專利名稱：類球紅細(xì)菌工業(yè)化規(guī)模制備方法及其發(fā)酵液與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌及其利用細(xì)菌發(fā)酵制備功能性發(fā)酵液的生產(chǎn)方法以及發(fā)酵 液的用途，特別是類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)及利用其制備功能性發(fā)酵液的 生產(chǎn)方法，以及這種發(fā)酵液的用途。
背景技術(shù)：
目前，由于類球紅細(xì)菌的研究越來(lái)越受到種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的重視， 其應(yīng)用領(lǐng)域越來(lái)越廣泛。發(fā)明人在原專利技術(shù)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)本技術(shù)還應(yīng)有繼 續(xù)創(chuàng)新的廣泛空間。本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)品更適應(yīng)類球紅細(xì)菌在土壤和黑暗條件下更好地定植 存活；發(fā)揮更好的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)及利用其進(jìn)行 深層的工業(yè)化規(guī)模的發(fā)酵方法，以及這種方法得到的發(fā)酵液，其對(duì)人體的健康有益，能對(duì)人 體的免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，增加人體抵抗力。本發(fā)明涉及發(fā)明人在其系列發(fā)明專利(中國(guó)CN1184307C)和(中國(guó) ZL200510132627. 3)的基礎(chǔ)上，根據(jù)多年的試驗(yàn)和研究，對(duì)菌種進(jìn)行純化、誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)酵工 藝進(jìn)行改造；推出的更適應(yīng)作為環(huán)保型新肥料、新型飼料添加劑和凈化水體效果更好、成本 更低的應(yīng)用產(chǎn)品。在本發(fā)明人的系列專利(中國(guó)CN1184307C)中，涉及了類似的發(fā)酵方法， 但是經(jīng)過發(fā)明人幾年的繼續(xù)試驗(yàn)，優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)液的成分，并且優(yōu)化了發(fā)酵條件，使其代 謝產(chǎn)物SOD大幅提高，得到了效果更好、成本更低的發(fā)酵液。相對(duì)于發(fā)明人之前的兩份專利中的最終產(chǎn)品來(lái)說，得到的發(fā)酵液比光照培養(yǎng)液 在土壤的存活率提高52% —79%，胞外產(chǎn)物SOD比活力提高316% ；胞內(nèi)SOD比活力提高 230%，更有利于作為微生物肥料應(yīng)用于種植業(yè)和作為飼料添加劑應(yīng)用于畜、禽養(yǎng)殖與水產(chǎn) 養(yǎng)殖，其促進(jìn)生長(zhǎng)和抗病防病效果更為顯著。本發(fā)明方法為一種利用類球紅細(xì)菌(RhOdObacter sphaeroides)中國(guó)微生物菌 種保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCCN0. 3757，使用LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基加微量元素避 光誘導(dǎo)培養(yǎng)后，規(guī)?；芄獍l(fā)酵方法，其特征在于該方法是將類球紅細(xì)菌(RhOdObacter sphaeroides)依次經(jīng)過100ml-500ml三角燒瓶避光誘導(dǎo)培養(yǎng)、30L-50L的一級(jí)種子罐、 300L-500L 二級(jí)種子罐避光擴(kuò)大培養(yǎng)、1000L-2000L —級(jí)避光發(fā)酵、3000L-6000L 二級(jí)避光 發(fā)酵、8000L-16000L終端避光發(fā)酵；進(jìn)行兩級(jí)種子避光培養(yǎng)；三級(jí)避光發(fā)酵的方法。本發(fā)明的一種類球紅細(xì)菌，為保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心、編號(hào)CGMCC No. 3757，保藏時(shí)間2010年4月20日。本發(fā)明的一種利用上述類球紅細(xì)菌的工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵方法，其中，將所述的菌 種依次經(jīng)過100ml-500ml三角燒瓶、30L-50L的一級(jí)種子罐、300L-500L的二級(jí)種子罐、 1000L-2000L—級(jí)發(fā)酵罐、3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐和8000L-16000L終端發(fā)酵罐，即得到發(fā)酵液。上述的發(fā)酵條件分別為100ml-500ml三角燒瓶，121°C滅菌，降溫至35°C在凈化箱接種后，用錫箔紙包嚴(yán) 燒瓶，上搖床80-100轉(zhuǎn)/min ；恒溫30_34°C ；進(jìn)行36h避光誘導(dǎo)培養(yǎng)；30L-50L的一級(jí)種子培養(yǎng)罐；接種量大于10%，PH7. 0-7. 2，恒溫30_34°C，底部通 入凈化壓縮空氣，稍開罐頂部排空閥；使罐內(nèi)壓力保持0.02-0. 03Mpa，關(guān)閉視鏡燈，進(jìn)行 避光培養(yǎng)2 Ih ；300L-500L 二級(jí)種子罐，工藝操作如一級(jí)種子罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)21h ；關(guān)閉300L-500L 二級(jí)種子罐頂部放氣閥；通過凈化壓縮空氣之壓力由輸送管道送 入1000L-2000L —級(jí)發(fā)酵罐；接種量大于20% ；工藝操作如二級(jí)種子罐進(jìn)行一級(jí)避光發(fā)酵 10-12h ；3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐，接種量大于25% ；工藝操作如一級(jí)種子罐，進(jìn)行二級(jí)避 光發(fā)酵8h ；8000L-16000L終端發(fā)酵罐，接種量大于30%，其發(fā)酵條件從30L-50L —級(jí)種子罐 到8000L-16000L終端發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)液配方、PH、溫度、通氣壓力、避光操作工藝相同。100ml-500ml三角燒瓶所用培養(yǎng)基配比(每IOOOml培養(yǎng)基，其余為水)
LB培養(yǎng)基20-25克；
微量元素溶液3-5ml ；
去離子水950ml ；
用12N氫氧化鈉溶液調(diào)整PH7. 0-7. 2 ；
用去離子水定容至1000ml。
其中所述的微量元素箱 液配比(1000ml，其余為水)
硼!酸300-500毫克
硫!酸亞鐵200-300毫克
硫!酸錳80-100 _■克
硫!酸鋅200-300毫克
鉬!酸鈉100-300毫克
硫!酸銅80-100 _■克
上述的30L-50L —級(jí)種子罐、300L-500L 二級(jí)種子罐、1000L-2000L —級(jí)發(fā)酵罐、3000L--6000L 二級(jí)發(fā)酵罐、8000L-16000L終端發(fā)酵罐所用發(fā)酵培養(yǎng)液配比(1000L，其余為水)
硫!酸銨1000-1200克硫酸鎂180-220克硫酸亞鐵20-30 克硫酸錳1_2克硫酸鋅20-40克硫畫■銅0. 1-0. 2克硼酸30-50克鉬酸鈉20-30克氯化鈣80-100
克生物素3-4毫克乙二胺四乙酸二鈉10-20克對(duì)氨基苯甲酸1-2克乙酸3. 2-4.0升 維生素Bi、維生素B2、維生素B6、尼克酸各1克氫氧化鈉1400-1600克。
本發(fā)明的類球紅細(xì)菌發(fā)酵液的用途，其中，用20-50倍發(fā)酵液灌溉根部腐爛處可 以治療根腐病；或，用50-100倍的發(fā)酵液噴灑水果果實(shí)和可生食蔬菜，可使植物果實(shí)的 SOD提高；或，用100-150倍的發(fā)酵液作為活菌生物材料；或，給養(yǎng)魚、蝦或蟹的飼料中添加 3%-5%，會(huì)凈化水質(zhì)、減少疾病、提高生長(zhǎng)速度；或，發(fā)酵液與水按照1 5-10倍添加到奶
5牛、豬、雞的飼料或者飲用水中喂養(yǎng)。本發(fā)明產(chǎn)品的SOD酶活力達(dá)到60. 77-119. 8u/ml，比光照發(fā)酵液提高了 230% -316%。本發(fā)明產(chǎn)品用50-100倍避光發(fā)酵液噴施蔬菜可以降解硝酸鹽、亞硝酸鹽，有益于 蔬菜安全生產(chǎn)和人體健康。菌種來(lái)源山東省蓬萊市村里集鎮(zhèn)宋家河上段淤泥中。分離方法于7-8月取河中淤泥500ml，用按照上述方法配制的培養(yǎng)液2000ml，平均裝入10 個(gè)IOOOml三角燒瓶中，用紗布包棉塞塞好瓶中，外用牛皮紙包好，用紙繩扎緊，置于高溫 滅菌鍋內(nèi)加熱至121°C進(jìn)行30分鐘滅菌后，降至28°C _35°C。將淤泥在無(wú)菌室內(nèi)邊攪拌慢 慢地分別平均地分入10瓶培養(yǎng)液。然后用10%乳酸溶液調(diào)節(jié)pH7. 5-8.0，用原瓶上的棉塞 塞好，包好牛皮紙用紙繩扎緊，置于28°C _35°C恒溫?fù)u床上，搖床轉(zhuǎn)速每分鐘120-150轉(zhuǎn)搖 動(dòng)，搖床培養(yǎng)40小時(shí)后，取有紅色反應(yīng)的培養(yǎng)液(取上層液)，在接種室內(nèi)用移液管移入培 養(yǎng)皿(培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基)，置于上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)96h，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)皿中在 無(wú)菌室內(nèi)取紅點(diǎn)較大的菌落接入LB液體培養(yǎng)液中，進(jìn)入扶壯培養(yǎng)，這樣反復(fù)進(jìn)行數(shù)十次分 離培養(yǎng)、扶壯，取樣鏡檢，達(dá)到無(wú)雜菌的純種可為生產(chǎn)用種。本發(fā)明類球紅細(xì)菌為保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心、 編號(hào)CGMCC No. 3757，保藏時(shí)間2010年4月20日。有益效果相對(duì)于發(fā)明人之前的兩份專利中的最終產(chǎn)品來(lái)說，得到的發(fā)酵液比光照培養(yǎng)液 在土壤的存活率提高52% —79%，胞外產(chǎn)物SOD比活力提高316% ；胞內(nèi)SOD比活力提高 230%，更有利于作為微生物肥料應(yīng)用于種植業(yè)和作為飼料添加劑應(yīng)用于畜、禽養(yǎng)殖與水產(chǎn) 養(yǎng)殖，其促進(jìn)生長(zhǎng)和抗病防病效果更為顯著。實(shí)施例1中國(guó)微生物菌種保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCCN0. 3757，將所述的菌種依次經(jīng)過 100ml-500ml 三角燒瓶、30L-50L 的一級(jí)種子罐、300L-500L 的二級(jí)種子罐、1000L-2000L — 級(jí)發(fā)酵罐、3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐和8000L-16000L終端發(fā)酵罐，即得到發(fā)酵液。上述的發(fā)酵條件分別為100ml-500ml三角燒瓶，121°C滅菌，降溫至35°C在凈化箱接種后，用錫箔紙包嚴(yán) 燒瓶，上搖床100轉(zhuǎn)/min ；恒溫30°C ；進(jìn)行36h避光誘導(dǎo)培養(yǎng)；30L-50L的一級(jí)種子培養(yǎng)罐；接種量大于10%，PH7. 2，恒溫34°C，底部通入凈化壓 縮空氣，稍開罐頂部排空閥；使罐內(nèi)壓力保持0. 03Mpa，關(guān)閉視鏡燈，進(jìn)行避光培養(yǎng)21h ；300L-500L 二級(jí)種子罐，工藝操作如一級(jí)種子罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)21h ；關(guān)閉300L-500L 二級(jí)種子罐頂部放氣閥；通過凈化壓縮空氣之壓力由輸送管道送 入1000L-2000L —級(jí)發(fā)酵罐；接種量大于20% ；工藝操作如二級(jí)種子罐進(jìn)行一級(jí)避光發(fā)酵 12h ；3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐，接種量大于25% ；工藝操作如一級(jí)種子罐，進(jìn)行二級(jí)避 光發(fā)酵8h ；
8000L-16000L終端發(fā)酵罐，接種量大于30 %，其發(fā)酵條件從30L-50L —級(jí)種子罐 到8000L-16000L終端發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)液配方、PH、溫度、通氣壓力、避光操作工藝相同。100ml-500ml三角燒瓶所用培養(yǎng)基配比(每IOOOml培養(yǎng)基)LB培養(yǎng)基25克；微量元素溶液5ml ；去離子水950ml ；用12N氫氧化鈉溶液調(diào)整PH7. 2 ；用去離子水定容至1000ml。其中所述的微量元素溶液配比(1000ml)硼酸500毫克硫酸亞鐵 300毫克硫酸錳100毫克硫酸鋅300毫克鉬酸鈉300毫克硫酸銅100毫克上述的30L-50L —級(jí)種子罐、300L-500L 二級(jí)種子罐、1000L-2000L —級(jí)發(fā)酵罐、 3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐、8000L-16000L終端發(fā)酵罐所用發(fā)酵培養(yǎng)液配比(1000L)硫酸銨1200克硫酸鎂220克硫酸亞鐵30 克硫酸錳2克硫酸鋅40克硫 酸銅0.2克硼酸50克鉬酸鈉30克氯化鈣100克生物素4毫克乙二胺四乙酸二 鈉20克對(duì)氨基苯甲酸2克乙酸4.0升維生素Bi、維生素B2、維生素B6、尼克酸各1克 氫氧化鈉1600克。實(shí)施例2中國(guó)微生物菌種保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCCN0. 3757，將所述的菌種依次經(jīng)過 100ml-500ml 三角燒瓶、30L-50L 的一級(jí)種子罐、300L-500L 的二級(jí)種子罐、1000L-2000L — 級(jí)發(fā)酵罐、3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐和8000L-16000L終端發(fā)酵罐，即得到發(fā)酵液。上述的發(fā)酵條件分別為100ml-500ml三角燒瓶，121°C滅菌，降溫至35°C在凈化箱接種后，用錫箔紙包嚴(yán) 燒瓶，上搖床80轉(zhuǎn)/min ；恒溫34°C ；進(jìn)行36h避光誘導(dǎo)培養(yǎng)；30L-50L的一級(jí)種子培養(yǎng)罐；接種量大于10%，PH7. 0，恒溫30°C，底部通入凈化壓 縮空氣，稍開罐頂部排空閥；使罐內(nèi)壓力保持0. 02Mpa，關(guān)閉視鏡燈，進(jìn)行避光培養(yǎng)21h ；300L-500L 二級(jí)種子罐，工藝操作如一級(jí)種子罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)21h ；關(guān)閉300L-500L 二級(jí)種子罐頂部放氣閥；通過凈化壓縮空氣之壓力由輸送管道 送入1000L-2000L—級(jí)發(fā)酵罐；接種量大于20% ；工藝操作如二級(jí)種子罐進(jìn)行一級(jí)避光發(fā) 酵 IOh ；3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐，接種量大于25% ；工藝操作如一級(jí)種子罐，進(jìn)行二級(jí)避 光發(fā)酵8h ；8000L-16000L終端發(fā)酵罐，接種量大于30 %，其發(fā)酵條件從30L-50L —級(jí)種子罐 到8000L-16000L終端發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)液配方、PH、溫度、通氣壓力、避光操作工藝相同。100ml-500ml三角燒瓶所用培養(yǎng)基配比(每IOOOml培養(yǎng)基)
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微量元素溶液3ml ；去離子水950ml ；用12N氫氧化鈉溶液調(diào)整PH7. 0 ；用去離子水定容至1000ml。其中所述的微量元素溶液配比(1000ml)硼酸300毫克硫酸亞鐵 200毫克硫酸錳80毫克硫酸鋅200毫克鉬酸鈉100毫克硫酸銅 80毫克上述的30L-50L —級(jí)種子罐、300L-500L 二級(jí)種子罐、1000L-2000L —級(jí)發(fā)酵罐、 3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐、8000L-16000L終端發(fā)酵罐所用發(fā)酵培養(yǎng)液配比(1000L)硫酸銨1000克硫酸鎂180克硫酸亞鐵20克硫酸錳1克硫酸鋅20克硫 酸銅0.1克硼酸30克鉬酸鈉20克氯化鈣80克生物素3毫克乙二胺四乙酸二 鈉10克對(duì)氨基苯甲酸1克乙酸3. 2升維生素Bi、維生素B2、維生素B6、尼克酸各1 克氫氧化鈉1400克。實(shí)施例3中國(guó)微生物菌種保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCCN0. 3757，將所述的菌種依次經(jīng)過 100ml-500ml 三角燒瓶、30L-50L 的一級(jí)種子罐、300L-500L 的二級(jí)種子罐、1000L-2000L — 級(jí)發(fā)酵罐、3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐和8000L-16000L終端發(fā)酵罐，即得到發(fā)酵液。上述的發(fā)酵條件分別為100ml-500ml三角燒瓶，121°C滅菌，降溫至35°C在凈化箱接種后，用錫箔紙包嚴(yán) 燒瓶，上搖床90轉(zhuǎn)/min ；恒溫32°C ；進(jìn)行36h避光誘導(dǎo)培養(yǎng)；30L-50L的一級(jí)種子培養(yǎng)罐；接種量大于10%，PH7. 1，恒溫32°C，底部通入凈化壓 縮空氣，稍開罐頂部排空閥；使罐內(nèi)壓力保持0. 025Mpa，關(guān)閉視鏡燈，進(jìn)行避光培養(yǎng)21h ；300L-500L 二級(jí)種子罐，工藝操作如一級(jí)種子罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)21h ；關(guān)閉300L-500L 二級(jí)種子罐頂部放氣閥；通過凈化壓縮空氣之壓力由輸送管道送 入1000L-2000L —級(jí)發(fā)酵罐；接種量大于20% ；工藝操作如二級(jí)種子罐進(jìn)行一級(jí)避光發(fā)酵 Ilh ；3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐，接種量大于25% ；工藝操作如一級(jí)種子罐，進(jìn)行二級(jí)避 光發(fā)酵8h ；8000L-16000L終端發(fā)酵罐，接種量大于30 %，其發(fā)酵條件從30L-50L —級(jí)種子罐 到8000L-16000L終端發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)液配方、PH、溫度、通氣壓力、避光操作工藝相同。100ml-500ml三角燒瓶所用培養(yǎng)基配比(每IOOOml培養(yǎng)基)LB培養(yǎng)基22克；微量元素溶液4ml;去離子水950ml;
8
用12N氫氧化鈉溶液調(diào)整PH7. 1 ；用去離子水定容至1000ml。其中所述的微量元素溶液配比(1000ml)硼酸400毫克硫酸亞鐵 250毫克硫酸錳90毫克硫酸鋅 250毫克鉬酸鈉200毫克硫酸銅 90毫克上述的30L-50L—級(jí)種子罐、300L-500L 二級(jí)種子罐、1000L-2000L—級(jí)發(fā)酵罐、 3000L-6000L級(jí)發(fā)酵罐、8000L-16000L終端發(fā)酵罐所用發(fā)酵培養(yǎng)液配比(1000L)硫酸銨1100克硫酸鎂200克硫酸亞鐵25克硫酸錳1. 5克硫酸鋅30克 硫酸銅0.15克硼酸40克鉬酸鈉25克氯化鈣90克生物素3. 5毫克乙二胺四乙 酸二鈉15克對(duì)氨基苯甲酸1.5克乙酸3. 6升維生素Bi、維生素B2、維生素B6、尼克 酸各1克氫氧化鈉1500克。實(shí)施例4中國(guó)微生物菌種保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCCN0. 3757，將所述的菌種依次經(jīng)過 100ml-500ml 三角燒瓶、30L-50L 的一級(jí)種子罐、300L-500L 的二級(jí)種子罐、1000L-2000L — 級(jí)發(fā)酵罐、3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐和8000L-16000L終端發(fā)酵罐，即得到發(fā)酵液。上述的發(fā)酵條件分別為100ml-500ml三角燒瓶，121°C滅菌，降溫至35°C在凈化箱接種后，用錫箔紙包嚴(yán) 燒瓶，上搖床80轉(zhuǎn)/min ；恒溫30°C ；進(jìn)行36h避光誘導(dǎo)培養(yǎng)；30L-50L的一級(jí)種子培養(yǎng)罐；接種量大于10%，PH7. 2，恒溫34°C，底部通入凈化壓 縮空氣，稍開罐頂部排空閥；使罐內(nèi)壓力保持0. 03Mpa，關(guān)閉視鏡燈，進(jìn)行避光培養(yǎng)21h ；300L-500L 二級(jí)種子罐，工藝操作如一級(jí)種子罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)21h ；關(guān)閉300L-500L 二級(jí)種子罐頂部放氣閥；通過凈化壓縮空氣之壓力由輸送管道送 入1000L-2000L —級(jí)發(fā)酵罐；接種量大于20% ；工藝操作如二級(jí)種子罐進(jìn)行一級(jí)避光發(fā)酵 IOh ；3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐，接種量大于25% ；工藝操作如一級(jí)種子罐，進(jìn)行二級(jí)避 光發(fā)酵8h ；8000L-16000L終端發(fā)酵罐，接種量大于30%，其發(fā)酵條件從30L-50L —級(jí)種子罐 到8000L-16000L終端發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)液配方、PH、溫度、通氣壓力、避光操作工藝相同。100ml-500ml三角燒瓶所用培養(yǎng)基配比(每IOOOml培養(yǎng)基)LB培養(yǎng)基24克；微量元素溶液4ml;去離子水950ml;用12N氫氧化鈉溶液調(diào)整PH7. 0 ；用去離子水定容至1000ml。其中所述的微量元素溶液配比(1000ml)
硼酸500毫克硫酸亞鐵 200毫克硫酸錳100毫克硫酸鋅200毫克鉬酸鈉300毫克硫酸銅80毫克上述的30L-50L —級(jí)種子罐、300L-500L 二級(jí)種子罐、1000L-2000L —級(jí)發(fā)酵罐、 3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐、8000L-16000L終端發(fā)酵罐所用發(fā)酵培養(yǎng)液配比(1000L)硫酸銨1200克硫酸鎂180克硫酸亞鐵30克硫酸錳1克硫酸鋅40克硫 酸銅0.1克硼酸50克鉬酸鈉20克氯化鈣100克生物素3毫克乙二胺四乙酸二 鈉20克對(duì)氨基苯甲酸1克乙酸4.0升維生素Bi、維生素B2、維生素B6、尼克酸各1克 氫氧化鈉1600克。實(shí)施例5中國(guó)微生物菌種保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCCN0. 3757，將所述的菌種依次經(jīng)過 100ml-500ml 三角燒瓶、30L-50L 的一級(jí)種子罐、300L-500L 的二級(jí)種子罐、1000L-2000L — 級(jí)發(fā)酵罐、3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐和8000L-16000L終端發(fā)酵罐，即得到發(fā)酵液。上述的發(fā)酵條件分別為100ml-500ml三角燒瓶，121°C滅菌，降溫至35°C在凈化箱接種后，用錫箔紙包嚴(yán) 燒瓶，上搖床900轉(zhuǎn)/min ；恒溫30°C ；進(jìn)行36h避光誘導(dǎo)培養(yǎng)；30L-50L的一級(jí)種子培養(yǎng)罐；接種量大于10%，PH7. 0，恒溫31°C，底部通入凈化壓 縮空氣，稍開罐頂部排空閥；使罐內(nèi)壓力保持0. 028Mpa，關(guān)閉視鏡燈，進(jìn)行避光培養(yǎng)21h ；300L-500L 二級(jí)種子罐，工藝操作如一級(jí)種子罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)21h ；關(guān)閉300L-500L 二級(jí)種子罐頂部放氣閥；通過凈化壓縮空氣之壓力由輸送管道送 入1000L-2000L —級(jí)發(fā)酵罐；接種量大于20% ；工藝操作如二級(jí)種子罐進(jìn)行一級(jí)避光發(fā)酵 IOh ；3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐，接種量大于25% ；工藝操作如一級(jí)種子罐，進(jìn)行二級(jí)避 光發(fā)酵8h ；8000L-16000L終端發(fā)酵罐，接種量大于30%，其發(fā)酵條件從30L-50L —級(jí)種子罐 到8000L-16000L終端發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)液配方、PH、溫度、通氣壓力、避光操作工藝相同。100ml-500ml三角燒瓶所用培養(yǎng)基配比(每IOOOml培養(yǎng)基)LB培養(yǎng)基20克；微量元素溶液5ml;去離子水950ml;用12N氫氧化鈉溶液調(diào)整PH7. 2 ；用去離子水定容至1000ml。其中所述的微量元素溶液配比(1000ml)硼酸500毫克硫酸亞鐵 250毫克硫酸錳80毫克
硫酸鋅250毫克鉬酸鈉190毫克硫酸銅85毫克上述的30L-50L —級(jí)種子罐、300L-500L 二級(jí)種子罐、1000L-2000L —級(jí)發(fā)酵罐、 3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐、8000L-16000L終端發(fā)酵罐所用發(fā)酵培養(yǎng)液配比(1000L)硫酸銨1050克硫酸鎂1850克硫酸亞鐵28克硫酸錳1. 8克硫酸鋅22克 硫酸銅0.1克硼酸35克鉬酸鈉22克氯化鈣85克生物素3毫克乙二胺四乙酸 二鈉18克對(duì)氨基苯甲酸1.8克乙酸3. 8升維生素Bi、維生素B2、維生素B6、尼克酸各 1克氫氧化鈉1450克。具體應(yīng)用和檢測(cè)結(jié)果如下檢測(cè)單位中科院生態(tài)環(huán)境研究中心檢測(cè)完成人白志輝類球紅細(xì)菌光照發(fā)酵液與避光發(fā)酵液對(duì)作物生長(zhǎng)的影響及對(duì)硝酸鹽亞硝酸鹽降 解測(cè)定 檢測(cè)單位中科院生態(tài)環(huán)境研究中心檢測(cè)完成人趙凱類球紅細(xì)菌光照發(fā)酵與避光發(fā)酵SOD測(cè)定值完成時(shí)間2008年11月9日 類球紅細(xì)菌促進(jìn)散葉生菜生長(zhǎng)狀況檢測(cè)單位中科院生態(tài)環(huán)境研究中心檢測(cè)完成人白志輝韓慶莉
備注測(cè)定時(shí)間2009. 6. 22-8. 10
施氮肥出苗后第十天追施(畝用量30kg)
施菌液第一次是在播種時(shí)施用，第二次是在施用氮肥第三天施用(每次用量5L) 發(fā)酵液+尿素播種時(shí)施用發(fā)酵液；出苗后15天追施尿素。
株重只施發(fā)酵液時(shí)，避光比光照提髙14%;同時(shí)施加發(fā)酵液和尿素時(shí)，避光比光照提高8. 4% 株高只施發(fā)酵液時(shí)，避光比光照提高10%;同時(shí)施加發(fā)酵液和尿素時(shí)，避光比光照提高9. 5%本發(fā)明類球紅細(xì)菌光照發(fā)酵液與避光發(fā)酵液在植物根際區(qū)土壤中存活試驗(yàn)及菌 群的影響 在土壤溫度平均22攝氏度(白天)條件下，實(shí)驗(yàn)30天表明類球紅細(xì)菌在土壤的 存活率避光發(fā)酵的比光照發(fā)酵的玉米提高52%，大豆提高79%，對(duì)固氮菌、放線菌、根瘤菌 等有利于植物生長(zhǎng)的益生菌都有不同程度的提高，而對(duì)引起作物病害的絲狀真菌顯示了不 同程度的抑制作用，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。以上實(shí)驗(yàn)檢測(cè)單位中科院生態(tài)環(huán)境研究中心完成人趙志瑞李磊完成時(shí)間2009.5. 9-9. 22實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)北京海淀區(qū)東北旺土井村東
權(quán)利要求
一種類球紅細(xì)菌，其特征在于所述的類球紅細(xì)菌為保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心、編號(hào)CGMCC No.3757，保藏時(shí)間2010年4月20日。
2.一種利用如權(quán)利要求1所述類球紅細(xì)菌的工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵方法，其特征在于 將所述的優(yōu)選的方法為菌種依次經(jīng)過100ml-500ml三角燒瓶、30L-50L的一級(jí)種子 罐、300L-500L的二級(jí)種子罐、1000L-2000L —級(jí)發(fā)酵罐、3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐和 8000L-16000L終端發(fā)酵罐，即得到發(fā)酵液。
3.如權(quán)利要求2所述的方法其特征在于 發(fā)酵條件分別為100ml-500ml三角燒瓶，121°C滅菌，降溫至35°C在凈化箱接種后，用錫箔紙包嚴(yán)燒瓶， 上搖床80-100轉(zhuǎn)/min ；恒溫30-34°C ；進(jìn)行36h避光誘導(dǎo)培養(yǎng)；30L-50L的一級(jí)種子培養(yǎng) 罐；接種量大于10%，PH7. 0-7. 2，恒溫30-34°C，底部通入凈化壓縮空氣，稍開罐頂部排空 閥；使罐內(nèi)壓力保持0. 02-0. 03Mpa，關(guān)閉視鏡燈，進(jìn)行避光培養(yǎng)21h。300L-500L 二級(jí)種子罐，工藝操作如一級(jí)種子罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)21h。 關(guān)閉300L-500L 二級(jí)種子罐頂部放氣閥；通過凈化壓縮空氣之壓力由輸送管 道送入1000L-2000L —級(jí)發(fā)酵罐；接種量大于20% ；工藝操作如二級(jí)種子罐進(jìn)行一級(jí) 避光發(fā)酵10-12h。3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐，接種量大于25% ；工藝操作如一級(jí)種子罐，進(jìn)行二級(jí)避光發(fā) 酵8h。8000L-16000L終端發(fā)酵罐，接種量大于30 %，其發(fā)酵條件從30L-50L —級(jí)種子罐到 8000L-16000L終端發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)液配方、PH、溫度、通氣壓力、避光操作工藝相同。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法其特征在于100ml-500ml三角燒瓶所用培養(yǎng)基配比(每1000ml培養(yǎng)基，其余為水) LB培養(yǎng)基20-25克； 微量元素溶液3-5ml ； 去離子水950ml ；用12N氫氧化鈉溶液調(diào)整PH7. 0-7. 2 ； 用去離子水定容至1000ml。
5.如權(quán)利要求4所述的方法其特征在于所述的微量元素溶液配比(1000ml，其余 為水)硼酸500-800毫克硫酸亞鐵 200-300毫克 硫酸錳 80-100毫克 硫酸鋅 200-300毫克 鉬酸鈉 100-300毫克 硫酸銅 80-100毫克
6.如權(quán)利要求2或3所述的方法其特征在于30L-50L 一級(jí)種子罐、300L-500L 二級(jí)種子罐、1000L-2000L —級(jí)發(fā)酵罐、3000L-6000L 二級(jí)發(fā)酵罐、8000L-16000L終端發(fā)酵罐所用發(fā)酵培養(yǎng)液配比(1000L，其余為水)硫酸銨1000-1200克硫酸鎂180-220克硫酸亞鐵20-30克硫酸錳1_2克硫酸鋅20-40克硫酸銅0. 1-0. 2克硼酸30-50克鉬酸鈉20-30克氯化鈣80-100克生 物素3-4毫克乙二胺四乙酸二鈉10-20克對(duì)氨基苯甲酸1-2克乙酸3. 2-4.0升維 生素Bi、維生素B2、維生素B6、尼克酸各1克氫氧化鈉1400-1600克。
7.一種類球紅細(xì)菌發(fā)酵液，其特征在于利用權(quán)利要求2-6中任意一項(xiàng)所述的利用類 球紅細(xì)菌工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵的方法來(lái)生產(chǎn)。
8.如權(quán)利要求7中所述發(fā)酵液的用途，其特征在于用20-50倍發(fā)酵液澆灌植物根部 腐爛處可以治療根腐病。
9.如權(quán)利要求7中所述發(fā)酵液的用途，其特征在于用50-100倍的發(fā)酵液噴灑水果果 實(shí)和可生食蔬菜，可使植物果實(shí)的SOD提高。
10.如權(quán)利要求7中所述發(fā)酵液的用途，其特征在于用發(fā)酵液作為活菌生物飼料；給 養(yǎng)魚、蝦或蟹的飼料中添加3% _5%，會(huì)凈化水質(zhì)、減少疾病、提高生長(zhǎng)速度；或，發(fā)酵液與 水按照1 5-10倍添加到奶牛、豬、雞的飼料或者飲用水中喂養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌及其利用細(xì)菌發(fā)酵制備土壤沖施微生物肥料和飼料添加劑的生產(chǎn)方法以及發(fā)酵液的用途，特別是類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)及利用其制備土壤沖施微生物肥料和飼料添加劑的生產(chǎn)方法，以及這種發(fā)酵液的用途。一種利用類球紅細(xì)菌中國(guó)微生物菌種保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCC NO.3757。相對(duì)于發(fā)明人之前的兩份專利中的最終產(chǎn)品來(lái)說，得到的發(fā)酵液比光照培養(yǎng)發(fā)酵液在土壤的存活率提高52％—79％，胞外產(chǎn)物SOD比活力提高316％；胞內(nèi)SOD比活力提高230％，作為微生物肥料應(yīng)用于種植業(yè)更有效的改善作物品質(zhì)、提高產(chǎn)量。降解蔬菜中硝酸鹽、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)；對(duì)農(nóng)業(yè)食品安全生產(chǎn)和保障人類健康具有重要意義。作為飼料添加劑應(yīng)用于畜、禽養(yǎng)殖與水產(chǎn)養(yǎng)殖，其促進(jìn)生長(zhǎng)和抗病防病效果更為顯著。
文檔編號(hào)A01P3/00GK101928689SQ201010224519
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者宗紅興, 尤志東, 李磊, 王棟, 白志輝, 韓慶莉, 韓禎 申請(qǐng)人:王棟