專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導的小油桐基因轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及小油桐轉(zhuǎn)基因技術(shù)，具體涉及一種通過農(nóng)桿菌介 導基因轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得小油桐轉(zhuǎn)基因植株的方法方法。
背景技術(shù)：
小油桐(Jatropha curcas L.)又名小桐子、麻瘋樹、膏桐等，屬大戟科 (Euphorbiaceae)麻風樹屬(Jatropha)多年生灌木或小喬木，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地 區(qū)，是一種多用途的樹種，在生物柴油、醫(yī)藥開發(fā)、生物農(nóng)藥和肥料等方面具有良好地應用 前景。其種子含油率一般在30 40%，是目前國際上公認的最具發(fā)展?jié)摿Φ哪茉粗参镏?一。但小油桐目前在世界各地種植的產(chǎn)量普遍太低，無法滿足生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展對原料的 大量需求。由于木本植物的世代周期較長，采用常規(guī)的育種技術(shù)難以在較短的時間內(nèi)選育 出高產(chǎn)的新品種，因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高小油桐的產(chǎn)量就具有重要的現(xiàn)實意義。近幾年來，國內(nèi)外對小油桐的遺傳轉(zhuǎn)化進行了初步的研究，雖然已可以通過小油 桐多種外植體，如真葉、葉柄、子葉、下胚軸和節(jié)等獲得小油桐的再生植株，但這些再生體系 仍未能轉(zhuǎn)變?yōu)楦咝У霓D(zhuǎn)化方法。Li 等(2008，Plant CellTissue and Organ Culture,92 173-181)以子葉作為外植體通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法，用除草劑草銨膦作為篩選試劑首 次獲得了轉(zhuǎn)基因小油桐，但轉(zhuǎn)化效率不高。He等(2009，Silvae Genetica，58 :123_128)和 Mazumdar 等(2010，South African Journal of Botany, 76 :337_344)嘗試用硫酸卡那霉 素禾口潮霉素(Trivedi et al. , 2009, International Journal of Agriculture Sciencesl 11-20)作為篩選試劑，但只獲得了抗性的愈傷，無再生的轉(zhuǎn)基因植株。最近，Purkayastha 等(2010，Biologia Plantarum, 54 13-20)用基因槍的方法也獲得了再生的轉(zhuǎn)基因植株。 但基因槍轟擊存在一些問題，如外源基因往往是多拷貝隨機整合到受體基因組中，可能發(fā) 生多種方式的重排，易造成轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，產(chǎn)生嵌合體等。農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn) 化方法是外源基因自然轉(zhuǎn)移過程，外源基因能有效地整合到植物細胞染色體上，且大多數(shù) 是單一位點整合，遺傳穩(wěn)定性較好。探索一種既能利用農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)點 又能提高小油桐轉(zhuǎn)化效率的方法，對小油桐的轉(zhuǎn)基因研究將起到很大的促進作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有小油桐轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不足，提供一種以小油桐成熟種 子的子葉為轉(zhuǎn)化受體、通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法獲得小油桐轉(zhuǎn)基因植株的方法。該方法 采用含有PCAMBIA 2301質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小油桐子葉，獲得轉(zhuǎn)基因植株，為生產(chǎn)上轉(zhuǎn)化其 他目的基因、獲得轉(zhuǎn)基因的小油桐優(yōu)良株系提供有效的方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。除非另有說明，本發(fā)明所采用的百分數(shù)均為重量百分數(shù)?！N農(nóng)桿菌介導的小油桐基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于以小油桐成熟種子的子葉 切除其基部的1/3 1/4后的材料作為農(nóng)桿菌感染的受體，轉(zhuǎn)化受體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后先接種在無篩選劑的培養(yǎng)基上進行愈傷誘導培養(yǎng)4周后，再繼代到選擇培養(yǎng)基上篩選抗性 芽，以硫酸卡那霉素作為篩選劑，通過篩選獲得抗性芽，繼代培養(yǎng)獲得抗性植株，經(jīng)分子檢 測，獲得轉(zhuǎn)基因小油桐植株。一種農(nóng)桿菌介導的小油桐基因轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟1、種子滅菌和外植體準備取小油桐成熟的種子，剝?nèi)ネ夥N皮，置無菌水中浸泡10 12小時后用75%的酒精 滅菌30秒，無菌水沖洗2 3次，然后用0. 8% 1. 0%次氯酸鈉溶液處理10分鐘，無菌水 沖洗3 4次，放置在無菌濾紙上除去多余的水分；取出胚，切除胚軸端1/3 1/4長度的 子葉，剩余子葉部分作為外植體備用；2、外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化挑取含有pCAMBIA 2301質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單克隆于含有50mg/L卡那霉素和25mg/L 鏈霉素的YEP液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，在28°C下200rpm振蕩培養(yǎng)12小時，轉(zhuǎn)接并二次 活化農(nóng)桿菌，菌液濃度至0D6(K1 = 0. 4 0. 8，在4°C下4000rpm離心5分鐘收集菌體，棄上 清，用無菌液體MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮菌體至0D_ = 0.4待用；取制備好的子葉外植體置上述農(nóng)桿菌菌液中，在28°C，150 200rpm搖床振蕩培 養(yǎng)20分鐘，將浸染過的子葉外植體置無菌的濾紙上吸去多余的菌液，接種在共培養(yǎng)培養(yǎng)基 MS-Jcl上暗培養(yǎng)3天；所述的共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS-Jcl包括下述組份MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基附加6-BA 3mg/L，IBA 0. 01mg/L，蔗糖 30g/L 和瓊脂 7g/L，pH5. 8 ；3、外植體的愈傷誘導培養(yǎng)共培養(yǎng)后的外植體材料用液體抑菌培養(yǎng)基MS-Jcl+500mg/L頭孢霉素，洗去多余 的菌，于濾紙上吸干材料表面的的液體，接種在不含篩選劑的含300mg/L頭孢霉素的固體 MS-Jcl抑菌培養(yǎng)基上，在12h光照/12h黑暗、溫度為26士2°C條件下進行愈傷誘導培養(yǎng)4 周；4、抗性芽的篩選愈傷誘導培養(yǎng)2 4周后，將培養(yǎng)材料繼代至篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)1 3 周后將在子葉基部生長出抗性芽；所述的篩選培養(yǎng)基包括下述組份MS-Jcl+300mg/L頭孢 霉素+15 25mg/L硫酸卡那霉素；5、抗性芽的生根抗性芽長至1. 5 2cm高時，從愈傷塊上切下，轉(zhuǎn)接至生根誘導培養(yǎng)基上誘導生 根，所述的生根誘導培養(yǎng)基RIM包括下述組份1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，IBA0. 1 0. 2mg/L, NAA 0. 1 0. 2mg/L，頭孢霉素100mg/L，硫酸卡那霉素20mg/L和蔗糖1. 0% ；6、轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學方法鑒定取所獲得的抗性再生植株的葉片，采用PCR和Southern雜交等分子生物學方法進 行轉(zhuǎn)入基因的檢測，或進行轉(zhuǎn)入基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物活性檢測。其中，所述的各種植物培養(yǎng)基在制備時，均調(diào)pH至5. 8，120°C高壓滅菌20min，當 培養(yǎng)基溫度冷至40 50°C時，再添加頭孢霉素或硫酸卡那霉素，混勻分裝后備用。本發(fā)明與現(xiàn)有的小油桐轉(zhuǎn)化方法相比，在轉(zhuǎn)化受體、轉(zhuǎn)化程序和周期以及轉(zhuǎn)化效 率等方面都具有明顯的優(yōu)勢，具體表現(xiàn)在1轉(zhuǎn)化受體再生芽能力強
小油桐的多個器官作為外植體進性愈傷誘導都相對較容易，但誘導出的愈傷組織 較難分化出芽或芽的分化率不高，從而限制了小油桐的遺傳轉(zhuǎn)化效率。小油桐子葉具有較 強的再生芽的能力，特別是在其基部。本發(fā)明所采用的轉(zhuǎn)化受體為成熟種子的子葉，在其基 部切出傷口用于農(nóng)桿菌浸染，可獲得較高的再生芽分化率。2簡化了轉(zhuǎn)化程序，縮短了轉(zhuǎn)化周期與現(xiàn)有的農(nóng)桿菌介導法相比，本發(fā)明的方法是經(jīng)過較短時間的愈傷誘導就會有芽 的分化，并再生出抗性芽，簡化了遺傳轉(zhuǎn)化的程序，縮短了轉(zhuǎn)化周期，三至四個月就可獲得 轉(zhuǎn)基因小油桐。3轉(zhuǎn)化效率大大提高通過目的基因的PCR和Southern雜交等分子檢測，以及⑶S活性染色結(jié)果表明， 采用本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)基因小油桐的誘導率可達30. 8%。


圖1為本發(fā)明以小油桐成熟種子的子葉為外植體采用農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法獲 得轉(zhuǎn)基因植株的過程以及轉(zhuǎn)基因小油桐的GUS活性檢測圖。其中A.成熟種子的子葉和待 轉(zhuǎn)化的子葉外植體；B.子葉外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；C.在不含篩選劑的抑菌培養(yǎng)基上誘導 4周產(chǎn)生不定芽；D和E.在含硫酸卡那霉素篩選培養(yǎng)基上生長出的抗性芽；F.抗性植株在 生根培養(yǎng)基上誘導生根；G.非轉(zhuǎn)化植株葉片的GUS染色；H和I.轉(zhuǎn)基因植株葉片的GUS染 色。A-F 比例尺:1cm ；G-I 比例尺200 u m.圖2為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因小油桐的分子檢測圖。其中A. GUS基因片段(355bp)的PCR檢測；B. NPTII基因片段(380bp)的PCR檢 測；M, lkb的DNA標記；泳道1，陽性對照(pCAMBIA2301質(zhì)粒)；泳道2，陰性對照(非轉(zhuǎn)基 因植株)；泳道3-15，不同的轉(zhuǎn)基因小油桐植株；C和D. 5微克的基因組DNA被內(nèi)切酶EcoRI 消化、電泳分離后的Southern雜交分析；圖C和D泳道1為陽性對照(pCAMBIA2301質(zhì)粒)； 圖C和D泳道2為陰性對照(非轉(zhuǎn)基因植株)；圖C泳道2-4和圖D泳道3-7為不同的轉(zhuǎn) 基因小油桐植株。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步地詳細說明，但它們并非是對本發(fā)明的 限定。實施例1取小油桐成熟的種子，剝?nèi)ネ夥N皮，置無菌水中浸泡10小時后用75%的酒精滅菌 30秒，無菌水沖洗2 3次，然后用1. 0%次氯酸鈉溶液處理10分鐘，無菌水沖洗3 4次， 放置在無菌濾紙上除去多余的水分；用無菌的鑷子和解剖刀剝開胚乳，取出胚，切除胚軸端 1/3 1/4長度的子葉，剩余子葉部分作為轉(zhuǎn)化受體備用(圖1A)。挑取含pCAMBIA 2301質(zhì)粒的LB4404農(nóng)桿菌單克隆于含有50mg/L硫酸卡那霉素 和25mg/L鏈霉素的YEP液體培養(yǎng)基中進行活化，28°C 200rpm振蕩培養(yǎng)12小時，轉(zhuǎn)接并二 次活化農(nóng)桿菌菌液濃度至0D, = 0. 4，4°C 4000rpm離心5分鐘收集菌體，棄上清用無菌液 體MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮菌體至0D_ = 0.4待用。
將制備好的轉(zhuǎn)化受體置上述農(nóng)桿菌菌液中，28°C 200rpm搖床振蕩培養(yǎng)20分鐘， 將浸染過的子葉置無菌的濾紙上吸去多余的菌液后，接種在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3天 (圖1B)。共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS-Jcl組成:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基附力口 6-BA 3mg/L, IBA 0. 01mg/L，蔗糖 30g/L 和瓊脂 7g/L，pH5. 8。共培養(yǎng)后的材料用液體抑菌培養(yǎng)基(MS-Jcl+500mg/L頭孢霉素)洗去多余的菌， 于濾紙上吸干材料表面的液體，接種在不含篩選劑的含300mg/L頭孢霉素的固體MS-Jcl抑 菌培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)進行不定芽的誘導4周(12h光照/12h黑暗、溫度26士2°C )。培養(yǎng)4周后，子葉基部的切點位置便形成少量的愈傷組織和萌出的芽點(圖1C)， 將上述材料繼代至含硫酸卡那霉素的篩選培養(yǎng)基(MS-Jcl+300mg/L頭孢霉素+20mg/L硫酸 卡那霉素)上培養(yǎng)，獲得抗性芽(圖1D和E)?？剐匝块L至1. 5 2cm高時便可從愈傷塊上切下，轉(zhuǎn)接至生根誘導培養(yǎng)基上誘導 生根(圖1F)。生根誘導培養(yǎng)基RIM組成1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加IBA 0. 2mg/L,NAA 0. lmg/ L，頭孢霉素100mg/L，硫酸卡那霉素20mg/L，蔗糖1. 0%。取篩選出的抗性小桐子苗的葉片進行⑶S基因和NPT II基因的PCR以及⑶S基 因的Southern雜交檢測，證明目的基因有效地整合到小油桐基因組中(圖2A-D)。對陽性 株系的葉片進一步進行GUS活性染色，轉(zhuǎn)基因植株也表現(xiàn)出GUS活性(圖1G-I)，轉(zhuǎn)基因小 油桐的誘導率可達30.8%。實施例2重復實施例1，有以下不同點愈傷誘導培養(yǎng)的時間為3周，然后繼代到含硫酸卡 那霉素的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)。實施例3重復實施例1，有以下不同點愈傷誘導培養(yǎng)的時間為2周，然后繼代到含硫酸卡 那霉素的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)。實施例4重復實施例1，有以下不同點篩選培養(yǎng)基中硫酸卡那霉素濃度為15mg/L。實施例5重復實施例1，有以下不同點篩選培養(yǎng)基中硫酸卡那霉素濃度為25mg/L。
權(quán)利要求
一種農(nóng)桿菌介導的小油桐基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于以小油桐成熟種子的子葉切除其基部的1/3～1/4后的材料作為農(nóng)桿菌感染的受體，轉(zhuǎn)化受體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后先接種在無篩選劑的培養(yǎng)基上進行愈傷誘導培養(yǎng)4周后，再繼代到選擇培養(yǎng)基上篩選抗性芽，以硫酸卡那霉素作為篩選劑，通過篩選獲得抗性芽，繼代培養(yǎng)獲得抗性植株，經(jīng)分子檢測，獲得轉(zhuǎn)基因小油桐植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導的小油桐基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于具體包括以 下步驟(1)種子滅菌和外植體準備取小油桐成熟的種子，剝?nèi)ネ夥N皮，置無菌水中浸泡10 12小時后用75%的酒精滅菌 30秒，無菌水沖洗2 3次，然后用0. 8% 1. 0%次氯酸鈉溶液處理10分鐘，無菌水沖洗 3 4次，放置在無菌濾紙上除去多余的水分；取出胚，切除胚軸端1/3 1/4長度的子葉， 剩余子葉部分作為外植體備用；(2)外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化挑取含有pCAMBIA 2301質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單克隆于含有50mg/L卡那霉素和25mg/L鏈霉 素的YEP液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，在28°C下200rpm振蕩培養(yǎng)12小時，轉(zhuǎn)接并二次活化 農(nóng)桿菌，菌液濃度至OD6tltl = 0. 4 0. 8，在4°C下4000rpm離心5分鐘收集菌體，棄上清，用 無菌液體MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮菌體至0D_ = 0.4待用；取制備好的子葉外植體置上述農(nóng)桿菌菌液中，在28°C，150 200rpm搖床振蕩培養(yǎng) 20分鐘，將浸染過的子葉外植體置無菌的濾紙上吸去多余的菌液，接種在共培養(yǎng)培養(yǎng)基 MS-Jcl上暗培養(yǎng)3天；所述的共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS-Jcl包括下述組份MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基附加6-BA 3mg/L，IBA 0. 01mg/L，蔗糖 30g/L 和瓊脂 7g/L，ρΗ5· 8 ；(3)外植體的愈傷誘導培養(yǎng)共培養(yǎng)后的外植體材料用液體抑菌培養(yǎng)基MS-Jcl+500mg/L頭孢霉素，洗去多余的菌， 于濾紙上吸干材料表面的的液體，接種在不含篩選劑的含300mg/L頭孢霉素的固體MS-Jcl 抑菌培養(yǎng)基上，在12h光照/12h黑暗、溫度為26士2°C條件下進行愈傷誘導培養(yǎng)4周；(4)抗性芽的篩選愈傷誘導培養(yǎng)2 4周后，將培養(yǎng)材料繼代至篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)1 3周后 將在子葉基部生長出抗性芽；所述的篩選培養(yǎng)基包括下述組份MS-Jcl+300mg/L頭孢霉素 +15 25mg/L硫酸卡那霉素；(5)抗性芽的生根抗性芽長至1. 5 2cm高時，從愈傷塊上切下，轉(zhuǎn)接至生根誘導培養(yǎng)基上誘導生根，所 述的生根誘導培養(yǎng)基RIM包括下述組份1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，ΙΒΑ0. 1 0. 2mg/L,NAA 0. 1 0. 2mg/L，頭孢霉素100mg/L，硫酸卡那霉素20mg/L和蔗糖1. 0% ；(6)轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學方法鑒定取所獲得的抗性再生植株的葉片，采用PCR和Southern雜交等分子生物學方法進行轉(zhuǎn) 入基因的檢測，或進行轉(zhuǎn)入基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物活性檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的農(nóng)桿菌介導的小油桐基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的各 種植物培養(yǎng)基在制備時，均調(diào)PH至5. 8，120°C高壓滅菌20min，當培養(yǎng)基溫度冷至40 50°C時，再添加頭孢霉素或硫酸卡那霉素，混勻分裝后備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種農(nóng)桿菌介導的小油桐基因轉(zhuǎn)化方法。以小油桐成熟種子的子葉切除其基部的1/3～1/4后的材料作為農(nóng)桿菌感染的受體，轉(zhuǎn)化受體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后先接種在無篩選劑的培養(yǎng)基上進行愈傷誘導培養(yǎng)4周后，再繼代到選擇培養(yǎng)基上篩選抗性芽，以硫酸卡那霉素作為篩選劑，通過篩選獲得抗性芽，繼代培養(yǎng)獲得抗性植株，經(jīng)分子檢測，獲得轉(zhuǎn)基因小油桐植株。本發(fā)明與現(xiàn)有的小油桐轉(zhuǎn)化方法相比，可獲得較高的再生芽誘導率，簡化了轉(zhuǎn)化程序，縮短了轉(zhuǎn)化周期，轉(zhuǎn)化效率大大提高，具有良好的應用前景。
文檔編號A01H5/00GK101948867SQ20101025241
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者付乾堂, 徐增富, 潘竟麗 申請人:中國科學院西雙版納熱帶植物園