專(zhuān)利名稱(chēng)：歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及歐美山楊雜種的快速繁殖方法，尤其涉及歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)快 速繁殖方法，屬于歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
歐美山楊雜種(Populus tremulaXP. tremuloides)是歐洲山楊和北美山楊的雜 交種，具有生長(zhǎng)快、耐寒、耐貧瘠、樹(shù)形高大、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是溫寒帶山地造林的優(yōu)良樹(shù) 種。同時(shí)該雜種材質(zhì)較軟，細(xì)密，潔白，樹(shù)干端直，是造紙、膠合板、刨花板等工業(yè)的優(yōu)質(zhì)原 料。研究表明在芬蘭，歐美山楊雜種適于山地造林，平原造林長(zhǎng)勢(shì)更好，而且其輪伐 期和生長(zhǎng)速度都快于一般的山地針闊葉造林樹(shù)種。而我國(guó)北方很多地區(qū)的氣候環(huán)境要好于 芬蘭，土壤肥沃，溫度高，日照長(zhǎng)，生長(zhǎng)期也長(zhǎng)，直接采用弓丨進(jìn)優(yōu)良山楊雜種無(wú)性系造林，其 生長(zhǎng)量更加顯著。因此，該樹(shù)種適于在我國(guó)黑龍江南部、吉林、遼寧以及華北地區(qū)種植。目 前作為優(yōu)良用材樹(shù)種被許多國(guó)家廣泛引進(jìn)。但在歐美山楊雜種組織培養(yǎng)的技術(shù)實(shí)施過(guò)程中，面臨著培養(yǎng)基成本高、組培苗易 玻璃化和褐化、商品苗出苗時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，在歐美山楊組織培養(yǎng)技術(shù)操作的各個(gè)環(huán)節(jié)中，以 組培苗易出現(xiàn)玻璃化和褐化的問(wèn)題最為嚴(yán)重，導(dǎo)致成苗率低，增加成本，這些問(wèn)題嚴(yán)重限制 了歐美山楊的繁殖系數(shù)，并影響了歐美山楊大面積的推廣種植。為此，去除歐美山楊組培苗 玻璃化和黃化以及縮短育苗時(shí)間的技術(shù)革新已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服歐美山楊雜種組織培養(yǎng)的過(guò)程中，所存在的培 養(yǎng)基成本高、組培苗易玻璃化和褐化、商品苗出苗時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，提供一種新的歐美山楊雜 種組織培養(yǎng)方法，該方法具有生產(chǎn)成本低、幼苗生長(zhǎng)速度快、幼苗健壯，不易玻璃化，成活率 高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種歐美山楊雜種組織培養(yǎng)的快速繁殖方法，包括以下步驟(1)歐美山楊雜種 的外植體消毒后接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到無(wú)菌試管苗；(2)將步驟(1)所得到幼苗截 段，插入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(3)將步驟(2)所得到幼苗截段，插入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根 培養(yǎng)；(4)將生根后的幼苗截段后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)；(5)煉苗、移栽，即得。其中，步驟(1)中所述的歐美山楊雜種的外植體可以是歐美山楊雜種的嫩莖或新 葉；所述的消毒方式可以是在接種前用清水沖洗5min，無(wú)菌水沖洗3 4遍，再用75%酒 精浸泡30s，邊浸泡邊搖動(dòng)。然后用0. 升汞滅菌2min，再用滅菌的蒸餾水洗4遍；所述 的啟動(dòng)培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為WPM+6-BA 1.0mg/L+2%綿白糖步驟(2)中所述的分化培養(yǎng)基的組成及配制方法包括其組成成分去除肌醇的 WPM+6-BA1. Omg/L+KT 0. 5mg/L+2%綿白糖；其配制方法是采用自來(lái)水配制后并消毒。
為了達(dá)到更好的效果，步驟(2)中所述的苗木截段優(yōu)選按照以下方法進(jìn)行2cm以 下的幼苗切去生理下端葉片，直接插入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；2cm以上的幼苗分割成1. 5-2cm 的截段，切去截段的生理下端葉片，分別得到尖端截段和中部截段(見(jiàn)圖3)；步驟(3)或步驟(4)中所述的生根培養(yǎng)基的組成和配制方法包括(1)培養(yǎng)基的 組成去除肌醇的1/2WPM+IBA 0. 5mg/L+2%綿白糖；⑵配制方法用自來(lái)水代替蒸餾水配 制培養(yǎng)基；用卡拉膠代替瓊脂配制培養(yǎng)基；配制后高溫高壓滅菌。步驟(3)或步驟(4)中所述的幼苗截段優(yōu)選按照以下方法進(jìn)行將幼苗從培養(yǎng)基 中取出，切取單棵幼苗；2cm以下的幼苗切去生理下端葉片；2cm以上的幼苗分割成1. 5-2cm 的截段，將截段生理下端葉片切去，分別得到尖端截段和中部截段(見(jiàn)圖4)；本發(fā)明歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)快速繁殖方法主要具有以下幾方面的優(yōu)點(diǎn)1.生產(chǎn)成本低、可實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)本發(fā)明方法使用廉價(jià)的替代品配制培養(yǎng)基 (以普通自來(lái)水代替蒸餾水；以綿白糖代替分析用蔗糖，卡拉膠代替瓊脂配制培養(yǎng)基)；去 除肌醇；降低大量元素用量；本發(fā)明方法的生產(chǎn)成本相比于現(xiàn)有技術(shù)有顯著降低，可實(shí)現(xiàn) 工業(yè)化生產(chǎn)。2.幼苗生長(zhǎng)速度快采用本發(fā)明組織培養(yǎng)方法，歐美山楊雜種生長(zhǎng)20-30天即可 成苗，與常規(guī)的組織培養(yǎng)方法(分化培養(yǎng))相比，生長(zhǎng)時(shí)間縮短了一半。3.組培苗及移栽苗成活率高。組培苗從幼苗尖端截段轉(zhuǎn)接生根培養(yǎng)基，成活率 高達(dá)98%以上；中、下端截段成活率也可達(dá)70%以上。移栽苗幼苗尖端截段，生根移栽成 活率50%以上；中、下端截段粗壯，生根移栽成活率60% -75%。4.幼苗健壯，葉色嫩綠，不易玻璃化。本發(fā)明使用生根繼代培養(yǎng)來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的無(wú)根繼代培養(yǎng)技術(shù)采用生根培養(yǎng)后幼苗 截段，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，可以用于繼代培養(yǎng)或直接成苗后移栽，從而克服歐美山楊雜種 多次繼代后植株黃化、繁殖系數(shù)低、組培苗成活率低等的缺點(diǎn)。現(xiàn)有的組織培養(yǎng)方法多是分化培養(yǎng)后接著進(jìn)行繼代培養(yǎng)(圖2)，分化培養(yǎng)后幼苗 細(xì)弱，多次繼代培養(yǎng)后，幼苗易出現(xiàn)玻璃化、黃葉、落葉等現(xiàn)象，連續(xù)繼代后需復(fù)壯幼苗；本 發(fā)明方法采用生根培養(yǎng)后再進(jìn)行繼代培養(yǎng)可避免這類(lèi)現(xiàn)象省去復(fù)壯過(guò)程。生根繼代培養(yǎng)雖 不及分化培養(yǎng)產(chǎn)生幼苗數(shù)量多，但生長(zhǎng)速度快、成活率高、苗勢(shì)健壯。因此，選用生根培養(yǎng)轉(zhuǎn) 接生根繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)方法，可以防止由于長(zhǎng)期繼代后的幼苗玻璃化現(xiàn)象的出現(xiàn)?？傊景l(fā)明歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)快速繁殖方法具有幼苗生長(zhǎng)速度快，成活 率高，幼苗健壯，葉色嫩綠，不易玻璃化，生產(chǎn)成本低、可工廠化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。


圖1本發(fā)明歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)(生根繼代)的流程圖。圖2常規(guī)歐美山楊雜種組培(無(wú)根繼代)的技術(shù)流程圖。圖3本發(fā)明歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)分化培養(yǎng)的幼苗(箭頭所指部分是需要切取 的截段)。圖4本發(fā)明歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)生根培養(yǎng)的幼苗(箭頭所指部分是需要切取 的截段)。圖5本發(fā)明歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)的有根繼代植株(生根培養(yǎng)需要20天左
圖6常規(guī)歐美山楊雜種組培的無(wú)根繼代植株(分化培養(yǎng)45天)。圖7本發(fā)明歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)的幼苗尖端截段接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。圖8本發(fā)明歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天的生根狀態(tài)(幼 苗尖端截段)。圖9本發(fā)明歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天的生根狀態(tài)(幼 苗尖端截段)。圖10本發(fā)明歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天的生根狀態(tài)(幼 苗中部截段)。圖11本發(fā)明歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)的幼苗中部截段接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。圖12生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天的生根狀態(tài)(幼苗中部截段)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。WPM培養(yǎng)基的具體組成成分如下1)大量元素1. KNO32. NH4NO33. MgSO4 · 7H204. KH2PO42)微量元素1. MnSO4 · H2O2. ZnSO4 · 7H203. CuSO4 · 5H204. H3BO35. Na2MoO4 · 2H206. KI7. CoCl2 · 6H203)鈣鹽1. CaCl2 · 2H204)鐵鹽:1. FeSO4 · 7H202. Na2-EDTA5)維生素1.煙酸
(mg/L)
1900 1650 370 170
22. 3 8. 6 0. 025 6. 2 0. 25 0. 83 0. 025
440
27. 8 37. 3
0. 5
2.鹽酸硫胺素(維生素B1)0. 43.鹽酸吡哆酸(維生素B6)0. 56)氨基酸1.肌醇1002.甘氨酸2實(shí)施例1(一 )材料處理歐美山楊雜種的枝條經(jīng)過(guò)水培后，取嫩莖和新葉接種，在接種前用清水沖洗5min， 無(wú)菌水沖洗3 4遍，再用75%酒精浸泡30s，邊浸泡邊搖動(dòng)。然后用0. 升汞滅菌2min， 再用滅菌的蒸餾水洗4遍，接種在WPM+6-BA1.0mg/L+2%棉白糖培養(yǎng)基上使之啟動(dòng)，形成無(wú)
菌試管苗。( 二 )培養(yǎng)操作過(guò)程分化培養(yǎng)基用自來(lái)水替代蒸餾水配制培養(yǎng)基；②WPM(去除肌醇)+6-BAl. Omg/ L+KT 0.5mg/L+2%市售綿白糖(用自來(lái)水配制)。1、分化繼代培養(yǎng)利用紫外燈將超凈工作臺(tái)滅菌30分鐘。此次過(guò)程的全部操作均在超凈工作臺(tái)中 的無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。在超凈工作臺(tái)中，切取單棵幼苗。2cm以下的幼苗需要切去生理下端葉 片，直接插入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；2cm以上的幼苗分割成1. 5-2cm截段(見(jiàn)圖3)，切去截段 生理下端葉片，插入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。2、生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)基①1/2WPM(去除肌醇)+IBA 0. 5mg/L+2%棉白糖(用自來(lái)水代替蒸 餾水配制培養(yǎng)基；用卡拉膠代替瓊脂配制培養(yǎng)基)。利用紫外燈將超凈工作臺(tái)滅菌30分鐘。此次過(guò)程的全部操作均在超凈工作臺(tái)中 的無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。在超凈工作臺(tái)中，將幼苗從培養(yǎng)基中取出，切取單棵幼苗。2cm以下的 幼苗切去生理下端葉片；2cm以上的幼苗分割成1.5-2cm截段(見(jiàn)圖4)，均切去截段后的生 理下端葉片，插入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。圖8為幼苗尖端截段生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 天的生根狀態(tài)；圖9為幼苗尖端截段生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天的生根狀態(tài)；圖10為幼苗中部 截段生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天的生根狀態(tài)；圖12為幼苗中部截段生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天的 生根狀態(tài)；從幼苗尖端截段轉(zhuǎn)接生根培養(yǎng)基，成活率高達(dá)98%以上；中、下端截段成活率也 可達(dá)70%以上。3、生根后繼代培養(yǎng)將生根后的幼苗尖端截段后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，成活率高達(dá)98%以上；中、下端 截段成活率也可達(dá)70%以上。在超凈工作臺(tái)中，將生根培養(yǎng)的幼苗從培養(yǎng)基中取出，切取單 棵幼苗。將幼苗分割成1. 5-2cm的截段(每段保證2-3片完整葉片)(圖4)，切去截段生理 下端葉片，插入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)所得到的幼苗健壯，葉色嫩綠，不易 玻璃化。4、煉苗及移栽生長(zhǎng)20-30天即可成苗，煉苗移至大棚培養(yǎng)。幼苗尖端截段細(xì)嫩，生根移栽成活率
650%以上；中、下端截段粗壯，生根移栽成活率60% -75%。對(duì)比試驗(yàn)例1一、試驗(yàn)方法試驗(yàn)方法分為試驗(yàn)組和對(duì)照組；試驗(yàn)組為采用實(shí)施例1的歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)方法；對(duì)照組采用圖2所示的技術(shù)流程圖(所用到的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為現(xiàn)有的歐美 山楊雜種的組織培養(yǎng)方法所采用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件)。二、試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1表1生根繼代和無(wú)根繼代的效果比較 從對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，試驗(yàn)組無(wú)論是從苗木成活率、植株長(zhǎng)勢(shì)還是生長(zhǎng)速度等方 面都明顯要優(yōu)于對(duì)照組。
權(quán)利要求
一種歐美山楊雜種(Populus tremula×P.tremuloides)組織培養(yǎng)的快速繁殖方法，包括以下步驟(1)歐美山楊雜種的外植體消毒后接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到無(wú)菌試管苗；(2)將步驟(1)所得到無(wú)菌試管苗截段，插入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(3)將步驟(2)所得到幼苗截段，插入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；(4)將生根后的幼苗截段后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)；(5)煉苗、移栽，即得。
2.按照專(zhuān)利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于步驟(1)中所述的歐美山楊雜 種的外植體是歐美山楊雜種的嫩莖或新葉。
3.按照專(zhuān)利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于，步驟(1)中所述的消毒方式是 在接種前用清水沖洗5分鐘，無(wú)菌水沖洗3 4遍，再用75%酒精浸泡30秒，邊浸泡邊搖 動(dòng)。然后用0. 升汞滅菌2分鐘，再用滅菌的蒸餾水洗4遍。
4.按照專(zhuān)利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于，步驟(1)中所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基的 組成為WPM+6-BA 1. Omg/L+2%蔗糖。
5.按照專(zhuān)利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于步驟(2)中所述的分化培養(yǎng)基 的組成成分及配制方法包括其組成成分去除肌醇的WPM+6-BA1. Omg/L+KT 0. 5mg/L+2% 綿白糖；其配制方法是采用自來(lái)水配制后并消毒。
6.按照專(zhuān)利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于步驟(2)中所述的苗木截段按 照以下方法進(jìn)行2cm以下的幼苗切去生理下端葉片，得到尖端截段直接插入分化培養(yǎng)基 中培養(yǎng)；2cm以上的幼苗分割成1. 5-2cm的截段，切去截段的生理下端葉片，分別得到尖端 截段和中部截段。
7.按照專(zhuān)利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于步驟(3)或步驟(4)中所述的生 根培養(yǎng)基的組成和配制方法包括培養(yǎng)基的組成去除肌醇的1/2WPM+IBA 0. 5mg/L+2%綿 白糖；其配制方法包括用自來(lái)水代替蒸餾水配制培養(yǎng)基，用卡拉膠代替瓊脂配制培養(yǎng)基； 配制后高溫高壓滅菌。
8.按照專(zhuān)利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于步驟(3)或步驟(4)中所述的 幼苗截段按照以下方法進(jìn)行將幼苗從培養(yǎng)基中取出，切取單棵幼苗；2cm以下的幼苗切去 生理下端葉片得到尖端截段；2cm以上的幼苗分割成1. 5-2cm的截段，將截段生理下端葉片 切去，分別得到尖端截段和中部截段。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種歐美山楊雜種(Populus tremula×P.tremuloides)組織培養(yǎng)的快速繁殖方法，包括以下步驟(1)將歐美山楊雜種的外植體消毒后接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到無(wú)菌試管苗；(2)將步驟(1)所得到試管苗截段，插入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(3)將步驟(2)所得到幼苗截段，插入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；(4)將生根后的幼苗截段后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)；(5)煉苗、移栽，即得。本發(fā)明歐美山楊雜種的組織培養(yǎng)快速繁殖方法具有幼苗生長(zhǎng)速度快，成活率高，幼苗健壯，葉色嫩綠，不易玻璃化，生產(chǎn)成本低、可工廠化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101897296SQ20101023088
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者孟凡娟, 楊傳平, 王秋玉, 閆紹鵬, 魏志剛 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué)