專利名稱：杉木胚性愈傷組織的繼代保存方法及其繼代培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胚性愈傷組織的繼代保存方法及其繼代培養(yǎng)基，特別涉及杉木胚性愈傷組織的繼代保存方法及其繼代培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
杉木是常綠針葉樹種之一，是我國特有的速生商品材樹種。杉木生長迅速，主莖通直圓滿，材質(zhì)輕而韌，紋理美觀，加工容易。目前，社會(huì)上對(duì)杉木優(yōu)良種苗的需求極為迫切， 而傳統(tǒng)方法靠杉木種子園提供種子，易受到自然條件的限制，出現(xiàn)種子大小年的現(xiàn)象而導(dǎo)致良種種子產(chǎn)量不穩(wěn)定，加上種子本身存在播種品質(zhì)不穩(wěn)定的問題，這些都在一定程度上影響著杉木速生豐產(chǎn)林的發(fā)展。因此，有必要探索杉木優(yōu)良種質(zhì)資源的無性快速繁殖技術(shù)。苗木無性快速繁殖技術(shù)主要有三種一是器官發(fā)生；二是叢生芽增殖；三是體細(xì)胞胚胎發(fā)生。其中體細(xì)胞胚是指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個(gè)非合子細(xì)胞、經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的具有雙極性胚狀結(jié)構(gòu)。通過胚狀體再生植株的優(yōu)點(diǎn)是在一個(gè)培養(yǎng)物上所能分生的胚狀體數(shù)往往比不定芽數(shù)多，因此成苗率高。因體細(xì)胞胚具有雙極性、繁殖快、遺傳專一的特點(diǎn)，體細(xì)胞胚發(fā)生成為木本植物尤其是裸子植物快繁的一種非常有效的途徑。由于體細(xì)胞胚發(fā)生為單細(xì)胞起源，不會(huì)出現(xiàn)嵌合問題，胚性組織高密度、高質(zhì)量，因此可一次獲得大量植株。目前體細(xì)胞胚發(fā)生不僅是人工種子生產(chǎn)的重要手段，而且也是轉(zhuǎn)基因植株穩(wěn)定再生的主要方式。體細(xì)胞胚胎發(fā)生，即從體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞，其過程變化復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果，這些因素包括一是外植體的選擇及處理；二是基本培養(yǎng)基的種類和成分；三是植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)；四是附加成分；五是培養(yǎng)條件。以前雖然有很多杉木組織培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道，但主要是通過以芽繁牙的快繁方式， 容易產(chǎn)生側(cè)芽生長位置效應(yīng)，導(dǎo)致苗木偏斜生長的位置效應(yīng)問題，嚴(yán)重打擊了林農(nóng)使用優(yōu)良無性系組培造林的積極性。目前對(duì)于杉屬植物的胚性愈傷組織的發(fā)生、穩(wěn)定繼代和體細(xì)胞胚的成熟、萌發(fā)以及植株的再生等問題仍然存在各種難題。其中，如何保持杉木的胚性愈傷組織進(jìn)行較長時(shí)間的繼代而不丟失其胚性是其中最重要問題之一。松杉類植物胚性愈傷組織由胚性胚柄團(tuán)構(gòu)成，選擇合適的培養(yǎng)基是其正常繼代保存的關(guān)鍵。在繼代階段，培養(yǎng)物中有一系列大小不同的胚性胚柄團(tuán)，只有保持適宜的培養(yǎng)條件，這些胚性胚柄團(tuán)才能不斷地?zé)o序分裂，細(xì)胞系得以正常繼代而保存下來。一些細(xì)胞系在長期培養(yǎng)過程中會(huì)失去體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力。有體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力的培養(yǎng)物是光滑的， 其它培養(yǎng)物表面會(huì)出現(xiàn)繩索狀生長物。杉木胚性愈傷組織對(duì)培養(yǎng)基的各種成分和理化條件非常敏感，迄今為止還沒有在常溫下有效繼代方法及其較專一的培養(yǎng)基，調(diào)整繼代保存的培養(yǎng)基配方，改進(jìn)繼代方法，顯然對(duì)于體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究，具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于胚性愈傷組織繼代的培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的用于胚性愈傷組織繼代的培養(yǎng)基由以下成分組成大量元素KN03、Ca(NO3) 2 · 4H20、NH4N03、KH2PO4, CaCl2 · 2H20 和 MgSO4 · 7H20 ；微量元素=MnSO4· 4H20、ZnSO4 · 7H20、H3BO3、ΚΙ、Na2MoO4 · 2H20、CuSO4 · 5Η20 禾口 CoCl2 · 6Η20 ；鐵鹽=FeSO4 · 7Η20 和 Na2EDTA · 2Η20 ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素、煙酸、鹽酸吡哆醇、甘氨酸、肌醇、酶水解酪蛋白、蔗糖和谷氨酰胺；激素2，4- 二氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤；支持物瓊脂或植物凝膠；水；以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為大量元素=KNO30. 34g/L、Ca (NO3)2 · 4H20 0. 556g/L、NH4NO3 0. 4g/L、KH2PO4O. 17g/ L、CaCl2 · 2H20 0. 085g/L 和 MgSO4 · 7H20 0. 37g/L ；微量元素MnSO4· 4H20 22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、 KIO. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L 和 CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L ；鐵鹽FeSO4· 7H20 15mg/L_45mg/L 或 15mg/L 或 27. 8mg/L 或 45mg/L 禾口 Na2EDTA · 2H20 20mg/L_60mg/L 或 20mg/L 或 37. 3mg/L 或 60mg/L ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素0. 25mg/L-lmg/L或0. 25mg/L或0. 5mg/L或lmg/L、煙酸 0. 25mg/L-lmg/L 或 0. 25mg/L 或 0. 5mg/L 或 lmg/L、鹽酸吡哆醇 0. 25mg/L_lmg/L 或 0. 25mg/ L 或 0. 5mg/L 或 lmg/L、甘氨酸 0. lmg/L-O. 4mg/L 或 0. lmg/L 或 0. 2mg/L 或 0. 4mg/L、肌醇 500mg/L-l, 500mg/L 或 500mg/L 或 1，000mg/L 或 1，500mg/L、酶水解酪蛋白 250mg/L_750mg/ L 或 250mg/L 或 500mg/L 或 750mg/L、蔗糖 20，000mg/L-40, 000mg/L 或 20，000mg/L 或 30，000mg/L 或 40，000mg/L 和谷氨酰胺 300mg/L-600mg/L 或 300mg/L 或 450mg/L 或 600mg/ L ；激素2，4_二氯苯氧乙酸 0. 25mg/L-l. 5mg/L 或 0. 25mg/L 或 0. 5mg/L 或 1. 5mg/L、 6_ 芐基腺嘌呤 0. lmg/L-O. 4mg/L 或 0. lmg/L 或 0. 2mg/L 或 0. 4mg/L 和 6-糠氨基嘌呤 0. Img/ L-0. 4mg/L 或 0. lmg/L 或 0. 2mg/L 或 0. 4mg/L ；支持物瓊脂7g/L或植物凝膠2. 5g/L。所述繼代培養(yǎng)基的組成中水為雙蒸蒸餾水或超純水或去離子水。所述繼代培養(yǎng)基的pH值為5. 0-6. 0，具體為5. O、5. 8或6. O。所述胚性愈傷組織為杉科植物的胚性愈傷組織；所述杉科植物為杉木屬植物；所述杉木屬植物為杉木。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種胚性愈傷組織的繼代保存方法，是用所述繼代培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)胚性愈傷組織。所述繼代培養(yǎng)的條件為黑暗和溫度為21°C _23°C，所述溫度具體為21°C、22°C或 23 °C。所述方法中，待所述愈傷組織生長至直徑為2cm-4cm或2cm或3cm或4cm時(shí)，再進(jìn)行下一次繼代。所述方法中，所述繼代培養(yǎng)基的支持物為瓊脂時(shí)，繼代間隔時(shí)間為15天-21 天，具體為15天、18天或21天；所述繼代培養(yǎng)基的支持物為植物凝膠時(shí)，繼代間隔時(shí)間為10 天-14天，具體為10天、12天或14天。所述方法中，所述胚性愈傷組織為杉科植物的胚性愈傷組織；所述杉科植物為杉木屬植物；所述杉木屬植物為杉木。所述杉木胚性愈傷組織按照包括如下步驟的方法制備得到(1)將胚發(fā)育至子葉前合子胚時(shí)期的未成熟杉木球果，在4°C冷藏30天；(2)從步驟(1)冷藏后的杉木球果中取出種子，將種子消毒后，剝出幼胚，將剝出的幼胚作為外植體；(3)將步驟⑵得到的外植體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于黑暗和溫度為25°C的條件下， 誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，得到杉木胚性愈傷組織；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分組成大量元素KN03、CaNO3· 4H20、NH4N03、KH2PO4, CaCl2 · 2H20 和 MgSO4 ；微量元素HB03、ZnSO4· 7H20、MnSO4 · H2O, Na2MoO4 · 2H20、KI、CuSO4 · 5H20 和 CoCl2 ；鐵鹽=FeSO4和 Na2EDTA ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌醇、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白和蔗糖；激素2，4- 二氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤；支持物瓊脂；水超純水；以上成分在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度分別為大量元素KN033 40mg/L, CaNO3 · 4H20 556mg/L, NH4NO3 400mg/L, KH2PO4170mg/L, CaCl2 · 2H20 85mg/L 和 MgSO4 370mg/L ；微量元素:ΗΒ036. 2mg/L, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L, MnSO4 · H2O 22. 3mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L, KI 0. 83mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 25mg/L 和 CoCl2 0. 025mg/L ；鐵鹽=FeSO45. 57g/L 和 Na2EDTA 7. 45g/L ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素0. 5mg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、煙酸0. 5mg/L、肌醇IOOmg/ L、谷氨酰胺400mg/L、酶水解酪蛋白500mg/L和蔗糖30，000mg/L ；激素2，4- 二氯苯氧乙酸2mg/L和6_芐基腺嘌呤0. 5mg/L ；支持物瓊脂7g/L ；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5. 8。本發(fā)明所提供的杉木胚性愈傷組織的繼代保存方法及其繼代培養(yǎng)基，對(duì)杉木胚性愈傷組織的培養(yǎng)效果好，能較長時(shí)間保持杉木愈傷組織的胚性能力，為后續(xù)的杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生等研究帶來極大的方便，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


圖1為用所述繼代培養(yǎng)基繼代保存2年的胚性愈傷組織。其中，A為用所述繼代培養(yǎng)基(以瓊脂為支持物)繼代保存2年的胚性愈傷組織； B為用所述繼代培養(yǎng)基(以植物凝膠為支持物)繼代保存2年的胚性愈傷組織。圖2為用對(duì)照培養(yǎng)基(即MS培養(yǎng)基)繼代保存的生長不良的胚性愈傷組織。
圖3為在40倍的光學(xué)顯微鏡下觀察到的繼代培養(yǎng)基繼代保存2年的胚性愈傷組織的胚性細(xì)胞發(fā)育狀況。其中，A為用所述繼代培養(yǎng)基(以瓊脂為支持物)繼代保存2年的胚性愈傷組織的胚性細(xì)胞發(fā)育狀況；B為用所述繼代培養(yǎng)基(以植物凝膠為支持物)繼代保存2年的胚性細(xì)胞發(fā)育狀況。圖4為在40倍 的光學(xué)顯微鏡下觀察到的對(duì)照培養(yǎng)基(即MS培養(yǎng)基)繼代保存的胚性愈傷組織的胚性細(xì)胞發(fā)育狀況。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的百分比濃度如無特殊說明，均為質(zhì)量百分比濃度。實(shí)施例1、杉木胚性愈傷組織的繼代保存方法I一、誘導(dǎo)杉木胚性愈傷組織將胚發(fā)育至子葉前合子胚時(shí)期的未成熟杉木球果(購自福建省三明市清流縣福新苗圃)采摘后，在4°C低溫下冷藏30天，然后從球果中取出種子，將種子用70%的酒精浸潤lmin，無菌水沖洗3次后，再放入0. 1 %的升汞溶液中滅菌5min，無菌水沖洗三次后，剝出的幼胚(子葉前合子胚)作為外植體，將外植體轉(zhuǎn)入裝有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶(40ml培養(yǎng)基)中，每個(gè)三角瓶中外植體個(gè)數(shù)為6個(gè)，置于黑暗的環(huán)境中，溫度為25°C，誘導(dǎo)培養(yǎng)30 天，得到杉木胚性愈傷組織。上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分組成大量元素KN03、CaNO3· 4H20、NH4N03、KH2PO4, CaCl2 · 2H20 和 MgSO4 ；微量元素HB03、ZnSO4· 7H20、MnSO4 · H2O, Na2MoO4 · 2H20、KI、CuSO4 · 5H20 和 CoCl2 ；鐵鹽=FeSO4和 Na2EDTA ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌醇、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白 (sigma，C0626)和蔗糖；激素2，4- 二氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤；支持物瓊脂；水超純水；以上成分在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度分別為大量元素KN033 40mg/L, CaNO3 · 4H20 556mg/L, NH4NO3 400mg/L, KH2PO4170mg/L, CaCl2 · 2H20 85mg/L 和 MgS04370mg/L ；微量元素HB036. 2mg/L, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L, MnSO4 · H2O 22. 3mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L, KI 0. 83mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 25mg/L 和 CoCl2 0. 025mg/L ；鐵鹽=FeSO45. 57g/L 和 Na2EDTA 7. 45g/L ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素0. 5mg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、煙酸0. 5mg/L、肌醇IOOmg/ L、谷氨酰胺400mg/L、酶水解酪蛋白500mg/L和蔗糖30，000mg/L ；激素2，4- 二氯苯氧乙酸2mg/L和6_芐基腺嘌呤0. 5mg/L ；
支持物瓊脂7g/L ；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5. 8。二、杉木胚性愈傷組織的繼代保存1、配制繼代培養(yǎng)基IOX 大量元素的配制方法為將3. 4g KNO3>5. 56g Ca(NO3)2 .4H20、4g ΝΗ4Ν03、1· 7g ΚΗ2Ρ04、0· 85g CaCl2 · 2Η20、3· 7g MgSO4 · 7Η20混合，用雙蒸水溶解，并定容至1升，室溫保存；100Χ 微量元素的配制方法為將 2. 23g MnSO4 · 4Η20、0· 86g ZnSO4 · 7H20、 0. 62gH3B03、83mg KI、25mg Na2MoO4 · 2H20、2. 5mg CuSO4 · 5H20、2. 5mg CoCl2 · 6H20 混合，用水溶解，并定容至1升，室溫保存；200 X 鐵鹽的配制方法為將 3. Og FeSO4 ·7Η20、4· Og Na2EDTA ·2Η20 分別用 200mL
水溶解，再混合并定容至1升，室溫保存；有機(jī)組分配制方法將0. 025g鹽酸硫胺素(VB1)、0· 025g煙酸(VB3)、0· 025g鹽酸吡哆醇(VB6)、0. Olg甘氨酸混合，用水溶解，并定容至100毫升，配置成1000X濃度的混合液，記作有機(jī)組分溶液I，0. 22 μ m過濾除菌，-20°c保存，使用前從_20°C取出，室溫融化并混勻后使用；稱取15g谷氨酰胺，用水溶解，并定容至1升，配置成50 X的濃度，記作有機(jī)組分溶液II，0. 22 μ m過濾除菌后，_20°C保存，使用前從_20°C取出，室溫融化并混勻后使用；激素溶液配制方法分別將0. 25g 2，4_二氯苯氧乙酸Q，4_D)、0. Ig 6_芐基腺嘌呤(6-BA)和0. Ig 6-糠氨基嘌呤(KT)用水溶解，并定容至100毫升，得到10，000X激素溶液，4°C保存；將IOOmL IOX大量元素、IOmL 100X微量元素、5mL 200X鐵鹽、100 μ L激素溶液 (2，4-D，6-ΒΑ和KT)、0. 5g肌醇、0. 25g酶水解酪蛋白，20g蔗糖混勻，用水定容至0. 98L，用 IM KOH或IM HCl調(diào)pH至5.0，加入瓊脂至7g/L或植物凝膠至2. 5g/L，然后在121°C下，高壓滅菌20分鐘；等培養(yǎng)基冷卻至50°C左右，在無菌條件下加入ImL 1000X有機(jī)組分溶液I 和20mL 50X有機(jī)組分溶液II，充分混勻，得到繼代培養(yǎng)基。倒入三角瓶或培養(yǎng)皿中備用。配制培養(yǎng)基的水為雙蒸蒸餾水；所配制的繼代培養(yǎng)基由以下成分組成大量元素KN03、Ca(NO3) 2 · 4H20、NH4N03、KH2PO4, CaCl2 · 2H20、MgSO4 · 7H20 ；微量元素MnS04· 4H20、ZnSO4 · 7H20、H3BO3, ΚΙ、Na2MoO4 · 2H20、CuSO4 · 5H20、 CoCl2 · 6H20 ；鐵鹽=FeSO4· 7H20、Na2EDTA · 2H20 ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素(VB1)、煙酸(VB3)、鹽酸吡哆醇(VB6)、甘氨酸、肌醇、酶水解酪蛋白、蔗糖和谷氨酰胺；激素2，4- 二氯苯氧乙酸0，4-D)、6_芐基腺嘌呤(6_BA)和6_糠氨基嘌呤(KT)；支持物瓊脂或植物凝膠；水雙蒸蒸餾水；以上成分在所述繼代培養(yǎng)基中濃度分別為大量元素=KNO30. 34g/L、Ca (NO3)2 · 4H20 0. 556g/L、NH4NO3 0. 4g/L、KH2PO4O. 17g/ L、CaCl2 · 2H20 0. 085g/L 和 MgSO4 · 7H20 0. 37g/L ；
8
微量元素MnS04· 4H20 22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、 KIO. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L 和 CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L ；鐵鹽=FeSO4· 7H 20 15mg/L 和 Na2EDTA · 2H20 20mg/L ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素0. 25mg/L、煙酸0. 25mg/L、鹽酸吡哆醇0. 25mg/L、甘氨酸 0. lmg/L、肌醇500mg/L、酶水解酪蛋白250mg/L、蔗糖20，000mg/L和谷氨酰胺300mg/L ；激素2，4_ 二氯苯氧乙酸0. 25mg/L、6-芐基腺嘌呤0. lmg/L和6_糠氨基嘌呤 0. lmg/L ；支持物瓊脂7g/L或植物凝膠2. 5g/L。同時(shí)，設(shè)計(jì)對(duì)照培養(yǎng)基(即MS培養(yǎng)基)大量元素=KNO31. 9g/L,NH4NO3 1. 65g/L,KH2PO4 0. 17g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 44g/L 禾口 MgSO4 · 7H20 0. 37g/L ；微量元素MnSO4· 4H20 22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、 K10. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L 和 CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L ；鐵鹽=FeSO4· 7H20 27. 8mg/L 和 Na2EDTA · 2H20 37. 3mg/L ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素0. lmg/L、煙酸0. 5mg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2mg/ 1^肌醇100mg/L、酶水解酪蛋白500mg/L和蔗糖30，000mg/L ；激素2，4 二氯苯氧乙酸0. 5mg/L、6芐基腺嘌呤0. 2mg/L和6_糠氨基嘌呤0. 2mg/ L；支持物瓊脂7g/L。2、杉木胚性愈傷組織的繼代保存將盛有上述步驟一得到的裝有杉木胚性愈傷組織的三角瓶用70%的乙醇消毒表面，然后放入超凈工作臺(tái)，用無菌的鑷子挑取外周顏色較白的組織塊轉(zhuǎn)移到上述配制的繼代培養(yǎng)基上，按每塊分成2-3塊的標(biāo)準(zhǔn)，丟棄中間部分顏色為淺黃的愈傷組織，每瓶放置 6-8組織塊。將轉(zhuǎn)移后的杉木胚性愈傷組織置于黑暗的環(huán)境中、溫度為21°C進(jìn)行培養(yǎng)，待愈傷組織生長至直徑為2cm時(shí)再進(jìn)行下一次繼代，若所述繼代培養(yǎng)基的支持物為瓊脂時(shí)，繼代間隔時(shí)間為15天；若所述繼代培養(yǎng)基的支持物為植物凝膠時(shí)，繼代間隔時(shí)間為10天。按照此繼代保存的方法，保存杉木胚性愈傷組織2年。從培養(yǎng)結(jié)果可見用所述繼代培養(yǎng)基(以瓊脂為支持物)繼代保存2年的胚性愈傷組織生長良好，表面光滑(圖1中A)，在40倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，大部分細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)結(jié)合比較緊密，細(xì)胞質(zhì)充滿整個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)完整，易于觀察到胚性細(xì)胞， 其胚頭細(xì)胞和胚柄細(xì)胞分別為圓形和長形，區(qū)別明顯(圖3中的A)，具有體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力；用所述繼代培養(yǎng)基(以植物凝膠為支持物)繼代保存2年的胚性愈傷組織生長良好，表面光滑(圖1中B)，在40倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)結(jié)合比較緊密，細(xì)胞質(zhì)充滿整個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)比較完整清晰，胚頭細(xì)胞和胚柄細(xì)胞分別為圓形和長形， 區(qū)別明顯(圖3中的B)，具有體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力；用對(duì)照培養(yǎng)基(即MS培養(yǎng)基)繼代保存90天的胚性愈傷組織表面出現(xiàn)繩索狀生長物(圖2)，在40倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，部分細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，細(xì)胞質(zhì)固縮，觀察不到特征明顯的胚性細(xì)胞(圖4)，失去體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力。方法II
一、誘導(dǎo)杉木胚性愈傷組織除以下1)和2)外，其他方法均與方法I相同1)將杉木種子放入0. 的升汞溶液中滅菌7min ；2)每個(gè)三角瓶中外植體個(gè)數(shù)為7個(gè)。二、杉木胚性愈傷組織的繼代保存1、配制繼代培養(yǎng)基所配制的繼代培養(yǎng)基由以下成分組成大量元素與方法I中相同；微量元素與方法I中相同；鐵鹽與方法I中相同；有機(jī)成分與方法I中相同；激素與方法I中相同；支持物與方法I中相同；水超純水；以上成分在所述繼代培養(yǎng)基中濃度分別為大量元素與方法I中相同；微量元素與方法I中相同；鐵鹽=FeSO4· 7H20 27. 8mg/L 和 Na2EDTA · 2H20 37. 3mg/L ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素0. 5mg/L、煙酸0. 5mg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸 0. ang/L、肌醇1，000mg/L、酶水解酪蛋白500mg/L、蔗糖30，000mg/L和谷氨酰胺450mg/L ；激素2，4_二氯苯氧乙酸0. 5mg/L、6-芐基腺嘌呤0. 2mg/L和6_糠氨基嘌呤0. 2m/ L；支持物植物凝膠2. 5g/L ；所述繼代培養(yǎng)基的PH值為5. 8。對(duì)照培養(yǎng)基(即MS培養(yǎng)基)也與方法I中相同。2、杉木胚性愈傷組織的繼代保存將盛有上述步驟一得到的裝有杉木胚性愈傷組織的三角瓶用70%的乙醇消毒表面，然后放入超凈工作臺(tái)，用無菌的鑷子挑取外周顏色較白的組織塊轉(zhuǎn)移到上述配制的繼代培養(yǎng)基上，按每塊分成2-3塊的標(biāo)準(zhǔn)，丟棄中間部分顏色為淺黃的愈傷組織，每瓶放置 6-8組織塊。將轉(zhuǎn)移后的杉木胚性愈傷組織置于黑暗的環(huán)境中、溫度為22°C進(jìn)行培養(yǎng)，待愈傷組織生長至直徑為3cm時(shí)再進(jìn)行下一次繼代，若所述繼代培養(yǎng)基的支持物為瓊脂時(shí)，繼代間隔時(shí)間為18天；若所述繼代培養(yǎng)基的支持物為植物凝膠時(shí)，繼代間隔時(shí)間為12天。按照此繼代保存的方法，保存杉木胚性愈傷組織2年。培養(yǎng)結(jié)果與與方法I無顯著差異。方法III一、誘導(dǎo)杉木胚性愈傷組織除以下1)和2)外，其他方法均與方法I相同1)將杉木種子放入0. 的升汞溶液中滅菌IOmin ；2)每個(gè)三角瓶中外植體個(gè)數(shù)為8個(gè)。
二、杉木胚性愈傷組織的繼代保存1、配制繼代培養(yǎng)基 所配制的繼代培養(yǎng)基由以下成分組成大量元素與方法I中相同；微量元素與方法I中相同；鐵鹽與方法I中相同；有機(jī)成分與方法I中相同；激素與方法I中相同；支持物與方法I中相同；水去離子水；以上成分在所述繼代培養(yǎng)基中濃度分別為大量元素與方法I中相同；微量元素與方法I中相同；鐵鹽=FeSO4· 7H20 45mg/L 和 Na2EDTA · 2H20 60mg/L ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素lmg/L、煙酸lmg/L、鹽酸吡哆醇lmg/L、甘氨酸0. 4mg/L、肌醇1，500mg/L、酶水解酪蛋白750mg/L、蔗糖40，000mg/L和谷氨酰胺600mg/L ；激素2，4- 二氯苯氧乙酸1. 5mg/L、6-芐基腺嘌呤0. 4mg/L和6-糠氨基嘌呤 0. 4mg/L ；支持物瓊脂7g/L;所述繼代培養(yǎng)基的PH值為6. 0。對(duì)照培養(yǎng)基(即MS培養(yǎng)基)也與方法I中相同。2、杉木胚性愈傷組織的繼代保存將盛有上述步驟一得到的裝有杉木胚性愈傷組織的三角瓶用70%的乙醇消毒表面，然后放入超凈工作臺(tái)，用無菌的鑷子挑取外周顏色較白的組織塊轉(zhuǎn)移到上述配制的繼代培養(yǎng)基上，按每塊分成2-3塊的標(biāo)準(zhǔn)，丟棄中間部分顏色為淺黃的愈傷組織，每瓶放置 6-8組織塊。將轉(zhuǎn)移后的杉木胚性愈傷組織置于黑暗的環(huán)境中、溫度為23°C進(jìn)行培養(yǎng)，待愈傷組織生長至直徑為4cm時(shí)再進(jìn)行下一次繼代，若所述繼代培養(yǎng)基的支持物為瓊脂時(shí)，繼代間隔時(shí)間為21天；若所述繼代培養(yǎng)基的支持物為植物凝膠時(shí)，繼代間隔時(shí)間為14天。按照此繼代保存的方法，保存杉木胚性愈傷組織2年。培養(yǎng)結(jié)果與與方法I無顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種用于胚性愈傷組織繼代的培養(yǎng)基，由以下成分組成大量元素:KN03> Ca (NO3) 2 · 4H20、NH4NO3> KH2PO4、CaCl2 · 2H20 和 MgSO4 · 7H20 ； 微量元素MnS04 · 4H20、ZnSO4 · 7H20、H3BO3> ΚΙ、Na2MoO4 · 2Η20、CuSO4 · 5Η20 禾口 CoCl2 · 6Η20 ；鐵鹽=FeSO4 · 7Η20 和 Na2EDTA · 2Η20 ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素、煙酸、鹽酸吡哆醇、甘氨酸、肌醇、酶水解酪蛋白、蔗糖和谷氨酰胺；激素2，4- 二氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤； 支持物瓊脂或植物凝膠； 水；以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為大量元素KNO3 0. 34g/L、Ca(NO3)2 · 4Η20 0. 556g/L、NH4NO3 0. 4g/L、KH2PO4O. 17g/L、 CaCl2 · 2H20 0. 085g/L 和 MgSO4 · 7H20 0. 37g/L ；微量元素:MnS04 · 4H20 22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、KIO. 83mg/L、 Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L 和 CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L ；鐵鹽=FeSO4 · 7H20 15mg/L-45mg/L 或 15mg/L 或 27. 8mg/L 或 45mg/L 和 Na2EDTA · 2H20 20mg/L-60mg/L 或 20mg/L 或 37. 3mg/L 或 60mg/L ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素 0. 25mg/L-lmg/L或 0. 25mg/L 或 0. 5mg/L 或 lmg/L、煙酸 0. 25mg/ L-lmg/L 或 0. 25mg/L 或 0. 5mg/L 或 lmg/L、鹽酸吡哆醇 0. 25mg/L_lmg/L 或 0. 25mg/L 或 0. 5mg/L 或 lmg/L、甘氨酸 0. lmg/L-0. 4mg/L 或 0. lmg/L 或 0. 2mg/L 或 0. 4mg/L、肌醇 500mg/ L-l, 500mg/L 或 500mg/L 或 1，OOOmg/L 或 1，500mg/L、酶水解酪蛋白 250mg/L_750mg/L 或 250mg/L 或 500mg/L 或 750mg/L、蔗糖 20，000mg/L-40, 000mg/L 或 20，OOOmg/L 或 30，OOOmg/ L 或 40，OOOmg/L 和谷氨酰胺 300mg/L-600mg/L 或 300mg/L 或 450mg/L 或 600mg/L ；激素2，4_二氯苯氧乙酸0. 25mg/L-l. 5mg/L或0. 25mg/L或0. 5mg/L或 1. 5mg/L、6_芐基腺嘌呤 0. lmg/L-0. 4mg/L 或 0. lmg/L 或 0. 2mg/L 或 0. 4mg/L 和 6-糠氨基嘌呤 0. Img/ L-0. 4mg/L 或 0. lmg/L 或 0. 2mg/L 或 0. 4mg/L ； 支持物瓊脂7g/L或植物凝膠2. 5g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的繼代培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的PH值為5.0-6.0，具體為 5. 0,5. 8 或 6. 0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一所述的繼代培養(yǎng)基，其特征在于所述胚性愈傷組織為杉科植物的胚性愈傷組織；所述杉科植物為杉木屬植物；所述杉木屬植物為杉木。
4.一種胚性愈傷組織的繼代保存方法，是用權(quán)利要求1-3中任一所述的培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)胚性愈傷組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述繼代培養(yǎng)是在黑暗和溫度為 210C -230C進(jìn)行，所述溫度具體為21°C、22°C或23°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法中，待所述愈傷組織生長至直徑為2cm-4cm或2cm或3cm或4cm時(shí)，再進(jìn)行下一次繼代。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，所述繼代培養(yǎng)基的支持物為瓊脂時(shí)，繼代間隔時(shí)間為15天-21天，具體為15天、18天或21天；所述繼代培養(yǎng)基的支持物為植物凝膠時(shí)，繼代間隔時(shí)間為10天-14天，具體為10天、12天或14天。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，所述胚性愈傷組織為杉科植物的胚性愈傷組織；所述杉科植物為杉木屬植物；所述杉木屬植物為杉木。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述杉木胚性愈傷組織按照包括如下步驟的方法制備得到(1)將胚發(fā)育至子葉前合子胚時(shí)期的未成熟杉木球果，在4°C冷藏30天；(2)從步驟(1)冷藏后的杉木球果中取出種子，將種子消毒后，剝出幼胚，將剝出的幼胚作為外植體；(3)將步驟(2)得到的外植體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于黑暗和溫度為25°C的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，得到杉木胚性愈傷組織；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分組成大量元素KN03、CaNO3 · 4H20、NH4NO3> KH2PO4, CaCl2 · 2H20 和 MgSO4 ； 微量元素HB03、ZnSO4 · 7H20、MnSO4 · H2O, Na2MoO4 · 2Η20、ΚΙ、CuSO4 · 5Η20 和 CoCl2 ； 鐵鹽=FeSO4 和 Na2EDTA ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌醇、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白和蔗糖； 激素2，4-二氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤； 支持物瓊脂； 水；以上成分在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度分別為大量元素KN03 3 40mg/L, CaNO3 · 4H20 556mg/L, NH4NO3 400mg/L, KH2PO4170mg/L, CaCl2 · 2H20 85mg/L和 MgSO4 370mg/L ；微量元素:ΗΒ03 6. 2mg/L, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L, MnSO4 · H2O 22. 3mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L, KI 0. 83mg/L, CuSO4· 5H20 0.25mg/L和 CoCl2 0.025mg/L ； 鐵鹽=FeSO4 5. 57g/L 和 Na2EDTA 7. 45g/L ；有機(jī)成分鹽酸硫胺素0. 5mg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L、煙酸0. 5mg/L、肌醇100mg/L、谷氨酰胺400mg/L、酶水解酪蛋白500mg/L和蔗糖30，000mg/L ； 激素2，4- 二氯苯氧乙酸2mg/L和6-芐基腺嘌呤0. 5mg/L ； 支持物瓊脂7g/L ； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的PH值為5. 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了胚性愈傷組織的繼代保存方法及其繼代培養(yǎng)基。該胚性愈傷組織的繼代保存方法是用所述繼代培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)胚性愈傷組織。本發(fā)明所提供的胚性愈傷組織的繼代保存方法及其繼代培養(yǎng)基，對(duì)杉木胚性愈傷組織的培養(yǎng)效果好，能較長時(shí)間保持杉木愈傷組織的胚性能力，為后續(xù)的杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生等研究帶來極大的方便，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102369879SQ20101024961
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者萬里川, 張海燕, 郭毅 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院植物研究所