專利名稱：一種外生菌根輔助細菌蠟狀芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物肥料領(lǐng)域，尤其涉及一種外生菌根輔助細菌蠟狀芽孢桿菌及其 在促進黑松生長和防治松苗猝倒病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物根際促生細菌(Plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)是對根 際微生物區(qū)系中能夠促進植物生長、防治病害、增加作物產(chǎn)量的細菌的統(tǒng)稱。自從1978 年Burr等人首先在馬鈴薯上報導(dǎo)PGPR以來，國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)20多個種屬PGPR。其中，假
Ifi^M (Pseudomonas) ,Wl^PfMM (Bacillus)、H干胃M (Agrobacterium) > K 菌屬(Eriwinia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、巴其Jf 德氏菌屬(Pasteuria) > W IS lif (Serratia)、腸桿菌(Enterobacter)等的作用最為突出。植物根際促生細菌和外生菌根真 菌(Ectomycorrhizal Fungi, EMF)作為植物根圈微生物的重要組成類群，對植物的營養(yǎng)吸 收、生長發(fā)育及土壤結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要的作用。國內(nèi)外已有大量的研究表明，菌根真菌與PGPR 混合接種對宿主植物的生長和營養(yǎng)吸收具有積極意義(Linderman，1996 Jezabel et al, 2004 ；王新榮等，1998)。菌根輔助細菌(MycorrhizalHelper Bacteria,MHB)作為一類的特殊的 PGPR，與 菌根真菌的作用關(guān)系十分密切，是菌根學(xué)研究的熱點之一。MHB的概念是1994年由法國學(xué) 者Garbaye提出的，具體是指可與菌根聯(lián)結(jié)并對菌根的形成具有選擇性促進作用的細菌。 大量研究表明，MHB與菌根真菌雙接種可顯著促進菌根真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長、提高菌根 侵染率等，從而促進植物生長(Garbaye et al,1992 ；Duponnois et al，2003)。國外關(guān)于 MHB與菌根真菌互作關(guān)系的研究已有幾十年的歷史，篩選出了大量的MHB，并對某些優(yōu)良的 MHB開展了比較深入的研究，但到目前為止，在我國還未見有關(guān)MHB的篩選研究以及MHB與 菌根真菌互作的相關(guān)報道。黑松(Pinus thimbergii)是我國南方人工林中最主要的造林樹種之一，廣泛應(yīng)用 于荒山造林、沿海防護林帶的建設(shè)，且具有極強的觀賞價值。黑松是典型的外生菌根樹種， 主要生長在沿海土壤瘠薄的立地上，其生長對外生菌根真菌(EMF)的依賴性很強，菌根技 術(shù)的應(yīng)用可以提高其在土壤貧瘠地區(qū)的生產(chǎn)力；而菌根輔助細菌(MHB)能通過促進菌根菌 生長，從而達到更好的促進林木生長的目的。因此，研究MHB及其與菌根真菌互作對黑松的 促生效果具有重要的理論和實踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種促進黑松生長和外生菌根真菌生長的蠟 狀芽孢桿菌。本發(fā)明還要解決的一個技術(shù)問題是提供上述外生菌根輔助細菌蠟狀芽孢桿菌的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
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外生菌根輔助細菌蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)HB12，是一種從美味牛肝菌 (Boletus eduliS，Be)-黑松(Pinus thunbergii)菌根根際土壤中篩選獲得的對黑松和美 味牛肝菌(Be)生長具有促進作用的MHB菌株，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保 藏號為CCTCC NO =M 209025，保藏日期2009年2月18日。CCTCC NO =M 209025菌株的菌學(xué)特性如下在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上菌落圓形、較大，乳白色、邊緣鋸齒型、表面光滑、平 鋪和粘稠，菌體鏈桿狀；革蘭氏染色為陽性、3% KOH試驗陰性；芽孢中生比菌體小。通過 BIOLOG系統(tǒng)對HB12進行鑒定，該菌株在鑒定板培養(yǎng)16 24h時的讀數(shù)相似值(SIM值) 為0. 629，大于0. 50，符合BIOLOG系統(tǒng)關(guān)于理想結(jié)果的要求，與數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果的相似 性(PROB)都為99%。利用該系統(tǒng)鑒定到了種，為蠟狀芽孢桿菌/蘇云金桿菌(Bacillus cereus/thuringiensis)。通過伴孢晶體染色試驗，HB12菌株無伴孢晶體，因此，HB12菌株 屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)。測得16SrDNA大部分序列1409bp，具體如SEQ ID No 1所示。16SrDNA序列通過 BLAST比對，在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。與HB12菌株相似性最高的 是蠟狀芽孢桿菌，同源性達到100%。從進化樹可以看出，HB12與蠟狀芽孢桿菌的親緣關(guān)系 較近，這與BIOLOG鑒定及BLAST的比對結(jié)果相符。CCTCC NO =M 209025菌株對黑松具有促生長的作用。CCTCC NO :M 209025菌株對松樹苗木猝倒病病原絲核菌(Rhizoctonia sp.)具有 抑菌作用；溫室防治試驗表明，該菌株能有效防治松苗猝倒病。并且上述CCTCC NO =M 209025菌株對美味牛肝菌(Be)具有促生作用，且其與美味 牛肝菌(Be)互作對黑松的促生長作用顯著高于各接種處理，表現(xiàn)出正交互作用。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢(1)外生菌根輔助細菌蠟狀芽孢桿菌HB12為植物根際促生細菌，對黑樹的生長具 有促進作用，能夠促進外生菌根真菌美味牛肝菌(Be)的生長，其與美味牛肝菌雙接種對黑 松的促生效果優(yōu)于兩者單接種處理。(2)外生菌根輔助細菌蠟狀芽孢桿菌HB12對松樹苗木猝倒病病原絲核菌具抑制 作用；溫室防治試驗表明，蠟狀芽孢桿菌HB12菌株能有效防治松樹苗木猝倒病。


蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)HB12，已保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏 中心(簡稱CCTCC)；地址武漢武漢大學(xué)；郵編430072 ；保藏號M 209025 ；保藏日期 2009年2月18日。圖1蠟狀芽孢桿菌HB12菌體對美味牛肝菌(Be)菌絲生長的影響(X 17)；圖2蠟狀芽孢桿菌HB12菌株胞外代謝產(chǎn)物對美味牛肝菌(Be)菌絲生長的影響；圖3蠟狀芽孢桿菌HB12與美味牛肝菌(Be)雙接種對黑松的促生長作用；圖4蠟狀芽孢桿菌HB12與苗木猝倒病病原絲核菌對峙培養(yǎng)結(jié)果。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實
4施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 蠟狀芽孢桿菌HB12對美味牛肝菌(Be)的促生作用將待測細菌活化后，用接種環(huán)取少量接種于裝有50mL TSA液體培養(yǎng)基的IOOmL三 角瓶中，280C，160r/min振蕩培養(yǎng)72h。將菌懸液倒入滅菌的離心管中，4°C，5000r/min離心 5min，倒去上清液，再用生理鹽水潤洗菌體兩次，最后根據(jù)離心管內(nèi)菌體的數(shù)量適量加入生 理鹽水，混勻后即為HB12菌株的菌體懸濁液(約含5X108cfu/mL)。同時，用無菌注射器吸 取上清液，細菌過濾器(濾膜孔徑為0.22 μ m，直徑為0. 25mm)過濾后即為HB12菌株的無菌 濾液。(1)蠟狀芽孢桿菌HB12菌體懸液對美味牛肝菌(Be)的促生測定采用干皿對抗法進行試驗。將Be菌根真菌培養(yǎng)于ZPD培養(yǎng)基，在其生長最旺盛期 間，用直徑為7mm的打孔器在培養(yǎng)皿邊緣打孔，取厚度(約5mm)基本一致的菌塊作為材料。 將菌根真菌菌塊倒置放入滅菌的空培養(yǎng)皿中，每皿接種三塊，三角狀放置，再用無菌移液器 吸取25 μ L ΗΒ12菌株菌體懸濁液，滴加于各個真菌菌塊上，每個細菌菌株設(shè)六個重復(fù)，以滴 加生理鹽水的作為對照，置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔6天添加25 μ IlOmM的葡萄糖溶液， 以防止菌塊干燥。待菌塊生長12 16d后，借助于裝有測微尺的體式顯微鏡觀測各個菌塊 的菌絲生長情況(表1 ；圖1)，計算HB12菌株對菌根菌絲的平均促生長量。試驗結(jié)果表明， HB12菌株對Be菌絲的生長具有促進作用，與對照相比增長了 40. 19%。表1蠟狀芽孢桿菌HB12菌株對美味牛肝菌(Be)菌絲生長的影響 注不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同。(2)蠟狀芽孢桿菌HB12胞外代謝產(chǎn)物對美味牛肝菌(Be)菌落生長的影響將ImL無菌濾液與45°C，20mL ZPD固體培養(yǎng)基混合倒平板，以無菌水處理作為對 照。將菌根真菌菌塊接種于培養(yǎng)皿中央，每處理三個重復(fù)，置于25°C恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)12 15d后觀測其菌落半徑(表2;圖2)。試驗結(jié)果表明，HB12菌株的胞外代謝產(chǎn)物對Be菌落 的生長具有促進作用。在100 μ L、500 μ LUOOOy L三個濾液體積的梯度中，以500 μ L的用 量效果最佳，ΗΒ12在500 μ L用量時，Be菌落直徑比對照增長了 17. 41%。表2蠟狀芽孢桿菌ΗΒ12菌株胞外代謝產(chǎn)物對美味牛肝菌(Be)菌落生長的影響 (3)蠟狀芽孢桿菌HB12菌株胞外代謝產(chǎn)物對美味牛肝菌(Be)生物量的影響。通過將HB12菌株胞外代謝產(chǎn)物與美味牛肝菌(Be)共培養(yǎng)，稱量菌絲干重的方法 來研究胞外代謝產(chǎn)物對菌根菌絲生長量的影響。具體方法如下將菌根真菌培養(yǎng)一段時間 后，用滅菌的打孔器打下菌餅(d = 7mm, <2 = 5mm)，每50mLZPD液體培養(yǎng)基中加入菌餅3 塊，同時加入lmLHB12菌株胞外代謝產(chǎn)物，25°C，160r/min共同振蕩培養(yǎng)12 15d，定性濾 紙過濾，再置于60°C烘箱中烘至恒重，然后用電子天平進行稱量。以TSA培養(yǎng)液為對照，每 處理各3次重復(fù)。試驗結(jié)果表明，HB12菌株的代謝產(chǎn)物能促進Be菌絲的生長量，與對照相 比，菌絲生物量增長了 28.8%。表3蠟狀芽孢桿菌HB12菌株胞外代謝產(chǎn)物對Be菌絲生物量的影響 實施例2 蠟狀芽孢桿菌HB12與美味牛肝菌(Be)互作對黑松的促生作用。芽苗的培育黑松種子經(jīng)60°C溫水浸泡24h用以催芽，以0. 5%高錳酸鉀溶液浸 泡，2h進行表面消毒，再用自來水沖洗Ih后，播種于滅菌沙子中，置于25°C溫室中培養(yǎng)，待 其長到子葉期時進行芽苗截根移苗。盆栽基質(zhì)基質(zhì)土壤采自南京林業(yè)大學(xué)校園后山，土樣過篩后經(jīng)1.01X IO6Pa滅 菌，90min，冷卻后備用。蠟狀芽孢桿菌HB12菌體懸濁液的制備將供試細菌活化后，用接種環(huán)取少量接種 于裝有50mL TSA液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，28°C，160r/min振蕩培養(yǎng)72h。將菌懸液 倒入滅菌的離心管中，4°C，5000r/min離心5min，倒去上清液，潤洗菌體兩次，最后獲得菌 體懸濁液，并將各菌株接種液濃度調(diào)至5 X 108CfU/ml左右。美味牛肝菌(Be)固體菌劑的制備利用ZPD培養(yǎng)基平板培養(yǎng)Be菌根菌，將其作為 母菌種備用。固體擴大培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石、玉米粉和麩皮，三者以8 1 1的比例充分混合， 攪拌均勻，然后加入ZPD營養(yǎng)液(以手緊握有水滲出但不下滴為準)再次拌勻，取約400g 基質(zhì)裝入培養(yǎng)袋中，將其壓實，并用包裝繩扎好袋口。培養(yǎng)基質(zhì)經(jīng)1. 01 X IO6Pa滅菌90min， 冷卻后，在無菌條件下將Be接種于固體培養(yǎng)基質(zhì)，置于25°C恒溫培養(yǎng)，待菌絲長滿培養(yǎng)基 質(zhì)后即制備成外生菌根真菌的固體菌劑。美味牛肝菌(Be)與蠟狀芽孢桿菌HB12雙接種的盆栽試驗采用芽苗截根法移栽
6黑松幼苗，基質(zhì)土與固體菌劑比例為10 1，細菌接種液的量為5mL/株，濃度約為IO7Cfu/ go具體方法如下首先，取適量無菌的盆栽基質(zhì)裝入培養(yǎng)杯中，然后在土層表面覆約20g的 外生菌根菌劑；其次，將子葉期的黑松幼苗輕輕地從育苗盆中取出，并用清水將幼苗根部的 沙子沖洗干凈，用解剖刀將芽苗截去少量主根后移栽至培養(yǎng)杯中，使根系盡量包埋于菌劑 中，壓實土壤；第三，用無菌移液管吸取5ml的細菌菌體懸濁液，沿幼苗根系將其緩緩注入， 然后再覆一層基質(zhì)土，每個處理的盆栽基質(zhì)土為200g ；第四，澆水定根。以單接種細菌或外 生菌根菌及不接菌三種處理作為對照，每處理10個重復(fù)。置于25°C溫室培養(yǎng)，光照為12h/ d，適時澆水，統(tǒng)一管理。待雙接種處理的黑松苗生長10個月后，將其小心地從培養(yǎng)杯中取 出，測量苗高、地徑。以未接菌根菌的松苗作為對照，每處理3個以上重復(fù)。試驗結(jié)果表明(表4;圖3)，單接種HB12菌株、單接種Be菌株，雙接種HBl 2+Be都 對黑松苗的生長起到了較明顯的促進作用。與對照相比，單接種HB12、單接種Be和兩者雙 接種處理黑松苗高分別增長了 36. 0%、24. 5%和44. 0% ；黑松地徑增長了 22. 9%、26. 5% 和 27. 7%。表4蠟狀芽孢桿菌HB12與美味牛肝菌(Be)互作對黑松苗木生長的影響 實施例3 蠟狀芽孢桿菌HB12對絲核菌(Rhizoctonia sp.)平板抑菌作用將用NA斜面活化的蠟狀芽孢桿菌HB12菌株劃線接種于PDA平板兩側(cè)，再將松樹 苗木猝倒病病原菌PDA平板培養(yǎng)物用直徑5mm的打孔器打取同質(zhì)同量的菌塊，點接于平板 中間。28°C培養(yǎng)7天觀察抑菌帶的有無，并記錄其寬度。從表5和圖4可看出，HB12對病 原菌絲核菌(Rhizoctonia sp.)具有拮抗作用。與對照相比，抑菌率達44. 2%。表5蠟狀芽孢桿菌HB12對絲核菌(Rhizoctonia sp.)的抑制作用 實施例4 蠟狀芽孢桿菌HB12對溫室盆栽松苗猝倒病的防治芽苗的培育同實施例2;接種方法待黑松芽苗長至子葉期時進行移栽(每處理20個重復(fù))，移栽基質(zhì)土 壤采自南京林業(yè)大學(xué)校園后山，與沙子、蛭石以2 1 1的比例充分混勻后經(jīng)1.01 X IO6Pa 滅菌90min，冷卻后即為培養(yǎng)基質(zhì)。將松苗猝倒病病原菌絲核菌(Rhizoctonia sp.，編號
7Csl)接種到PD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)7d，采用無菌紗布過濾獲得菌體，將其與培養(yǎng)基質(zhì)充分混 勻，即為帶菌培養(yǎng)基質(zhì)。先在育苗杯中放置1/2的無菌培養(yǎng)基質(zhì)，再在每個育苗杯中施20g 帶菌培養(yǎng)基質(zhì)；將黑松苗移栽到育苗杯中，蠟狀芽孢桿菌HB12菌株接種方法同實施例2，設(shè) 不接病原菌為對照(CK)，以校正發(fā)病率，每處理20個重復(fù)，7天后觀察并統(tǒng)計松苗的發(fā)病和 死亡情況。試驗結(jié)果表明(表6)，蠟狀芽孢桿菌HB12提高了松苗抗猝倒病的能力，HBl2+Csl 的猝倒病發(fā)病率為50%，死亡率為40% ；而單接種病原菌Csl的黑松其猝倒病發(fā)病率高達 80%，死亡率為65%。表6不同接種處理對黑松猝倒病發(fā)病率和死亡率的影響
權(quán)利要求
一種外生菌根輔助細菌蠟狀芽孢桿菌HB12，其分類命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，其保藏編號是CCTCC NoM209025，保藏日期2009年2月18日。
2.權(quán)利要求1所述的外生菌根輔助細菌蠟狀芽孢桿菌在促進美味牛肝菌 (Boletusedulis)生長中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的外生菌根輔助細菌蠟狀芽孢桿菌與美味牛肝菌互作在促進黑松 生長中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的外生菌根輔助細菌蠟狀芽孢桿菌在防治由絲核菌 (Rhizoctoniasp.)引起的松苗猝倒病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株外生菌根輔助細菌蠟狀芽孢桿菌HB12，其分類命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，其保藏編號是CCTCC NOM 209025，保藏日期2009年2月18日。本發(fā)明的蠟狀芽孢桿菌HB12為植物根際促生細菌，對黑樹生長具有促進作用，能夠促進外生菌根真菌美味牛肝菌的生長，其與美味牛肝菌雙接種對黑松的促生效果優(yōu)于兩者單接種處理；蠟狀芽孢桿菌HB12對松樹苗木猝倒病病原絲核菌具有抑制作用；溫室防治試驗表明，蠟狀芽孢桿菌HB12菌株能有效防治松樹苗木猝倒病。
文檔編號C05F11/08GK101914469SQ201010227990
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者侯亮亮, 劉輝, 葉建仁, 吳小芹, 盛江梅 申請人:南京林業(yè)大學(xué)