yīng)，向植物受傷組織集中。經(jīng)共培養(yǎng)后，受傷部位的化學(xué)誘導(dǎo)物透過農(nóng)桿 菌的細(xì)胞膜使Ti質(zhì)粒上的Vir基因活化。Vir基因產(chǎn)物使Ti質(zhì)粒上的T-DNA進入植物細(xì) 胞，并整合到植物核基因組中。而目的基因插入在T-DNA左右邊界區(qū)內(nèi)，因此插入在T-DNA 左右邊界區(qū)內(nèi)的目的基因也隨之整合到植物染色體上，從而使目的基因(如植物抗病抗逆 相關(guān)CN基因和ERFs基因)在植物細(xì)胞中得到表達。攜帶各種不同目的基因的農(nóng)桿菌，按 上述方法均可實現(xiàn)介導(dǎo)，這樣根據(jù)插入的目的基因不同，就可以實現(xiàn)對麻風(fēng)樹進行定向改 造，從而實現(xiàn)對麻風(fēng)樹的遺傳改良，以提高其各種特性，如提高油含量、產(chǎn)量，抗寒，抗病，抗
圼絕 千寸。下面結(jié)合實例詳述描述本發(fā)明的實施方案。需要說明的是，下述實例是說明性的， 不是限定性的，不能以下述實例來限定本發(fā)明的保護范圍。實例1本實例以農(nóng)桿菌介導(dǎo)將⑶S基因轉(zhuǎn)入云南元謀野生麻風(fēng)樹，具體闡述本發(fā)明創(chuàng)造 的方法，樣品的總數(shù)量以及經(jīng)各處理步驟后的存活數(shù)量請參考表1。各工藝步驟具體如下步驟一采集云南元謀野生麻風(fēng)樹種子。挑取飽滿的種子，剝?nèi)ネ鈿ぃ?5%乙醇中 浸泡30秒，無菌水沖洗2-3次，然后在0. 1 %氯化汞中消毒3-5分鐘，無菌水沖洗5-7次， 然后用無菌水浸泡2-4小時后剝?nèi)ヅ呷?。取完整的胚和子葉，接種于MS培養(yǎng)基中，每瓶接 2-3顆，23-26°C暗培養(yǎng)2-4天后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)10-12天，得到實驗用的無菌苗。步驟二 挑取農(nóng)桿菌EHA105(含有表達載體PEV-GUS)的單克隆于含有抗生素利福 平(20mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEP培養(yǎng)基中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)20-24小時，然后 按照1 100體積比轉(zhuǎn)接至300mLYEP培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)對數(shù)生長期，農(nóng)桿菌濃度為0D600 =0. 8-1. O。將菌液轉(zhuǎn)入50mL離心管，常溫，4000rpm離心20分鐘收集菌體，用C13A液體 培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基含1. 0-3. Omg/L 6-芐基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，50-200 μ M乙 酰丁酰酮，20-30g/L蔗糖，以及pH5. 8-6. 0)重新懸浮農(nóng)桿菌，調(diào)至0D600 = 0. 3-0. 6，28 V 培養(yǎng)1-2個小時，備用。取滅菌的盤，中間墊上兩層濾紙。選取生長健壯，葉面平整均勻的無菌苗子葉，力口 入少量水，切成0. 5X0. 5cm(但不限于)大小。將切好的葉片放入50或IOOmL三角瓶中， 加 入準(zhǔn)備好的菌液，置于搖床慢速搖10分鐘。然后取出浸染過的材料，倒掉菌液，將葉片 放在濾紙上，吸去多余的菌液，接入C13A固體培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基含1. 0-3. Omg/L 6-芐基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，50-200 μ M乙酰丁酰酮，20_30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，以及 ρΗ5· 8-6. 0)，置于 23-26°C 暗培養(yǎng) 2-4 天。
步驟三取出共培養(yǎng)后的材料(外植體部數(shù)為580塊)，放入50或IOOmL三角瓶 中，加入無菌水洗2-3次，再用含500mg/L頭孢霉素的無菌水洗2_3次，每次5分鐘。洗過 的材料放在濾紙上，吸去多余的水，接入篩選培養(yǎng)基C13PC (MS培養(yǎng)基含1. 0-3. Omg/L 6-芐 基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，l_3mg/L 草胺磷，250_500mg/L 頭孢噻肟鈉，20_30g/L 蔗糖，7g/L瓊脂，以及pH5. 8-6. 0)，23_26°C暗培養(yǎng)14-21天，獲得抗性愈傷組織320塊，抗 性愈傷組織率為55. 2%左右，見表1。步驟四將獲得的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SR13PC(MS培養(yǎng)基含 0. 25-2. Omg/L 6-芐基嘌呤，0. 1-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，0. 01-0. 2mg/L 赤霉素，l_3mg/L 草 胺磷，250-500mg/L 頭孢霉素，20-30g/L 蔗糖，7g/L 瓊脂，以及 pH5. 8-6. 0)，23-26°C，光照培 養(yǎng)30天即可得到不定芽。培養(yǎng)條件為，光照12-16小時/天，光照強度1800-20001X。分化 愈傷存活70塊，抗性愈傷組織分化率為18%。步驟五將分化出的不定芽在0. 5mg/L的3_吲哚丁酸溶液中浸泡5分鐘后，接種 到生根培養(yǎng)基1/2MS上光照培養(yǎng)30天即可生根，待再生苗根長到2 3cm時進行煉苗移栽 至溫室。獲得再生植株數(shù)為55株。
最后，用CTAB法提取再生植株的基因組總DNA，以⑶S基因序列設(shè)計一對引物P 1 5' GTGAGCGTCGCAGAAC ATTAC 3'P4 5' ACGCCATTTGAAGCCGATGT 3‘進行PCR擴增，檢測獲得轉(zhuǎn)基因植株，參照圖1，其中7為負(fù)對照(未轉(zhuǎn)化植株)， 1-5為轉(zhuǎn)基因樣品(其它樣品因無信號而從視圖上省略)，8為負(fù)對照(水)，6為正對照(質(zhì) 粒)，9為DNA分子標(biāo)量(DNA Ladder)。經(jīng)PCR擴增結(jié)果顯示，有5株樣品擴出與質(zhì)粒正對 照大小一致的條帶(約IOOObp)，呈陽性，為轉(zhuǎn)基因植株。其轉(zhuǎn)化效率為9. 1%。表1本發(fā)明實例中的抗性愈傷組織得出率及分化率
權(quán)利要求
農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法，包括以下步驟(1)制備麻風(fēng)樹外植體以及農(nóng)桿菌液，外植體經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后進行共培養(yǎng)；(2)共培養(yǎng)后的外植體接入篩選培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從而獲得抗性愈傷組織，所述篩選培養(yǎng)基含有1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素；(3)分化出不定芽；以及(4)生根培養(yǎng)，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。
2.如權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述 第(1)步驟中，共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基含有50-200 yM乙酰丁酰酮。
3.如權(quán)利要求2所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述 第⑴步驟中，共培養(yǎng)采用C13A固體培養(yǎng)基，其含有1. 0-3. Omg/L6-芐基嘌呤，0. 25-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，以及50-200 u M乙酰丁酰酮的MS培養(yǎng)基；麻 風(fēng)樹外植體的制備經(jīng)由以下工藝挑選麻風(fēng)樹種子經(jīng)消毒后，取出完整的胚和子葉，于MS 培養(yǎng)基萌發(fā)，獲得子葉，切制成外植體；農(nóng)桿菌菌液是用C 13A液體培養(yǎng)基重懸浮離心收集 的農(nóng)桿菌體制得。
4.如權(quán)利要求3所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述 第(1)步驟中，獲得麻風(fēng)樹外植體工藝中，接種于MS培養(yǎng)基萌發(fā)，是將接好的材料先暗培養(yǎng) 2-4天，然后光照培養(yǎng)10-12天，種子萌發(fā)的培養(yǎng)條件是，溫度23-26°C，光照12-16小時/ 天，光照強度1800-20001X ；所述第(1)步驟中，農(nóng)桿菌菌液的準(zhǔn)備、浸染及共培養(yǎng)，進一步 包括以下工藝步驟(a)挑取農(nóng)桿菌的單克隆于含有抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng) 20-24小時，然后按照1 100轉(zhuǎn)接，震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，0D600 = 0. 8-1. 0，將菌液轉(zhuǎn) 入50ml離心管，常溫，4000rpm離心20分鐘收集菌體，用C13A液體培養(yǎng)基重新懸浮農(nóng)桿菌， 調(diào)至0D600 = 0. 3-0. 6，28°C震蕩培養(yǎng)1-2個小時，備用；(b)將切好的葉片放入容器中，加入準(zhǔn)備好的菌液，置于搖床慢速震蕩5-15分鐘；以及(c)取出浸染過的材料，倒掉菌液，將葉片放在濾紙上，吸去多余的菌液，接入C13A固 體培養(yǎng)基，置于23-26°C黑暗共培養(yǎng)2-4天。
5.如權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述 第(2)步驟的篩選培養(yǎng)基為C13PC培養(yǎng)基，其含有1. 0-3. Omg/L 6-芐基嘌呤，0. 25-1. Omg/ L 3-吲哚丁酸，l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L頭孢噻肟鈉的MS培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求5所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述 第(2)步驟進一步包括以下工藝步驟(a)取出共培養(yǎng)后的外植體，放入容器中，加入無菌水洗后，用含250-500mg/L頭孢霉 素的無菌水洗；(b)洗過的外植體放在濾紙上，吸去多余的水，接入篩選培養(yǎng)基C13PC，所述篩選培養(yǎng) 基C 13PC是指MS培養(yǎng)基含1. 0-3. Omg/L 6-芐基嘌呤，0. 25-1. 0mg/L3-吲哚丁酸，l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素，250-500mg/L頭孢噻肟鈉，2-3%蔗 糖，0.7%瓊脂，以及pH5. 8-6.0)；以及(c)置于23-26°C暗培養(yǎng)14-21天，獲得抗性愈傷組織。
7.如權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述第(3)步驟，是將獲得的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基SR13PC進行培養(yǎng)，該分化培養(yǎng)基含 l-3mg/L草胺磷或l-10mg/L潮霉素。
8.如權(quán)利要求7所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述 第(3)步驟的分化培養(yǎng)基為SR13PC培養(yǎng)基，是MS培養(yǎng)基含0. 25-2. Omg/L 6-芐基嘌呤， 0. 1-1. Omg/L 3-吲哚丁酸，0. 01-0. 2mg/L 赤霉素，l_3mg/L 草胺磷或 l-10mg/L 潮霉素， 250-500mg/L頭孢霉素，20-30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，以及pH5. 8-6. 0 ；接好的抗性愈傷組織在 23-26°C，光照培養(yǎng)10-60天即可得到不定芽，培養(yǎng)條件為，光照12-16小時/天，光照強度 1800-20001x。
9.如權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述 第(4)步驟進一步包括以下工藝步驟將分化出的不定芽在0. 1-1. Omg/L的3-吲哚丁酸溶 液中浸泡2-10分鐘后，接種到1/2MS培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)條件為，23-26°C，光照 12-16小時/天，光照強度1800-20001X，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法，其特 征在于所述農(nóng)桿菌攜帶有目的基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及農(nóng)桿菌介導(dǎo)對麻風(fēng)樹進行基因轉(zhuǎn)化的方法，包括以下步驟制備麻風(fēng)樹外植體以及農(nóng)桿菌液，外植體經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后進行共培養(yǎng)；共培養(yǎng)后的外植體接入篩選培養(yǎng)基C13PC進行培養(yǎng)，從而獲得抗性愈傷組織，該篩選培養(yǎng)基C13PC含有1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素；將得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，分化出不定芽；經(jīng)生根培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因植株。利用本發(fā)明轉(zhuǎn)基因方法成功導(dǎo)入功能基因，對野生麻風(fēng)樹進行遺傳改良。轉(zhuǎn)化效率可達10％左右甚至10％以上，轉(zhuǎn)基因性遺傳穩(wěn)定，成本低廉，且麻風(fēng)樹離體再生系統(tǒng)穩(wěn)定性好，操作簡便，再生效率高，從愈傷組織的誘導(dǎo)到再生植株的獲得只需要80-90天。
文檔編號A01H5/00GK101857875SQ20101019371
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月7日
發(fā)明者孫懷娟, 李凝, 李耿光, 王梅珍 申請人:普羅米綠色能源(深圳)有限公司